Summary
非破坏性的量可视化可以实现，只有通过层析成像技术，其中最有效的是X射线微计算机断层扫描（CT）。
Abstract
非破坏性的量可视化可以实现，只有通过层析成像技术，其中最有效的是X射线微计算机断层扫描（μCT）。
高分辨率μCT是一个非常灵活而又准确的的3D考试前体内的生物样品 1，2（1-2微米分辨率）技术。相对于电子断层扫描，μCT允许4厘米厚的样品的检查。这种技术只需要测量的几个小时相比，在组织学周。此外，μCT不依赖于2D视学模型，从而可以补充，在某些情况下甚至可以取代组织学方法，3，4，这是既费时和破坏性。 μCT样品调节和定位非常简单，不需要高真空或极低的温度，这可能会产生不利影响的结构。样品定位和旋转180 °或360 °之间的一个microfocused的X射线源和探测器，其中包括一个闪烁和准确的CCD相机，对于每一个二维图像的角度，然后使用一个重建整个卷不同的可用算法5-7。 3D分辨率的增加与减少旋转步。本视频协议显示在高分辨率成像样品的准备，固定和定位的主要步骤。
Protocol
1。样品制备
- 矿化组织提取组织进行审查后，可放置在仪器和影像。形象鼠标股骨应遵循以下步骤：
- 从C57/Bl6胚胎18.5天postceutus（E18.5），取出后验尸腿。
- 密封聚苯乙烯枪头采用环氧树脂或其他胶水（20-200μL）较窄的一端，并填写工作缓冲液（PBS或其它）的提示。
- 适合紧到尖端的腿和密封封口膜表的另一端。
- 枪头放入一个合适的人，并按照该协议第3章。对于可视化的鼠标腿胚胎股骨，该仪器是集40千伏和200μA。对于8μ分辨率1000 4倍的放大倍率的投影图像被收购。
- 非矿化组织已被初步固定，染色，以增加使用的许多8,9可用的协议之一的利益组织X射线衰减。对大鼠肺组织和类似的样品，准备协议是：
- Orthotopical植入裸大鼠肺非小细胞肺癌（NSCLC）NCI - H460
- 肺癌结节开始被检出植入4周
- 牺牲老鼠，并立即用肝素生理盐水溶液混合，注入
- 注入左心室染色的支气管循环与稀释液，一个Microfil（Flowtech）（2毫升的复合溶液，3毫升稀释剂和固化剂0.3毫升）
- 提取物对大鼠的肺和心脏
- 装修成50毫升塑料试管，它紧紧地固定样本（见议定书第2章）
- 创建布乙醇阻尼管的底部放置一个饱和的乙醇气氛
- 胶水或螺丝管，在仪器的持有人
- 继续设置成像参数（第3章）。大鼠肺的完整影像源是设置在40KV和100μA。为了达到16μ的决议之一，已收购的0.5倍的放大倍率2500投影图像。
2。样品固定
分辨率高，重要的是要避免在测量过程中的样品位置的任何改变。对于这一点，样品是紧紧固定到一个适合其规模的塑料收件人。聚苯乙烯枪头，塑料巴氏吸管或特制的塑料持有人在这方面使用。根据实验要求，可检查样品在空气中，或沉浸在乙醇或缓冲溶液。典型的固定和最终定位仪器中的小鼠胚胎的腿是在图1所示。
图1。最后定位在小鼠胚胎显微CT仪器腿。
3。设置采集参数：X -射线电压和电流，CCD曝光时间
- 样品放入持有人，把仪器的旋转舞台
- 第一个X -射线图像拍摄与电压和电流的任意设置。
- 如果图像太暗，应先增加光子数，所以增加一点点的电流。如果这是不够的，应略有增加X射线光子的能量，即X射线管电压。
- 如果图像太亮，应先降低电压，那么当前的。
- 通过分级，可以增加图像的亮度。 1分级考虑到图像中的每个像素的强度，而2的分级需要每个2x2的像素矩阵的总和。图像将被约4倍，比在分级1的情况下更亮，但将有一半的决议。
- 设置最佳的亮度后，一个优化相机妥协一侧和另一侧的实验的合理工期之间的最佳的对比度的曝光时间。
- 的图像，尤其是低吸收样品的对比，可以提高通过使用过滤器，从而降低主要是低能量的光子，光子通量，。
4。样品定位
- 选择工作的放大倍率。可能的选择是0.5X，4X，10X，20X和40X。视野随着增加放大倍数。
- 通过设置之间的X射线源和样品，样品和探测器之间的距离，获取最佳分辨率和实地查看。增加采样距离源头上减少视野，提高了分辨率。样品到探测器的距离，具有相反的效果。
在3D观看整场应在目前的在各个角度的投影图像。应检查样品在不同的角度和旋转，使样品尽可能靠近旋转轴。为此，应该遵循以下步骤：
- 0度的图像，然后在-20度的旋转样品。如果想要的音量横向转移，一要正确重新定位旋转轴的位置。
- 校正后，样本是在另一个角度的旋转和位置再次纠正，直到感兴趣的领域内的图像是从-90到90度的所有角度。
5。高决议断层扫描
- 在测量过程中，样本轮换一次一个小角度，在各个角度的投影图像是。图像的总数始终是一方所需的分辨率和时间的测量和另一侧的文件大小之间的妥协。如图2所示，每一个投影包括样品中的所有切片叠加在另一之一，因此不能透露样品的三维结构。
图2。对大鼠肺（A）45 °（B）和90 °（C）旋转角度0 °的投影图像。
- 只有服用后至少介于-90和90度的投影图像，可以进行重建的样本量。重建需要10分钟和2小时之间，这取决于所使用的软件和的预测数。同样，最终的三维图像质量所需的分辨率和人愿意花时间和所产生的文件的大小之间的妥协。
6。图像标度校准
在重建图像的像素水平（值），形象独特。为了比较两个不同的图像，独特的强度等级要强加给每个图像。对于这个
- 使用相同的实验条件为样本，运行与一个标准的幻象断层
- 重新校准使用的幻像中获得的值的样本图像。规模最常见的是豪森菲尔德（或CT）的规模。对于4倍的放大倍率15000背景值（水或PBS）被替换为0，最大值35000骨豪森菲尔德3000标准值取代。其他像素值从线性内插或外推基于这些限制。
7。图像处理和分析
在获得高清晰度的图像，提取相关信息，利用图像分析软件。要使用该软件包已被设计为工作具有非常大的文件（最高的20Gb）的。
8。代表性的成果
一个从C57/Bl6鼠标代表了股骨在胚胎18.5天（E18.5） - 四天后开始矿化过程如图3所示。矿物层清晰可见（白色），而软组织在这个准备是不可见的。我们把1000的4倍线性放大投影图像。最后决议是8微米。一个体绘制图1所示的仔细的分析，表明，骨体积分数（矿化组织占领的骨体积分数）为0.18，和骨密度是723毫克/ 厘米 3 。这些价值观让我们比较有骨这种结构在其他的发展阶段。
图3。一个鼠标股骨胚胎的三维图像的不同表示。横向（横截面）（一），矢状（德尔梅迪奥横向）（b）条和快照卷的渲染（三）所示。
图4显示了一个女裸大鼠（RNU），12周龄原位植入与非小细胞肺癌（NSCLC）NCI - H460，肺的三维图像。 2500投影图像与线性放大了0.5倍，确保了16微米的最终解决。图像显示Microfil染色的血管（直径为20微米的），图像分析显示，植入4周后，多个癌结节形成。它们涵盖了相当一部分的肺容积（17％）。大多数肺染色发现在肿瘤的周边地区。值得注意的是，在图4b所示，几个血管目前还结节内，占地约3％的体积，据初步分析。
图4。癌结节的三维图像，在大鼠增长肺。容积再现（A）和卷（二）通过部分快照所示。癌结节用箭头标出。
电影1卷呈现在图1的小鼠股骨。点击这里观看电影 。
电影2卷图2中的大鼠肺的渲染。点击这里观看电影 。
电影3。通过肺部的串行部分。结节出现在大部分的片灰色地带。点击这里观看电影 。
Discussion
C57/Bl6小鼠在胚胎18.5天（E18.5）是四天后的矿化过程。在这一发展阶段，未来的骨是由许多层矿化osteoids，在图3清楚地看到。在这一点上，应该强调，矿化组织可以在较低的分辨率的可视化与不同的乐器，它需要较少的样品处理。本协议，除了提供更高的分辨率（微CT仪器在使用），提供最高的灵活性，为用户选择最佳的几何参数测量。
在图4的结果表明，在原位肺癌的动物模型，人类非小细胞肺癌可诱发血管和新生血管形成的招聘。我们认为，肺组织既不是感动，也没有在测量过程中改变其形状。用户应采取特别的预防措施，以避免这样的变化在一个断层。对于某些样品，特别是对软组织，建立特殊的设备保持完美的样品在测量过程中，固定。不幸的是，在肿瘤周围存在高的造影剂泄漏，防止周围血管可靠的量化。因此图像沾染一些染色剂，特别是在边缘，这显然是电影中的2和3。我们无法防止这种泄漏，但有用的信息，包括其大小，形状和存在内在的血管有关的癌结节并没有受到影响。我们可以清楚地得出结论，至少在这里进行了研究支气管流通，参与周围的血液供应肿瘤灌注，灌注一些肿瘤内也。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
在欧文和Cherna莫斯科维茨中心在魏茨曼科学研究所的纳米生物纳米成像进行了研究。
我们感谢她帮助设计和运行此协议Orna Yeger。
Materials
| For image acquisition we have used a MICRO XCT-400 microfocussed X-ray tomographic system produced by Xradia, Concord, USA. | |||
| Images were processed and analyzed using ImageJ (NIH, USA), Avizo (VSG, France) and MicroView (General Electric, USA) software packages. Any available image analysis software can be used instead |
References
- Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50, 2-13 (2010).
- Bauer, J. S., Link, T. M.
- Chappard, D., Retailleau-Gaborit, N., Legrand, E., Basle, M. F., Audran, M. Comparison insight bone measurements by histomorphometry and microCT. J Bone Miner Res. 20, 1177-1184 (2005).
- Muller, R., Van Campenhout, H., Damme, B. V. an Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography. Bone. 23, 59-66 (1998).
- Mueller, K., Yagel, R., Wheller, J. J. Anti-Aliased 3D Cone-Beam Reconstruction Of Low-Contrast Objects With Algebraic Methods. IEEE Transactions on Medical Imaging. 18, 519-537 (1999).
- Kachelriess, M., Schaller, S., Kalender, W. A. Advanced single-slice rebinning in cone-beam spiral CT. Med Phys. 27, 754-772 (2000).
- Endo, M., Komatsu, S., Kandatsu, S., Yashiro, T., Baba, M. A combination-weighted Feldkamp-based reconstruction algorithm for cone-beam CT. Phys. Med. Biol. 51, 3953-3965 (2006).
- Marxen, M., Thornton, M. M., Chiarot, C. B., Klement, G., Koprivnikar, J., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MicroCT scanner performance and considerations for vascular specimen imaging. Med Phys. 31, 305-313 (2004).
- Plouraboué, F., Cloetens, P., Fonta, C., Steyer, A., Lauwers, F., Marc-Vergnes, J. P. X-ray high-resolution vascular network imaging. J Microsc. 215, 139-148 (2004).
