Summary
Sterbenden Zellen werden extrudiert aus epithelialen Geweben durch konzertierte Kontraktion der benachbarten Zellen ohne Unterbrechung Barrierefunktion. Die optische Klarheit zu entwickeln Zebrafisch bietet ein hervorragendes System der Extrusion in lebenden Epithelien zu visualisieren. Hier beschreiben wir Methoden zu induzieren und Bild Extrusion in der Larven Zebrafisch Epidermis auf zellulärer Auflösung.
Abstract
Homöostatische Wartung von epithelialen Geweben erfordert die kontinuierliche Beseitigung von geschädigten Zellen ohne Unterbrechung Barrierefunktion. Unsere Studien haben herausgefunden, dass sterbende Zellen Signale zu senden, um ihre Nachbarn zu leben, um Form und Vertrag einen Ring aus Aktin und Myosin, dass es wirft aus der epithelialen Blatt beim Schließen etwaiger Lücken aus seiner Ausfahrt hätten ergeben können, bezeichnet ein Verfahren, Zell-Extrusion 1. Die optische Klarheit zu entwickeln Zebrafisch bietet ein hervorragendes System der Extrusion in lebenden Epithelien zu visualisieren. Hier beschreiben wir eine Methode zur Induktion und Bild Extrusion in der Larven Zebrafisch Epidermis. Zur Visualisierung Extrusion, injizieren wir ein rot fluoreszierendes Protein markierte Sonde für F-Aktin in einem-Zell-Stadium transgenen Zebrafisch-Embryos, die grün fluoreszierendes Protein in der Epidermis und induziert Apoptose durch Zugabe von G418 zu Larven. Wir verwenden dann Zeitraffer-Imaging auf eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop zu Aktindynamik und Epithelzellen Verhalten während des Prozesses der apoptotischen Extrusion beobachten. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, die Extrusion in Live-Epithelien zu untersuchen und eine Allee zu Erkrankungen durch das Versäumnis, apoptotische Zellen zu eliminieren verursacht Studie liefern.
Protocol
Grundlegende Workflow für die Visualisierung von Aktindynamik während der Zellteilung Extrusion in der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch
Die Epidermis der Entwicklung Zebrafisch besteht aus zwei verschiedenen Schichten, die Oberflächenschicht (oder Periderm) und einer basalen Schicht aus Zellen, die die Basalmembran 2 Kontakt besteht. Die Zellen der äußeren Oberflächenschicht Apoptose und werden aus dem Gewebe durch Extrusion 3 (Abbildung 1) eliminiert. Zur Visualisierung dieses Prozesses in Echtzeit, spritzen wir RNA-Kodierung rot fluoreszierendes Protein, fusioniert mit dem Calponin Homologie Domäne von Utrophin, ein Aktin-bindende Protein (RFP-UtrCH) 4,5, in einem-Zell-Stadium transgenen Zebrafisch Ausdruck grün fluoreszierende Protein (GFP ) unter dem geschichteten Epithelien Promoter Cytokeratin 8 6 (Abbildung 2A). Obwohl RFP-UtrCH ist ubiquitär in das Tier nach RNA-Injektion ausgedrückt, wir uns auf die oberflächlichen Zellen der Epidermis, die sowohl RFP und GFP zu Aktindynamik speziell folgen in der Epidermis (Abbildung 2B) zum Ausdruck zu konzentrieren. Danach behandeln wir die Larven mit G418 zu apoptotischen Extrusion und Bild der Epidermis und Aktin-Filamente mit einer sich drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop zu induzieren und zu erwerben 4D Datensätzen.
Vor dem Start des Experiments
- In-vitro-Transkription der RNA aus einem linearisierten DNA-Template mit dem mMessage mMachine SP6 Kit (Ambion) und reinigen die capped RNA mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen). Verdünnen Sie die RNA auf ~ 60ng/ul mit sterilem Wasser, machen 3-5μl Aliquots und bei -80 ° C bis fertig zur Injektion. Hinweis: Vermeiden Sie wiederholte Einfrieren / Auftauen zu einem Abbau der RNA zu verhindern.
- Machen Sie eine Form, die Embryonen während der Injektion zu halten durch Gießen 40ml 2% Agarose in E3 Embryo Medium (E3) in einen 100 x 15mm Kultur Platte und Platzieren eines Mikroinjektion Form (Adaptive Science Tools, # I-34) in diesem Fach. Nachdem die Agarose erstarrt ist, entfernen Sie das Werkzeug, um die Tröge in der Agarose aussetzen. Bewahren Sie die Platte bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Pull Kapillare Nadeln für die Injektion mit Borosilikatglas mit Filamenten (OD 1,0 mm, ID 0,78, 10cm lang) und eine Sutter P-97 Pipette Puller bei den folgenden Einstellungen (Heat 485, Pull 50, Velocity 60, Delay / Uhrzeit 90, Druck 200 ). Hinweis: Verschiedene Arten von Glas wird die Optimierung der aufgeführten Bedingungen erfordern.
- Make up 1% Low Melt (LM) Agarose in E3 und speichern 1ml Aliquots bei 42 ° C. Achten Sie darauf, wie Verdampfung von E3 aus den Beständen der Agarose-Konzentration erhöhen können.
- Behalten erwachsenen Zebrafisch unter Standard-Laborbedingungen mit einem regelmäßigen Hell / Dunkel-Zyklus von 14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit 7. Die Nacht vor dem Experiment bis Fische zu paaren, indem 3 weibliche und 2 Männer in einem Tank durch eine Trennwand getrennt eingestellt. Am nächsten Morgen, ändern das Wasser in den Tank und ziehen Sie die Trennlinie, wenn das Licht angeht.
1. Die Injektion von RNA Encoding der fluoreszenzmarkierten Aktin-bindende Protein
- Auftauen RNA auf Eis. Add 0,5% Phenol Red an die RNA im Verhältnis 1:1 für eine endgültige RNA-Konzentration von ~ 30ng/μl und laden 1μl Lösung in eine gezogen Kapillarnadel von Back-Füllung.
- Sammeln ~ 75 1-Zelle Stufe 8 CK: GFP Embryonen in E3. Pipettieren der gesammelten Embryonen in die Mikroinjektion Form mit einem 5 ¾ Pasteur-Pipette und sanft Orientierung der Embryonen in den Trog mit FST Dumont Nr. 5 Pinzette. Hinweis: Achten Sie darauf, schnell zu arbeiten, um zu vermeiden Injektion in eine multi-Zell-Stadium Embryos, die in Mosaik Ausdruck der injizierten RNA führen kann.
- Unter einem Standard-Labor seziert Stereomikroskop, spritzen die RNA in den Dotter des Embryos mit einem Druck-kontrollierte Mikroinjektor (Harvard Apparatus PLI-100 Pico-Injector). Ein roter Fleck (Phenolrot) sollte in den Embryo sichtbar nach der Injektion. Inject mindestens 50 Embryonen, die für jedes Experiment. (Siehe vorherige JoVE Protokoll für ein ausführliches Protokoll auf RNA-Injektion in Zebrafisch-Embryos 9). Hinweis:
- Ein Volumen von ~ 2nl sollte für die Injektion von RNA in einer Zelle Embryonen verwendet werden. Zur Bestimmung der Menge an RNA injiziert, verzichten Bolus der RNA in einem Tropfen Mineralöl auf einer geeichten Mikrometer Dia oder unter einem Mikroskop mit einer Skala bar in die Okulare gebaut. Der Tropfen der RNA sollte eine perfekte Kugel ist. Berechnen Sie den Betrag mit Hilfe der Gleichung geliefert: Volumen (in nl) = 4/3πr 3. Stellen Sie die Lautstärke, indem der Einspritzdruck oder die Uhrzeit auf dem Gerät geliefert.
- Vorsicht ist auch auf die niedrigste Menge an RNA, die Visualisierung des Fluorophors kann spritzen, wie hohe Konzentrationen von RNA kann giftig sein, um den sich entwickelnden Embryo werden. Um festzustellen, angemessenen Ausdruck Ebene sollte eine Dosis-Wirkungs-Kurve experimentieren, bevor Sie das Experiment durchgeführt werden. </ Li>
- Sortieren Sie die Embryonen zu jedem unbefruchteten oder beschädigte Eier zu entfernen und alle restlichen Embryonen bei 28,5 ° C.
- Nach 24 Stunden mit einem fluoreszierenden Präpariermikroskop auf Zebrafisch-Embryonen, die ein hohes Maß an GFP (Epidermis) und RFP (Aktin) Fluoreszenz haben zu wählen. Legen Sie die ausgewählten Embryonen bei 28,5 ° C bis bereit, mit der medikamentösen Behandlung, Apoptose zu induzieren gehen.
2. Induction of Cell Extrusion in Zebrafisch-Larven mit G418
Wir haben festgestellt, dass die Exposition gegenüber dem Aminoglykosid-Antibiotikum G418 oder Geneticin, Apoptose und Extrusion von epidermalen Zellen in der Entwicklung Zebrafischlarven 3 durch einen unbekannten Mechanismus verursacht. Wichtig ist, dass diese Behandlung funktioniert nur auf Larven, die 4 Tage nach der Befruchtung und älter sind. Wir finden, dass ~ 5-25 Zellen gefunden werden Extrudieren zu einem bestimmten Zeitpunkt aus dem fin Epithelzellen des G418 behandelt Larven Zebrafisch werden. Da die Menge der apoptotischen Zellen Extrudieren von Fisch zu Fisch variieren kann, empfehlen wir Montage mehrerer Fische für die Bildgebung.
- Sammeln und Platz 4 Tage nach der Befruchtung (dpf) Zebrafischlarven ausstellenden sowohl GFP und RFP-Fluoreszenz in einem 35 x 10mm Kulturschale mit 3 Milliliter (ml) der E3. Man kann zu behandeln bis zu 25 Larven in dieser Größe Kulturschale.
- Vorsichtig wieder die Medien mit 3mLs der E3 mit 1mg/ml G418 und inkubieren Larven in das Medikament für 4 Stunden bei 28,5 ° C. Beachten Sie, dass G418 lichtempfindlich ist, so achten Sie darauf, halten Sie die Kulturschale bedeckt oder in der Dunkelheit.
- Entfernen Sie das Medium und ersetzen mit vorgewärmten 28,5 ° C E3 Media mit 0,02% Tricaine und fahren Sie mit der Montage der Larven.
3. Montage Zebrafischlarven for Imaging
- Transfer 3 Larven in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen, und entfernen Sie die meisten der E3, nachdem der Fisch sinken auf dem Boden des Röhrchens. Wir haben festgestellt, dass bis zu 3 Tiere ordnungsgemäß montiert werden kann, bevor die Agarose erstarrt.
- Unter Anwendung eines Cut Pipettenspitze, pipet 120ul von 1% LM-Agarose (42 ° C) in die Röhre, mischen und dann vorsichtig pipet die Larven und Agarose Mischung auf dem Deckglas in den Boden eines MatTek Kulturschale.
- Mit einem FST Pin-Halter mit einem Steckbolzen oder Wolfram Nadel, schnell orientieren sich die Larven, so dass sie gerade und flach gegen die Deckglas des MatTek Gericht.
Hinweis: Wir verwenden in der Regel ein Zylinderstift zum ersten Orientierung die Larven und dann ein L-förmiger Stift, um sicherzustellen, sie sind gegen die Deckglas flach und verhindert Schäden an den Proben. - Nachdem die Agarose erstarrt ist, vorsichtig die Schale fuellen E3 mit 0,02% Tricaine. Hinweis: Alternativ G418 kann auf der E3 in der Imaging-Gericht zu veranlassen Extrusion weiter hinzugefügt werden, obwohl langfristige Exposition gegenüber 1mg/ml G418 die Larven töten.
4. Live-Imaging von Aktin Dynamics und Individual Epithelzellen Verhalten während der Zellteilung Extrusion mit einem Spinning Disc Konfokalmikroskop
Wir haben festgestellt, dass der gesamte Prozess der apoptotischen Extrusion aus der Epidermis entwickelt Zebrafischlarven ca. 20 Minuten 3 nimmt. Hier zeigen wir, wie ein Zeitraffer-Imaging-Experiment zu einer Reihe von z Ebenen durch eine einzige Schicht der Epidermis Zebrafisch zu sammeln, um die Extrusion zu visualisieren Setup. Wir haben herausgefunden, dass typische Weitfeld Fluoreszenzmikroskope signifikante Ausbleichen des Aktin-Filamenten und nicht für Zeitraffer Bildgebung ermöglichen verursachen. Daher unsere Resolution zu maximieren und zu verhindern, Bleichen, verwenden wir eine sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskop. Im Folgenden beschreiben wir, wie Sie das Experiment mit dem Andor IQ-Software mit einer Nikon-Mikroskop, obwohl die Prinzipien diskutiert, um ähnliche Mikroskop Set-ups angewendet werden können.
- Zuerst auf der Argon (zur Anregung von GFP bei 488nm) und HeNe (zur Anregung des RFP bei 561nm) Laser, Mikroskop, Kamera und epifluoreszenten aufleuchtet.
- Innerhalb der Andor IQ-Software (Version 1.10.1), erstellen Sie eine Zeitreihen-Protokoll enthält die Wellenlängen Sie Bilder, die Häufigkeit der Intervalle zwischen Bild erfasst und die Zahl Zeiten der Eroberung sollte wiederholt werden.
- Sanft legen Sie die MatTek Schale mit Ihrer Probe auf dem Mikroskoptisch und verwenden Sie ein 20x-Objektiv mit Durchlicht auf die Larven zu konzentrieren.
- Bewegen Sie den 40X Wasserimmersionsobjektiv (NA 0,8) in die richtige Position. Mit diesem Ziel können wir Film ca. 20-25 Zellen pro Feld, das uns an zelluläre Verhaltensweisen während der Extrusion zu folgen, während auch die Lösung sub-zellulären Aktin-Dynamik ermöglicht. Hinweis: Der gleiche Montage-und Imaging-Strategien, um aufrechte Mikroskope angewendet werden, obwohl ein 40X Wasserimmersionsobjektiv mit einem großen Arbeitsabstand verwendet werden muss.
- Vorsichtig einen Tropfen Wasser auf der Oberseite des 40x-Objektiv und raschen Platzierung der MatTek Schüssel an der Spitze. Nichte: Zeiss Immersol Eintauchen Lösung kann auch verwendet werden, wenn Verdunstung des Wassers ist ein Problem sein.
- Identifizieren Sie die Probe mit Phase oder DIC Beleuchtung und verwenden Sie dann 488nm Epifluoreszenz, sich speziell auf die GFP positive Epidermis.
- Wechseln Sie zu konfokalen Scanning-Modus. Passen Sie die Laserintensität und Belichtungszeit für jeden der Kanäle (488nm und 561nm) entsprechend. Achten Sie auf die Laserleistung und Belichtungszeit für eine optimale Erkennung des Signals auszugleichen und jede Bleichen oder Toxizität zu verhindern.
- Zur Identifizierung Extrudieren Zellen verwenden Epifluoreszenz zur Visualisierung der GFP-markierten Epidermis und identifizieren eine Gruppe von Zellen in einem klassischen Rosette Muster, bestehend aus einer Sammlung von umgebenden Zellen ein kleiner runder Zellen in der Mitte. Mit der konfokalen Scanning-Modus, sollte es auch eine Anreicherung des RFP-markierten Aktin sichtbar wie ein Ring um den kleinen runden Zellen in der Mitte, ein Markenzeichen der Zelle Extrusion werden. Sobald Sie ein Extrudieren Zelle identifiziert, schnell auf das Mikroskop 4D (XYZ-Time) konfokale Datensätze erwerben gesetzt.
- Stellen Sie den oberen und unteren Punkte innerhalb der z-Ebene auf eine einzelne Schicht der Epidermis, einschließlich der Extrusion Zelle sichtbar zu machen, und wählen Sie die Schrittweite. Für Zeitraffer-Bildgebung, die Intervalle für die Bilderfassung und Anzahl der Wiederholungen. Zum Beispiel haben wir in der Regel erwerben z-Serie Spanning 5-10 um, mit einer 1 um Schritt Größe, alle 1-2 Minuten für 30 Minuten.
- Um die Daten anzuzeigen, wir machen typischerweise 3-D-Projektionen der z-Serie, und speichern Sie die Daten als eine Filmdatei, die kompatibel mit Quick Time (Apple) eingestellt ist. Auf diese Weise können wir visualisieren Kontraktion des Aktin-Ring und epithelialen Verhaltensweisen, um den sterbenden Zelle im Laufe der Zeit auftreten.
5. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Schematische Darstellung der apoptotischen Extrusion. Aktinfilamente sind rot dargestellt, sind GFP positive Zellen der Epidermis grün.
Abbildung 2. Experimentelle Workflow. A. Schematische Darstellung des Workflow für das Experiment. B. Expression von RFP-UtrCH in der Epidermis eines 4dpf CK: GFP Zebrafisch.
Abbildung 3. Standbilder (z-Projektionen) aus einem Zeitraffer-Film, Live-Aktindynamik folgt während des Prozesses der epithelialen Zell-Extrusion. Die Pfeile zeigen den Ring aus Aktin durch benachbarte Zellen, die Verträge und schließt sich im Laufe von 2 Minuten gebildet.
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Discussion
Die hier beschriebene Protokoll zeigt eine einfache und unkomplizierte Methode, um den Prozess der Extrusion in einer Live-Epithelgewebe zu visualisieren. Diese Art von Experiment ermöglicht es uns, Feinheiten der Aktin-Dynamik nicht zuvor in fixiertem Gewebe Analysen geschätzt zu untersuchen, und daher ergänzt gemeinsamen Immunfluoreszenz-Methoden. Wir können dieses Protokoll in Kombination mit chemischen Inhibitoren oder genetische Mutanten eine bessere Analyse der Extrusion und Studium Erkrankungen mit dem Scheitern zu entfernen und klare apoptotischen Zellen, die wir erwarten, verbunden werden, um entzündliche Reaktionen oder die Anhäufung von geschädigten Zellen führen, wie gesehen in der Krebstherapie. Zum Beispiel hat unser Labor bereits gezeigt, dass chemische Inhibitoren in Kombination mit G418 kann verwendet werden, um die Ausrichtung der Aktin-Filamente entlang der basolateralen Oberfläche der Zelle, die die Richtung einer Zelle extrudiert 3 Effekte verändern. Eine Beschränkung auf die aktuelle Methode ist, dass aufgrund der stochastischen und unvorhersehbare Natur des Zelltods, unsere Datensätze auf den späteren Stadien der Extrusion konzentrieren neigen. Zur Untersuchung der Bildung der vielzelligen Aktinring und Initiierung der Kontraktion werden zukünftige Experimente wenden Techniken zur Apoptose in einer Untergruppe von fluoreszenzmarkierten Epithelzellen, die genetisch für den Zelltod 10 sind gezielte induzieren. Die Kombination dieser Strategie mit unserer Methode, um Bild Aktindynamik in der Epidermis sollte erleichtern Studien der frühen Stufen zum apoptotischen Extrusion. Gemeinsam werden die Erkenntnisse aus diesen Experimenten signifikant zu unserem Verständnis von Epithelzellen Extrusion und seine medizinische Bedeutung.
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Disclosures
Animal Welfare Assurance
Alle Verfahren in diesem Protokoll unter Verwendung der Zebrafisch, Danio rerio durchgeführt, wurden von der Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden Committee (IACUC) an der University of Utah (Animal Welfare Assurance # 10-07017).
Acknowledgments
Wir danken Mitglieder der Rosenblatt Labor für wissenschaftliche Diskussionen, Anregungen und Kommentare. Wir möchten auch Mary Halloran, die uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt das Plasmid kodiert RFP-UtrCH und David Grunwald, der CK versorgt haben: GFP transgener Zebrafische. Danke auch an Gretchen König und die Mitarbeiter der Zentrale Zebrafisch Ressourcen an der Universität von Utah für exzellente Wartung und Pflege der Zebrafisch. Diese Arbeit wurde vom New Innovator NIH-NIGMS NIH Director des Award 1 DP2 OD002056-01 bis JR unterstützt. GTE wurde durch die NIH Multidisziplinäre Cancer Schulungsprogramm zu gewähren 5T32 CA03247-8 unterstützt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR international | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Co. | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Co. | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments, Inc. | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus Corporation | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
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