Summary
Não-destrutivos visualização volumétrica só pode ser alcançada através de técnicas de tomografia, dos quais o mais eficiente é o x-ray tomografia micro computadorizada (TC).
Abstract
Não-destrutivos visualização volumétrica só pode ser alcançada através de técnicas de tomografia, dos quais o mais eficiente é o x-ray tomografia computadorizada micro (μCT).
De alta resolução μCT é muito versátil e preciso técnica (1-2 mícrons de resolução) para exame em 3D de ex-vivo amostras biológicas 1, 2. Em oposição a tomografia eletrônica, o μCT permite o exame de até quatro centímetros de espessura amostras. Esta técnica requer horas apenas algumas das medidas em relação a semana em histologia. Além disso, μCT não depende de modelos 2D estereológico, portanto, podem complementar e, em alguns casos podem até mesmo substituir métodos histológicos 3, 4, que são tanto demorado e destrutivo. Condicionamento de amostras e posicionamento em μCT é simples e não requer alto vácuo ou baixas temperaturas, que pode afetar adversamente a estrutura. A amostra é posicionada e rotação de 180 ° ou 360 ° entre um microfocused fonte de raios-x e um detector, que inclui um cintilador e uma câmera CCD preciso, Para cada ângulo de uma imagem 2D é levado, em seguida, todo o volume é reconstruído usando uma dos algoritmos diferentes disponíveis 5-7. A resolução 3D aumenta com a diminuição do passo de rotação. O protocolo de vídeo atual mostra os principais passos na imobilização de preparação, e posicionamento da amostra seguido por imagem em alta resolução.
Protocol
1. Preparação de amostras
- Depois de extrair o tecido que está a ser examinado, tecidos mineralizados pode ser posicionado no instrumento e imagens. Para a imagem do fêmur um rato deve seguir os seguintes passos:
- Remover pós mortem perna de um embrião C57/Bl6 18,5 postceutus dias (E18.5).
- Selar a parte mais estreita de uma ponteira de poliestireno (2-20 mL) usando resina epóxi ou outra cola, e preencha a ponta com o buffer de trabalho (PBS ou outro).
- Encaixar bem a perna na ponta e selar o outro lado com a folha de parafilme.
- Coloque a ponta da pipeta em um suporte adequado e seguir o protocolo do capítulo 3. Para visualizar o fêmur da perna embrião de rato, o instrumento é definido 40 KV e 200 mA. Para 8μ resolução 1000 imagens de projeção com ampliação de 4x tem que ser adquirida.
- Não mineralizado tecidos têm de ser inicialmente fixado e corado, a fim de aumentar a atenuação de raios-X do tecido de interesse, usando um dos muitos protocolos disponíveis 8,9. Para os pulmões de ratos e amostras semelhantes, o protocolo de preparação é:
- Implantação Orthotopical de carcinoma do pulmão de não pequenas células (NSCLC) NCI-H460 em pulmões de ratos nua
- Nódulos de câncer de pulmão passam a ser detectáveis quatro semanas a partir da implantação
- Sacrificar a ratazana e infundi-la imediatamente com soro fisiológico misturado com heparina
- Injetá-lo com uma solução diluída de Microfil (Flowtech), (2 ml de solução composta, 3 ml de diluente e 0,3 ml de agente de cura) para o ventrículo esquerdo para manchar a circulação brônquica
- Extrair os pulmões eo coração do rato
- Imobilizar a amostra (ver capítulo 2 do protocolo) ajustando-o firmemente em um tubo de 50 ml de plástico teste
- Criar uma atmosfera saturada de etanol, colocando no fundo do tubo de um pano embebido em etanol
- Cola ou parafuso em um tubo do detentor do instrumento
- Prosseguir com a definição dos parâmetros de imagem (capítulo 3). Para a imagem completa dos pulmões de ratos a fonte é de 40KV e 100 mA. A fim de alcançar uma resolução 16μ tem de adquirir 2500 imagens de projeção com uma ampliação de 0.5x.
2. Imobilização amostra
Em alta resolução, é importante evitar qualquer mudança na posição da amostra durante a medição. Para isso, a amostra é firmemente fixada em um recipiente de plástico que se encaixa o seu tamanho. Dicas de poliestireno pipeta, pipetas Pasteur de plástico especialmente construídos ou titulares de plástico são usados a esse respeito. De acordo com os requisitos experimental, a amostra pode ser examinada no ar ou imersos em soluções de etanol ou tampão. Imobilização típicos e posicionamento final da perna do embrião de rato no instrumento é mostrado na Figura 1.
Figura 1. Posicionamento final da perna embrionárias de camundongos no instrumento CT micro.
3. Definição de parâmetros de aquisição: x-ray de tensão e corrente, tempo de exposição CCD
- Colocado em um suporte, a amostra é colocada na fase de rotação do instrumento
- Uma imagem de raio-x primeiro é tomado com a tensão ea corrente arbitrariamente definida.
- Se a imagem está muito escura, deve-se aumentar o número de fótons primeiro lugar, para aumentar um pouco a corrente. Se isso não for suficiente, deve-se aumentar ligeiramente a energia dos fótons de raios-x, ou seja, a tensão no tubo de raios-x.
- Se a imagem é muito brilhante, deve-se primeiro diminuir a tensão, então a corrente.
- O brilho da imagem pode ser aumentada por binning. Binning de 1 leva em conta a intensidade de cada pixel da imagem, enquanto que binning de 2 leva a soma de cada matriz de pixels 2x2. A imagem será de cerca de 4 vezes mais brilhante do que no caso de binning 1, mas terão metade da resolução.
- Depois de definir a luminosidade ideal, é preciso otimizar o tempo de exposição da câmara de compromisso entre o melhor contraste de um lado e uma duração razoável do experimento em outro lado.
- O contraste das imagens, especialmente das amostras de baixa absorção, pode ser melhorada por meio de filtros, que reduzem o fluxo de fótons, principalmente a dos fótons de energia mais baixos.
4. Posicionamento da amostra
- Escolha a ampliação de trabalho. Escolhas possíveis são 0.5x, 4x, 10x, 20x e 40x. O campo de visão diminui com a ampliação cada vez maior.
- Obter a melhor resolução e campo de visão, definindo as distâncias entre a fonte de raios-X ea amostra e entre a amostra eo detector. Aumentar a fonte de distância da amostra diminui o campo de visão e aumenta a resolução. Amostra com a distância detector tem o efeito oposto.
Todo o campo para ser visto em 3D deve estar presente noprojeção de imagem em todos os ângulos. Deve-se verificar esta girando a amostra em diferentes ângulos e por trazer a amostra o mais perto possível do eixo de rotação. Para isso, deve-se seguir os seguintes passos:
- Ter uma imagem a 0 graus, e depois girar a amostra a -20 graus. Se o volume desejado mudou lateralmente, deve-se corrigir a sua posição através do reposicionamento do eixo de rotação.
- Após a correção, a amostra deve ser rodado em outro ângulo e posição corrigida novamente, até que o campo de interesse está dentro da imagem em todos os ângulos de -90 a 90 graus.
5. Tomografia de alta resolução
- Durante a medição, a amostra é girada por um pequeno ângulo em um momento e em cada imagem de projeção um ângulo é tomada. O número total de imagens é sempre um compromisso entre a resolução desejada de um lado e no momento da medição e do tamanho do arquivo em outro lado. Como mostrado na Fig.2, cada única projeção inclui todas as fatias na amostra sobrepostas uma sobre a outra, e, portanto, não pode revelar a estrutura 3D da amostra.
Figura 2. Projeção de imagens do pulmão de ratos em 0 ° (A), 45 º (B) e 90 ° de ângulo de rotação (C).
- Só depois de tomar imagens de projeção, pelo menos, entre -90 e 90 graus, pode-se proceder à reconstrução do volume da amostra. Reconstrução leva entre 10 minutos e 2 horas, dependendo do software utilizado e do número de projeções. Mais uma vez, a qualidade final da imagem em 3D é um compromisso entre a resolução desejada e do tempo que se quer gastar e do tamanho do arquivo resultante.
6. Calibração da escala de imagem
O nível de pixel (valor) em uma imagem reconstruída é exclusivo para essa imagem. A fim de comparar duas imagens diferentes, uma escala de intensidade única tem de ser imposta em cada imagem. Para este
- Executar uma tomografia com um fantasma padrão, utilizando as mesmas condições experimentais, como para a amostra
- Recalibrar a imagem de exemplo usando os valores obtidos para o fantasma. A escala mais comum é a escala Hounsfield (ou CT). Para ampliação de 4x o valor de fundo de 15 mil (para água ou PBS) foi substituído por 0 eo valor máximo de 35.000 para o osso foi substituído com o valor padrão de Hounsfield 3000. Valores de pixel outras resultaram de interpolação linear ou extrapolação com base nesses limites.
7. Processamento de imagem e análise
Depois de obter imagens de alta resolução, deve-se extrair informações relevantes usando software de análise de imagem. O pacote de software a ser utilizado tem que ser projetado para trabalhar com arquivos muito grandes (até 20Gb).
8. Resultados representante
A representação de um fémur de um camundongo C57/Bl6 embrionárias no dia 18.5 (E18.5) - quatro dias após o início do processo de mineralização é mostrado na Figura 3. As camadas minerais são claramente visíveis (branco), enquanto os tecidos moles não são visíveis nesta preparação. Pegamos 1000 imagens de projeção com uma ampliação linear de 4x. A resolução final é de 8 microns. Uma análise cuidadosa da prestação de volume mostrado na Fig.1, mostra que a fração de volume ósseo (a fração do volume de osso que é ocupado por tecido mineralizado) é de 0,18, ea densidade mineral óssea é 723 mg / cm 3. Esses valores permitem-nos comparar essa estrutura com ossos em outros estágios de desenvolvimento.
Figura 3. Representações diferentes de uma imagem 3D de um embrião fêmur mouse. A (corte transversal) transversal (A), a seção (medio-lateral) sagital (B) e um instantâneo do volume renderização (C) são mostrados.
A Figura 4 mostra uma imagem 3D do pulmão de um rato fêmea nude (RNU), 12 semanas de idade, implantado ortotopicamente com carcinoma do pulmão de não pequenas células (NSCLC) NCI-H460. 2500 imagens de projeção foram tiradas com uma ampliação linear de 0.5x, garantindo uma resolução final de 16 microns. A imagem mostra a Microfil vasos sanguíneos corados (até 20 mícrons de diâmetro). A análise das imagens mostra que quatro semanas após o implante, os nódulos de câncer múltiplas são formadas. Eles estão cobrindo uma fração significativa do volume de pulmão (17%). A maioria dos coloração pulmonar foi encontrada em áreas periféricas dos tumores. Significativamente, como mostrado na fig 4B, diversos vasos sangüíneos estão presentes também no interior do nódulo, que abrange, de acordo com análise preliminar cerca de 3% do seu volume.
Figura 4. Imagem 3D de nódulos de câncer que cresce em um ratopulmão. Um instantâneo da prestação volume (A) e uma seção através do volume (B) são mostrados. Os nódulos de câncer são marcadas com setas.
Filme 1. Renderização Volume do fêmur do rato na Figura 1. Clique aqui para assistir o filme.
Filme 2. Renderização de volume dos pulmões de ratos na Figura 2. Clique aqui para assistir o filme.
Filme 3. Seções Serial através dos pulmões. Os nódulos aparecem como áreas cinzentas na maioria das fatias. Clique aqui para assistir o filme.
Discussion
C57/Bl6 mouse no dia embrionário 18.5 (E18.5) é de quatro dias após o início do processo de mineralização. Nesta fase de desenvolvimento, o osso futuro é feito de muitas camadas de osteóide mineralizado, claramente visto na Fig. 3. Neste ponto, deve-se ressaltar que tecidos mineralizados pode ser visualizado na resolução mais baixa com instrumentos diferentes, que exigem um tratamento menos amostra. O presente protocolo (e as micro instrumento CT usado nele) além de proporcionar maior resolução, oferece a máxima flexibilidade para o usuário a escolher os melhores parâmetros geométricos para a medição.
Resultados na Fig. 4 mostram que, no pulmão ortotópico modelos animais de câncer humano, câncer de pulmão não pequenas células podem induzir o recrutamento de vasos sanguíneos e neovascularização. Consideramos que o tecido pulmonar não era nem se movia, nem tem sua forma alterada durante a medição. O usuário deve tomar precauções especiais para evitar tais mudanças durante uma tomografia. Para algumas amostras, especialmente para os tecidos mais moles, um tem de construir aparelhos especiais de holding que imobilizam perfeitamente a amostra durante a medição. Infelizmente, a presença de vazamentos elevados de agente de contraste nas imediações dos tumores impedido quantificação confiável dos vasos sanguíneos periféricos. Como resultado as imagens estão contaminados por algum agente de coloração especialmente nas bordas, que está claramente presente nos filmes 2 e 3. Nós não poderíamos evitar esse vazamento, mas as informações úteis sobre os nódulos de câncer, incluindo seu tamanho, forma e presença de vasos sanguíneos internos não foi afetada. Poderíamos concluir claramente que, pelo menos, para a circulação brônquica, que foi aqui estudado, a oferta de sangue periférico participa de perfusão do tumor, com cerca de perfusão presente também no interior do tumor.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os estudos foram conduzidos no Irving Moskowitz e Cherna Centro de Nano e Nano Bio-Imagem no Instituto Weizmann de Ciência.
Somos gratos a Orna Yeger por sua ajuda na concepção e execução deste protocolo.
Materials
| For image acquisition we have used a MICRO XCT-400 microfocussed X-ray tomographic system produced by Xradia, Concord, USA. | |||
| Images were processed and analyzed using ImageJ (NIH, USA), Avizo (VSG, France) and MicroView (General Electric, USA) software packages. Any available image analysis software can be used instead |
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