Summary
定量的な、高スループット、リアルタイム、及びSiO上にラベルフリー生体分子の検出（DNA、タンパク質など）
Abstract
生体分子の相互作用の高感度測定は、このような基本的な生物学や微生物学、環境/農業/生物兵器防衛監視、ナノバイオテクノロジー、など多くの分野や産業で使用されています。診断アプリケーション、監視（検出）のために存在、非存在、または患者検体で検出されたターゲットプロテオームやゲノムバイオマーカーの異常発現は、治療法や治療法の有効性を決定するために使用することができます。研究の分野では、分子の親和性と特異性については十分に調査中のシステムを特徴付けるのに有用です。
分子の濃度や親和性を決定するために、現在のシステムの多くは、ラベルの使用に依存しています。これらのシステムの例としては、酵素免疫測定法（ELISA）、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法、ゲル電気泳動アッセイ、および質量分析（MS）のようなイムノアッセイが含まれています。一般に、これらのラベルは、蛍光放射線、または自然の中で比色であり、直接または間接的に関心の分子標的に添付されています。ラベルの使用は広く受け入れられ、いくつかの利点を持っているものの、これらの相互作用を測定するための新しいラベルフリー法の開発を刺激している欠点があります。これらの欠点は、そのような増加アッセイコスト、試薬の寿命とユーザビリティ、ストレージおよび安全性の懸念など、実用的な側面、ラベリングの無駄な時間と労力、およびラベリングのプロセスまたはラベルの自分自身のために別の試薬間のばらつきが含まれています。科学研究に基づいて、これらのラベルの使用はまた、添付されたラベルと直接リアルタイムに相互作用を測定することができないの存在に起因するタンパク質の機能/構造への影響に対する懸念などの困難を導入することができます。
ここで紹介するマイクロアレイ研究に従順である新しいラベルフリー光バイオセンサーの使用は、タンパク質、DNA、抗原性物質、全体の病原体（ビリオン）及びその他の生物材料を検出するため、干渉反射イメージングセンサー（IRIS）と呼ばれる。 IRISシステムは、高感度、精度、およびさまざまな生体分子の相互作用[1-3]の再現性を持つことが実証されている。利点は、多重画像の容量、リアルタイムおよびエンドポイントの測定機能、およびそのような削減試薬の消費量と分析時間の短縮など、他の高スループットの属性が含まれています。また、IRISのプラットフォームが使用するのは簡単です、安価な機器を必要とし、多くの現代の界面化学的アプローチと互換性がシリコンベースの固相アッセイ成分を利用しています。
ここでは、プローブアレイの準備からインキュベーションおよびエンドポイントの形式で結果の分析にバインディングターゲットの測定にIRISシステムを使用することを提示。モデルシステムはHSA -斑点の基板上にヒト血清アルブミン（HSA）に特異的な標的抗体のキャプチャーになります。
Protocol
1。基板の準備
- コート層状シリコンのSiO自己吸着コポリ（DMA - NAS - MAPS）2基板：
- 共重合体の合成、化学構造、およびコーティングプロセスは、で公開されています：G. Pirri、F.達民、M.キアリ、E. Bontempi、LE Deperoを。 DNAマイクロアレイスライドガラス用高分子吸着コーティングの特性評価。アナル。化学。 2004年、76、1352から1358。
- 簡単に言うと、脱イオン（DI）水5 mLにポリマーの100 mgを追加することにより、ポリマー溶液を調製し、0.92 Mの最終濃度に達するために40％飽和硫酸アンモニウム（（NH 4）2SO 4）溶液5mlを追加
- シェーカーで30分間溶液中とその後水没のチップは、DI水ですすぐ。アルゴン/ N 2ガ スで十分に乾燥させます。
- 80焼くチップ℃で15分間。
- ストアポリマーで被覆したプローブのスポッティング手順まで、最大3ヶ月間乾燥した環境（真空デシケーター）における基板/チップ。
2。プローブアレイの作製：抗体、抗原、SS /二本鎖DNA、RNAなど
- 目的のバッファで適切な濃度にプローブ（複数可）を希釈する。このステップはかなり変動することができますが、典型的な実験はpH≈7.4で緩衝生理食塩水（PBS）、リン酸で0.5 mg / mLの濃度（0.1 -1 mg / mLの範囲）で抗原またはIgGを使用しています。
- または384ウェルプレート（または使用中のスポッターのための標準的なソースプレート） - 96の場所のソリューション
- 希望のプリントされた配列のパラメータをスポッティングセットアップ：（回、アプローチ速度、等の滞留）使用されている面とソリューションのために適切なスポッティングのパラメータを決定する。グリッド、グリッドレイアウト、複製グリッドの数、およびチップ上の任意のスポットの位置ごとにそれぞれの条件の複製の数を決定します。適切な場所に配置基板とソースのプレートは、廃棄物と供給ボトルの準備ができたら、と印刷の実行を開始する確認してください。
- スポッティングは、固定化および非アクティブ化プロセスの続行を許可する（4-18時間）、高湿度環境での場所の基質は一晩終了後。
- 基板を洗浄してください：0.1％のTween（PBST）を含むPBS、PBS、そして最後に脱イオン（DI）水：3つの別々の洗浄のための3分間は、次のソリューションでそれらを置く。実験の種類に応じて（湿式対乾式）、アルゴンガスで十分にチップを乾燥し、インキュベーションを開始するか、フローチャンバー内にチップを置いて、組み立てる。
- シェーカーのプレート上にしながら30分間7.4に調整pHを持つエタノールアミンの50 mM溶液にチップを沈めることによって共重合体の表面上の残りのNHS基を無効にします。調製した溶液は、タンパク質で安全に使用できる限り、そのようなヒドロキシルアミンまたはTrisのような一級アミン含有化合物はまた、使用することができます。徹底的にPBS次にDI水を使用して非活性化のソリューションをすすぐ。
- オプションのステップ（採用されている表面の化学的性質に応じて）：BSA、カゼイン、の溶液または30分間再水和した牛乳を使用してブロックの表面。ポリマー骨格は、非特異的タンパク質の結合を防ぐために働くように私たちが使用する現在のポリマー表面の化学的性質のために、我々は、この手順を実行しないでください。
3。データ収集とインキュベーション手順：エンドポイントの形式
- 希望するバッファへの関心の対象のソリューションとなります。ここで、それはPBSで抗BSAの適切な濃度（10 ngの/ PBSで抗BSAのmL溶液1-10 mLを加えるEX）のソリューションとなります。また、ネガティブコントロールのインキュベーション用緩衝液の相当額を（対象なし）を持っていることを確認してください。
- すべての後に収集したデータを正規化するためのシリコンミラースキャンしてください。
- 各スポットでの初期の光の高さ（質量）を決定する前に、インキュベーションのステップへIRISシステムを持つ準備されたプローブの配列をスキャンします。これは表面上の質量の変化を適切に分析を可能にする、インキュベーション後、結合のレベル、すなわち。ここで、いくつかのパラメータは、現在のような露出時間などの実験、、視野、繁栄泳動、等のために調整されます。
- シェーカーのプレート上で1時間、調製した溶液に浸すのチップ（S）。インキュベーション時間は、フローチャンバーの撹拌、ターゲットの濃度が検出され、輸送特性（リアルタイム検出モードが使用されている場合）、ターゲット - プローブペアの親和性、などのレベルに応じてかなり異なることがあります。
- インキュベーション後、ステップ2.5で説明した洗浄手順を繰り返します）
- IRISシステムを使用して、同じプローブアレイをスキャンし、プレインキュベーションの比較のためのポストインキュベーションの画像を得る。
- 二次抗体が使用されているサンドイッチアッセイ形式の例については、必要に応じて別のインキュベーションステップのためにこのプロセスを繰り返します。
4。データ解析
- プロにラボが開発したソフトウェアを使用して、それぞれの虹彩スキャン（強度イメージのシーケンス）のために収集された画像を合わせる光学的厚さ情報を含むプローブアレイのイメージを首領。結合の迅速な定性分析は、（登録）後、プレインキュベーションの画像を減算することによって行うことができます。結合は質量の変化が観察されたそれらのスポットの強度の変化として表示されます。定量分析の場合は、スポットとスポットの環状の外側内の各ピクセルの光学的厚さの情報を平均化し、これらの2つの領域の直接比較を行うことによって、バックグラウンドと比較して各スポットの質量密度を決定する。
5。代表的な結果：
図1は、代表的な抗体アレイをスポットしたレイヤーのSi - SiO 2の IRISの基板の例の回路図を示します。各抗体のアンサンブルは、異なるタンパク質をターゲットと異なるエピトープに対する特異性と複製にスポットする。二つの異なる全ウイルスおよびウイルスタンパク質は、例えばターゲットとして表されます。ネガティブコントロール抗体は、アッセイに依存し、非特異的および/またはウイルス特異的であることができる。
図2は、ヒト血清アルブミンの結合（HSA）特有の斑点HSAとウサギIgG（コントロール）スポットの配列に対する抗体を示しています。ここに見られるように、光のフィッティングと決定した後、プリとポストインキュベーションイメージのために厚さ、結合配列のための差分画像を定性的に結合評価するために作成することができます。定量分析は、500 ng / mLの抗HSAインキュベーションの濃度に対して、それぞれ、HSAおよびウサギIgGのスポットを観察された2.05と0.13ナノメートルの光の高さの変化を意味することが明らかになった。
図3は、タンパク質濃度とdsDNAのオリゴマーの長さに毛皮のタンパク質結合依存のIRISの測定を示しています。上のグラフは、初期固定化オリゴマープローブの高さとポストインキュベーションの毛皮の結合のための絶対的な光学式高さ測定を示しています。毛皮の増加する濃度（50、100、200 nm）はDNAプローブに増加した結合をもたらした。オリゴマーの長さは、またより多くの結合の結果より長い配列を持つ毛皮の結合に影響を与えます。ここで、エラーバーは平均値から一つの標準偏差を表しています。下のプロットは、dsDNAの鎖あたりの結合計算された毛皮のタンパク質二量体を示しています。二量体の結合が著しく非特異的結合の高レベルを示唆する200nMの毛皮のタンパク質濃度で増加した。
図1通常IRISシステムと多重化方式で特定のウイルスやウイルスの成分を検出する実験で使用したサンプルプローブアレイの回路図。
図2斑点のHSAへのヒト血清アルブミン特異的抗体の結合のためのポストインキュベーションの差分画像は、500 ng / mLの濃度でこのラベルフリーシステムで収集。各スポットのための生体材料の質量密度は、スポット内で光学的厚さの情報を平均化してから、バックグラウンドを代表するスポットの周囲に環状の平均でこれを比較することによって決定されます。
図3。オリゴマーの長さ、オリゴマー内のコンセンサス配列の位置、および毛皮のタンパク質濃度に基づいて、既知のコンセンサス配列と斑点のある二本鎖オリゴマーと毛皮のタンパク質相互作用のためのデータバインディングのプロット。各斑点のシーケンス（上部）にバインドされている毛皮のタンパク質の絶対量に関する情報は、オリゴマー（底部）の各タイプにバインドされている毛皮の二量体の数を推定するために使用することができます。
Discussion
IRISプラットフォームは、マイクロアレイのフォーマットで高スループットのデータバインディングを収集するために使用するのは簡単で迅速なシステムです。共有結合的に表面に別の機能性タンパク質やDNAプローブを固定化することによって、標的抗原/バイオマーカーの/ etc。イムノアッセイのように、解から取り込むことができます。 IRISシステムを持つエンドポイントまたはリアルタイム形式のプローブの条件で、これらの相互作用の測定は、それぞれの相互作用のために収集するための高感度と定量的な情報が可能になります。ここに詳述する、代表的な実験は、この手法で調査することができる相互作用の種類の一例にすぎません。転写因子、ウイルス抗原、および全体のウイルスの検出は、以前は明らかにし、IRISが容易に扱うことができる解析の種類のほんの一例を表している。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、そのサポートのためにZoiray Technologies社、共同スポンサーと商業化のパートナーを、感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafers with 500 nm of thermally-grown silicon dioxide | Silicon Valley Microelectronics | ||
| Ammonium sulfate powder | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) 10X ready concentrate | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Antibody to human serum albumin (Anti-HSA) | Sigma-Aldrich | A0433 | |
| Human serum albumin (HSA) | Sigma-Aldrich | A9511 | |
| Argon or nitrogen gas (ultra-high purity) | Airgas | AR UHP300 or NI UHP300 | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Scienceware® vacuum desiccator | Sigma-Aldrich | Z119016 | |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| 96-well plates, low cell binding | Nalge Nunc international | 145399 | |
| BioOdyssey Calligrapher MiniArrayer | Bio-Rad | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | 398136 | |
| Hydroxylamine | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 26103 | |
| Multi-purpose rotator, model # 2314 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 2314Q | |
| Retiga 2000R camera | QImaging | 01-RET-2000R-F-M-12 | |
| AcuLED illumination source | PerkinElmer, Inc. | ||
| Optical components (lenses, objectives, apertures, rails, posts, etc.) | Thorlabs Inc. |
References
- Özkumur, E., Needham, J. W., Bergstein, D. A., Gonzalez, R., Cabodi, M., Gershoni, J. M., Goldberg, B. B., Ünlö, M. S. Label-free and dynamic detection of biomolecular interactions for high-throughput microarray applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7988-7992 (2008).
- Özkumur, E., Ahn, S., Yalcin, A., Lopez, C. A., Cevik, E., Irani, R. J., DeLisi, C., Chiari, M., Ünlö, M. S. Label-free microarray imaging for direct detection of DNA hybridization and single-nucleotide mismatches. Biosensors and Bioelectronics. 25, 1789-1795 (2010).
- Özkumur, E., Lopez, C. A., Yalcin, A., Bergstein, D. A., Connor, J. H., Chiari, M., Ünlö, M. S. Spectral reflectance imaging for a multiplexed, high-throughput, label-free, and dynamic biosensing platform. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16, 635-646 (2010).
- Lopez, C. A., Daaboul, G. G., Vedula, R. S., Özkumur, E., Bergstein, D. A., Geisbert, T. W., Fawcett, H. E., Goldberg, B. B., Connor, J. H., Ünlö, M. S. Label-free multiplexed virus detection using spectral reflectance imaging. Biosensors and Bioelectronics. , (2011).
