Summary
Non distruttivo di visualizzazione volume può essere raggiunto solo con tecniche tomografiche, di cui il più efficiente è la tomografia a raggi X micro computerizzata (TAC).
Abstract
Non distruttivo di visualizzazione volume può essere raggiunto solo con tecniche tomografiche, di cui il più efficiente è la tomografia a raggi X micro computerizzata (μCT).
Ad alta risoluzione μCT è molto versatile ma accurato (1-2 micron di risoluzione) tecnica per l'esame 3D di campioni biologici ex-vivo 1, 2. A differenza degli elettroni tomografia, la μCT consente l'esame di fino a 4 cm di spessore dei campioni. Questa tecnica richiede solo poche ore di misura rispetto alle settimane in istologia. Inoltre, μCT non si basa su modelli 2D stereologic, così possono integrare e in alcuni casi può anche sostituire i metodi istologici 3, 4, che sono sia in termini di tempo e distruttivo. Condizionamento del campione e il posizionamento in μCT è semplice e non necessita di alto vuoto o di basse temperature, che possa ledere la struttura. Il campione viene posizionato e ruotato di 180 ° o 360 ° tra un microfocused sorgente di raggi X ed un rivelatore, che include uno scintillatore e una fotocamera CCD accurata, per ogni angolo è preso una immagine 2D, e poi l'intero volume viene ricostruita utilizzando uno dei diversi algoritmi disponibili 5-7. La risoluzione 3D aumenta con il diminuire del passo di rotazione. Il protocollo video presenti mostra le fasi salienti della preparazione, immobilizzazione e posizionamento del campione, seguita da immagini ad alta risoluzione.
Protocol
1. Preparazione del campione
- Dopo l'estrazione del tessuto che deve essere esaminato, i tessuti mineralizzati possono essere posizionati nello strumento e immagine. Per l'immagine quella del femore del mouse dovrebbe seguire i seguenti passi:
- Rimuovere leg post mortem da un embrione C57/Bl6 postceutus 18,5 giorni (E18.5).
- Sigillare la parte più stretta di un puntale di polistirolo (20-200 microlitri) con resina epossidica o altro collante, e riempire la punta con il tampone di lavoro (PBS o altro).
- Montare saldamente la gamba nella punta e sigillare l'altra estremità con il foglio di parafilm.
- Posizionare la punta della pipetta in un supporto adatto e seguire il protocollo dal capitolo 3. Per visualizzare il femore dall'embrione gamba del mouse, lo strumento si trova a 40 KV e 200 μA. Per 8μ risoluzione 1000 immagini di proiezione con ingrandimento 4x devono essere acquisite.
- Tessuti non mineralizzati devono essere inizialmente fissate e colorate in modo da aumentare la radiografia attenuazione del tessuto di interesse, utilizzando uno dei numerosi protocolli disponibili 8,9. Per i polmoni di ratto e campioni simili, il protocollo di preparazione è la seguente:
- Impianto Orthotopical di non carcinoma polmonare a piccole cellule (NSCLC) NCI-H460 sui polmoni di ratto nudo
- Noduli cancro ai polmoni iniziano ad essere rilevabili 4 settimane dall'impianto
- Il sacrificio del ratto e subito in infusione con soluzione fisiologica mescolata con eparina
- Iniettare con una soluzione diluita di Microfil (Flowtech), (2 ml di soluzione composta, 3 ml di diluente e 0,3 ml di induritore) nel ventricolo sinistro di macchiare la circolazione bronchiale
- Estrarre i polmoni e il cuore del ratto
- Immobilizzare il campione (si veda il capitolo 2 del protocollo) inserendo saldamente in un tubo di plastica da 50 ml di prova
- Creare un atmosfera satura di etanolo mettendo sul fondo della provetta un panno inumidito in etanolo
- Colla o avvitare il tubo in un possessore dello strumento
- Procedere con l'impostazione dei parametri di imaging (capitolo 3). Per l'imaging completo dei polmoni ratto la fonte è fissato a 40KV e 100 μA. Al fine di raggiungere la risoluzione 16μ si deve acquisire 2500 immagini di proiezione con un ingrandimento di 0.5x.
2. Esempio di immobilizzazione
Ad alta risoluzione, è importante evitare qualsiasi cambiamento nella posizione del campione durante la misura. Per questo, il campione è saldamente fissata in un recipiente di plastica che si adatta la sua dimensione. Puntali polistirolo, plastica pipette Pasteur o appositamente costruite titolari di plastica vengono utilizzate al riguardo. A seconda delle esigenze sperimentali, il campione può essere esaminato in aria o immersi in soluzioni di etanolo o buffer. Immobilizzazione tipici e posizionamento finale della gamba del embrione di topo nello strumento è mostrata in Figura 1.
Figura 1. Posizionamento finale della gamba embrionali di topo nello strumento micro-CT.
3. L'impostazione dei parametri di acquisizione: radiografia di tensione e corrente, CCD tempo di esposizione
- Inserito in un supporto, il campione viene messo in fase di rotazione dello strumento
- Una prima radiografia immagine è presa con la tensione e la corrente arbitrariamente.
- Se l'immagine è troppo scura, si dovrebbe aumentare il numero di fotoni prima, in modo da aumentare un po 'la corrente. Se questo non è sufficiente, si dovrebbe aumentare leggermente l'energia del fotoni di raggi X, cioè la tensione sul tubo radiogeno.
- Se l'immagine è troppo luminosa, si dovrebbe prima diminuire la tensione, poi la corrente.
- La luminosità dell'immagine può essere aumentata con binning. Binning di 1 tiene conto della intensità di ogni pixel dell'immagine, mentre binning di 2 prende la somma di ogni matrice di pixel 2x2. L'immagine sarà di circa 4 volte più luminoso in caso di binning 1, ma avrà la metà della risoluzione.
- Dopo aver impostato la luminosità ottimale, si deve ottimizzare il tempo di esposizione della fotocamera per il miglior compromesso tra contrasto da un lato e una durata ragionevole del esperimento su un altro lato.
- Il contrasto delle immagini, in particolare dei campioni a basso assorbimento, può essere migliorata utilizzando i filtri, che riducono il flusso di fotoni, soprattutto quella dei fotoni di energia inferiore.
4. Esempio di posizionamento
- Scegliete l'ingrandimento di lavoro. Scelte possibili sono 0.5x, 4x, 10x, 20x e 40x. Il campo visivo si riduce con l'aumento di ingrandimento.
- Ottenere la risoluzione ottimale e campo visivo impostando le distanze tra la sorgente di raggi X e il campione e tra il campione e il rivelatore. Aumentare la fonte a distanza campione riduce il campo visivo e aumenta la risoluzione. Campione di distanza rilevatore ha l'effetto opposto.
Tutto il campo per essere visualizzati in 3D dovrebbe essere presente nellaimmagine di proiezione a tutti gli angoli. Si dovrebbe controllare questo ruotando il campione a diverse angolazioni e portando il campione il più vicino possibile all'asse di rotazione. Per questo, si dovrebbe seguire la seguente procedura:
- Scattare una foto a 0 gradi, e quindi ruotare il campione a -20 gradi. Se il volume desiderato è spostato lateralmente, si dovrebbe correggere la sua posizione, riposizionando l'asse di rotazione.
- Dopo la correzione, il campione deve essere ruotato in un altro angolo e la posizione corretta di nuovo, fino a quando il campo di interesse è dentro l'immagine a tutti gli angoli da -90 a 90 gradi.
5. Tomografia ad alta risoluzione
- Durante la misurazione, il campione viene ruotato di un piccolo angolo alla volta e ad ogni angolo di proiezione una immagine è presa. Il numero totale di immagini è sempre un compromesso tra la risoluzione desiderata da un lato e il tempo della misura e la dimensione del file da un altro lato. Come mostrato nella figura 2, ogni singola proiezione comprende tutte le sezioni del campione sovrapposti uno sull'altro, e quindi non può rivelare la struttura 3D del campione.
Figura 2. Proiezione immagini del polmone di ratto a 0 ° (A), 45 ° (B) e 90 ° (C), angolo di rotazione.
- Solo dopo aver preso le immagini di proiezione almeno tra -90 e 90 gradi, si può procedere alla ricostruzione del volume di campione. Ricostruzione dura tra 10 minuti e 2 ore, a seconda del software utilizzato e del numero di proiezioni. Ancora una volta, la qualità finale delle immagini 3D è un compromesso tra la risoluzione desiderata e il tempo si vuole spendere e la dimensione del file risultante.
6. Immagine scala di calibrazione
Il livello di pixel (valore) in una immagine ricostruita è unico per quell'immagine. Al fine di confrontare le due immagini diverse, una scala di intensità unica deve essere imposto su ogni immagine. Per questo
- Eseguire una tomografia con uno standard fantasma con le stesse condizioni sperimentali, come per il campione
- Ricalibrare l'immagine campione utilizzando i valori ottenuti per il fantasma. La scala più comune è la (o CT) Hounsfield scala. Per ingrandimento 4x il valore di fondo di 15.000 (per l'acqua o PBS) è stato sostituito con 0 e il valore massimo di 35.000 per l'osso è stato sostituito con il valore standard di Hounsfield 3000. Valori dei pixel altri il risultato di interpolazione lineare o estrapolazione sulla base di tali limiti.
7. Elaborazione delle immagini e analisi
Dopo aver ottenuto immagini ad alta risoluzione, si deve estrarre informazioni rilevanti, utilizzando software di analisi delle immagini. Il pacchetto software da utilizzare deve essere progettata per lavorare con file molto grandi (fino a 20GB).
8. Rappresentante Risultati
Una rappresentazione di un femore di un topo C57/Bl6 al giorno embrionale 18,5 (E18.5) - quattro giorni dopo l'avvio del processo di mineralizzazione è mostrato in Fig. 3. Gli strati di minerale sono ben visibili (bianco), mentre i tessuti molli non sono visibili in questa preparazione. Abbiamo preso 1000 immagini di proiezione con un ingrandimento lineare di 4x. La risoluzione finale è di 8 micron. Un'attenta analisi del volume rendering mostrato in Fig.1, mostra che la frazione di volume osseo (la frazione del volume osseo che è occupato da tessuto mineralizzato) è 0,18, e la densità minerale ossea è 723 mg / cm 3. Questi valori ci permettono di confrontare questa struttura con le ossa in altre fasi di sviluppo.
Figura 3. Rappresentazioni differenti di una immagine 3D di un embrione di topo femore. La trasversale (sezione) (A), la sagittale (medio-laterale), sezione (B) e uno snapshot del volume rendering (C) sono mostrati.
La Figura 4 mostra una immagine 3D dei polmoni di un topo nudo femminile (RNU), 12 settimane di età, impiantati ortotopicamente con i carcinoma polmonare a piccole cellule (NSCLC) NCI-H460. 2500 immagini di proiezione sono state scattate con un ingrandimento lineare di 0,5 x, garantendo una risoluzione finale di 16 micron. L'immagine mostra i vasi sanguigni Microfil macchiato (fino a 20 micron di diametro). L'analisi delle immagini mostra che 4 settimane dopo l'impianto, i noduli tumorali più sono formate. Essi coprono una frazione significativa del volume polmonare (17%). La maggior parte della colorazione polmonare è stato trovato nella aree periferiche dei tumori. Significativamente, come mostrato nella figura 4B, i vasi sanguigni diversi sono presenti anche all'interno della noduli, che coprono, secondo l'analisi preliminare circa il 3% del loro volume.
Figura 4. Immagine 3D di noduli tumorali in crescita in un topopolmonare. Un'istantanea del volume rendering (A) e una sezione del volume (B) sono mostrati. I noduli tumorali sono contrassegnate con frecce.
Movie 1. Rappresentazione volumetrica del femore del mouse nella Figura 1. Clicca qui per guardare il film.
Movie 2. Rappresentazione volumetrica dei polmoni di ratto in Figura 2. Clicca qui per guardare il film.
Movie 3. Sezioni seriali attraverso i polmoni. I noduli appaiono come aree grigie nella maggior parte delle fette. Clicca qui per guardare il film.
Discussion
C57/Bl6 del mouse al giorno embrionale 18,5 (E18.5) è quattro giorni dopo l'avvio del processo di mineralizzazione. A questo stadio di sviluppo, l'osso futuro è fatto di molti strati di osteoids mineralizzato, chiaramente visibile in figura 3. A questo punto, si dovrebbe sottolineare che i tessuti mineralizzati possono essere visualizzate a bassa risoluzione con strumenti diversi che richiedono un trattamento del campione di meno. Il protocollo attuale (e lo strumento di micro-CT utilizzato in esso) oltre a fornire una risoluzione più alta, offre la massima flessibilità per l'utente di scegliere i migliori parametri geometrici per la misurazione.
I risultati in Fig. 4 mostrano che nei modelli ortotopico cancro al polmone animale, umana non a piccole cellule cancro ai polmoni può indurre il reclutamento dei vasi sanguigni e neovascolarizzazione. Riteniamo che il tessuto polmonare non era né trasferito, né ha cambiato la sua forma durante la misurazione. L'utente deve prendere precauzioni particolari per evitare tali cambiamenti nel corso di una tomografia. Per alcuni campioni, in particolare per il tessuto più morbido, si deve costruire speciali supporti che immobilizzare perfettamente il campione durante la misura. Purtroppo la presenza di perdite elevate di mezzo di contrasto nei dintorni dei tumori impedito quantificazione attendibile dei vasi sanguigni periferici. Di conseguenza le immagini sono contaminate da qualche agente colorazione specialmente ai bordi, che è chiaramente presente nel film 2 e 3. Non abbiamo potuto evitare questo sversamento, ma le informazioni utili sul noduli tumorali, tra le loro dimensioni, la forma e la presenza di vasi sanguigni interna non è stata influenzata. Potremmo concludere con chiarezza che, almeno per la circolazione bronchiale che è stato studiato qui, flusso ematico periferico partecipa perfusione del tumore, con alcuni perfusione presente anche all'interno del tumore.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli studi sono stati condotti presso l'Irving Moskowitz e Cherna Centro di Nano e Bio-Nano Imaging presso il Weizmann Institute of Science.
Siamo grati a Orna Yeger per il suo aiuto nella progettazione e l'esecuzione di questo protocollo.
Materials
| For image acquisition we have used a MICRO XCT-400 microfocussed X-ray tomographic system produced by Xradia, Concord, USA. | |||
| Images were processed and analyzed using ImageJ (NIH, USA), Avizo (VSG, France) and MicroView (General Electric, USA) software packages. Any available image analysis software can be used instead |
References
- Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50, 2-13 (2010).
- Bauer, J. S., Link, T. M.
- Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Basle, M. F., Audran, M. Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT. J Bone Miner Res. 20, 1177-1184 (2005).
- Muller, R., Van Campenhout, H., Damme, B. V. an Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography. Bone. 23, 59-66 (1998).
- Mueller, K., Yagel, R., Wheller, J. J. Anti-Aliased 3D Cone-Beam Reconstruction Of Low-Contrast Objects With Algebraic Methods. IEEE Transactions on Medical Imaging. 18, 519-537 (1999).
- Kachelriess, M., Schaller, S., Kalender, W. A. Advanced single-slice rebinning in cone-beam spiral CT. Med Phys. 27, 754-772 (2000).
- Endo, M., Komatsu, S., Kandatsu, S., Yashiro, T., Baba, M. A combination-weighted Feldkamp-based reconstruction algorithm for cone-beam CT. Phys. Med. Biol. 51, 3953-3965 (2006).
- Marxen, M., Thornton, M. M., Chiarot, C. B., Klement, G., Koprivnikar, J., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med Phys. 31, 305-313 (2004).
- Plouraboué, F., Cloetens, P., Fonta, C., Steyer, A., Lauwers, F., Marc-Vergnes, J. P. X-ray high-resolution vascular network imaging. J Microsc. 215, 139-148 (2004).
