Summary
여기 마우스 간부터 간장 별 모양의 세포의 격리를 위해 방법을 설명합니다. 별 모양의 세포 정화 들어, 마우스 간은이 소화되게하여
Abstract
간장 별 모양의 세포 스타 같은 형태의 간 세포 거주하고 간 사인 내피 세포와 hepatocytes 1,2 사이에 쭉 내려 가래의 공간에 위치하고 있습니다. 별 모양의 세포는 골수 엽 성의 전구 물질에서 파생 및 토탈 바디 비타민 A 1, 2의 80 %를 저장할 수 있습니다. 활성화되면, 별 모양의 세포 따라서 간 섬유증 3 기여, 세포외 기질을 생산 myofibroblasts로 구분. 계약을 자신의 능력에 따라 myofibroblastic 별 모양의 세포가 포털 고혈압 4 연관된 혈관 음색을 조절할 수 있습니다. 최근, 우리는 간장 별 모양의 세포가 강력한 항원 제시 세포이며, NKT 세포뿐만 아니라, 기존의 T lymphocytes 5 활성화할 수 있습니다 보여주었다.
여기 마우스 간부터 간장 별 모양의 세포의 효율적인 준비 방법을 제시한다. 그들 perisinusoidal 현지화으로 인해, 간장 별 모양의 세포의 격리는 여러 단계로 이루어집니다. 쭉 내려 가래의 공간에서 고립에 액세스할 별 모양의 세포를 렌더링하기 위해서는 마우스 간은이 소화 효소 Pronase E와 Collagenase P. 다음과 재관류로 현장에 perfused 있으며, 간 조직은에 Pronase E와 Collagenase P와 함께 추가적인 효소 치료를 받게됩니다 체외. 이후, 방법은 간장 별 모양의 세포에 비타민 A - 저장 지질 방울의 엄청난 금액을 활용합니다. 이 기능은 8퍼센트 Nycodenz 기울기에 원심 분리하여 다른 간장 세포 유형에서 별 모양의 세포의 분리 수 있습니다. 프로토콜 여기에서 설명한은 별 모양의 세포의 매우 순수하고 동질적인 인구 산출. 준비 순도는 이전 형광 현미경이나 유동세포계측법에 의해 분석 마커 분자 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)에 대한 염색법에 의해 평가하실 수 있습니다. 또한, 가벼운 현미경은 지질 방울의 높은 금액을 가지고 있고, 별 모양의 간장 별 모양의 세포의 독특한 모양을 보여준다.
함께 찍은, 우리는 그들의 대표적인 형태학의 외관 이미지와 별 모양의 세포 실체를 정의하는 데 도움이 GFAP 표현을 포함한 간장 별 모양의 세포의 효율적인 격리에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.
Protocol
C57BL / 6 생쥐 ~ 20 세 주 이상에서 사용해야합니다. 25-30g 무게 남성 마우스의 사용을 권장합니다. 별 모양의 세포의 수율은 셀 절연을 별 모양 이전에 2 개월 쥐에게 비타민 A - 농축 다이어트 먹이를 증가 수 있습니다. Balb / C 마우스에서 별 모양의 세포의 수율이 상당히 높은 반면 약 2x10 5 간장 별 모양의 세포는 하나의 C57BL / 6 마우스의 간장에서 정화 수 있습니다. 다음 프로토콜은 5 마우스로 조정됩니다. 동물 관리 및 실험이 승인 기관 애니멀 케어 및 사용위원회 프로토콜에 따라 수행되었다.
1. 마우스 간은 현장의 재관류에서 소화 효소와 함께
- 37 ° C의 물을 욕조에 SC1 버퍼와 효소 재관류 솔루션을 따뜻하게.
- 연동 펌프의 실리콘 튜브로 설정 날개 주입을 탑재합니다.
- 간의 재관류 현장에서 사용되는 유량입니다 6.5ml/min의 층류 흐름을 얻기 위해 PBS로 펌프를 보정합니다. SC1 솔루션과 실리콘 튜브를 평형.
- 케타민을 (90 MG / kg)과 Xylazine (10 MG / kg) 솔루션과 깊이 마취제를 투여함을 보장하기 위해 반사 손실 테스트 intraperitoneal 주사로 마우스를 마취.
- 적당한 기지에 위로 향한 위치에 마우스를 수정.
- 복부 피부에 세로 절개를 수행하고 복막을 폭로하기 위해 가위와 집게를 사용하십시오.
- 조심스럽게 복막을 열고 포털 정맥을 노출하기 위해 동물의 왼쪽으로 복강의 내장을 이동합니다.
- 포털 정맥에 주입 세트의 정맥을 넣습니다. 이 단계에 대한, stereomicroscope의 사용을 권장합니다.
- 30ml SC1 솔루션으로 간의 재관류를 시작합니다. 즉시 흐름을 시작 후 베나 카바 하부를 엽니다. 간장의 성공 플러싱은 간 조직의 색깔의 손실로 표시됩니다.
- 30ml Pronase 전자 솔루션으로 간을 Perfuse. 성공적으로 소화시 간 엽 (叶)이 팽창되며, lobules은 캡슐을 통해 뚜렷한 나타납니다.
- 30ml Collagenase의 P 솔루션으로 간을 Perfuse. 이 시점에서 간은 그 모양을 잃고 이완증의 및 비정질 보인다 있습니다.
- 신중하게 횡경막과 주변 장기에서 간장을 분리하고 그것은 얼음 70ml SC2 용액에 보관합니다.
- 추가 생쥐에 대한 절차를 반복합니다.
2. 마우스 간은의 체외의 소화에
모든 추가 작업 단계 층류 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야합니다.
- 날카로운 가위를 사용하여 약 2x2x2mm 3 조각으로 간을 잘라.
- Pronase E - Collagenase P 솔루션 50ml로 간 조각을 포함 70ml SC2의 정지를 결합하고 DNase I 솔루션의 1ml를 추가합니다.
- 37 20 분 대한 간은을 소화 ° C가 감동하는 동안.
3. 밀도 기울기 원심 분리 장치
- 6 50ml 팰컨 튜브로 70μm 셀 strainers 통해 세포 현탁액을 필터링하고 SC2 버퍼 50ml까지 추가할 수 있습니다. 600g 4 ° C.에 10 분에 대한 원심 분리기
- 조심스럽게 뜨는의 40ml를 대기음, 다음 각 튜브에 150μl DNase I 솔루션을 추가하고 세포를 resuspend.
- 4 50ml 팰컨 튜브에 수영장 셀 suspensions과 600g 4시 10 분에 대한 GBSS - B, 원심 분리기로 씻어 ° C.
- 조심스럽게 펠렛 각 튜브에 추가 150μl DNase I 솔루션을 방해하지 않고 최대한 뜨는의를 대기음. 튜브 당 10ml GBSS - B의 세포 알약을 Resuspend.
- 수영장 2 50ml 팰컨 튜브에 세포 튜브 당 36ml의 총 볼륨 GBSS - B를 추가합니다. 각각의 튜브에 14ml Nycodenz 솔루션을 추가하고 잘 섞는다.
- 총 10 튜브의 결과로 하나 12ml 기울기 원심 분리 튜브에 세포 현탁액의 10ml를 전송합니다. 부드럽게 1.5ml GBSS - B 당 튜브와 세포 현탁액을 오버레이.
- 1,500그램 4에서 15을 위해 그라디언트를 원심 ° C 브레이크없이. 별 모양의 세포가 흰색 고리로서 계면에서 발견되는 반면, 그 후, hepatocytes는 튜브의 하단에 pelleted 것입니다.
- 조심스럽게 별 모양의 세포를 포함하는 계면을 수확하고 GBSS - B와 함께 그들을 씻고, 600g, 4에서 원심 분리기를위한 10 분 ° C.
- 뜨는을 대기음와 10 %의 열 inactivated FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2mM L - 글루타민, 1mM 나트륨 pyruvate 및 10mM HEPES와 보충 20ml DMEM에있는 세포를 resuspend. 2x10 4 셀 / cm 2 농도와 조직 문화 flasks에 세포를 전송합니다. 37 ° C와 5% CO 2에있는 세포를 품어.
- 즉시 간장 별 모양의 세포가 죽은 세포와 세포 부스러기를 씻어 (약 2 시간 준비 후) 자기편 그대로 미디어를 변경합니다.
- 다음 날, 별 모양의 세포에S는 perinuclear 비타민 A - 저장 지질 vesicles과의 특성 별 모양의 형태를 개발해야합니다.
- 후속 실험, 간장 별 모양의 세포는 쉽게 같은 Accutase, 예를 들어 같은 가벼운 효소 솔루션을 사용하지 않는 코팅 플라스틱 표면에서 분리 수 있습니다
4. 대표 결과 :
제공된 프로토콜을 사용하여 간장 별 모양의 세포의 준비 다음, 고립된 인구의 순도는 이러한 glial fibrillary 산성 단백질의 스타와 같은 모양, perinuclear 지질 방울, 그리고 표현 (GFAP로 세포 유형의 세 가지 주요 특성을 고려하여 테스트를 수 ). 특성 세포 분리 후 간장 별 모양의 세포의 2 시간의 외관뿐만 아니라 체외 문화의 날 1 3에 대한 대표적인 사진은 그림 1에 묘사된 있습니다. 그림 2는 세포 격리 다음 3 일간 교양되었습니다 간장 별 모양의 세포에서 GFAP에 대한 대표 immunofluorescence 염색법을 보여줍니다. 간장 별 모양의 세포는 체외 문화 중에 myofibroblastic 세포로 구별. 이러한 활성 별 모양의 세포의 특성 특징은 알파 평활근 굴지 (αSMA)의 표현이다. 그림 3은 체외 문화의 날 7 활성화 별 모양의 세포에 aSMA과 마이 오신 IIA에 대한 immunofluorescence 염색법을 보여줍니다.
그림 1. 간성 별 모양의 세포의 특성 형태. 별 모양의 세포가 제공하는 프로토콜을 사용하여 마우스 간은으로부터 격리되었다. 이미지가 별 모양의 세포가 세포 격리 후 2 시간 (A, B)뿐만 아니라 1 일 (C)와 체외 문화의 3 일 (D)에 대한 묘사. 간장 별 모양의 세포가 perinuclear 사이트에서 지질 vesicles 높은 금액을 전시하고 체외 문화의 첫 번째 일 (확대 200x) 동안 자신의 특유의 아스트랄과 같은 형태를 취득.
그림 2. 간성 별 모양의 세포는 특히 간장에 GFAP을 표현. 별 모양의 세포는 체외 문화의 날 3 격리 및 immunofluorescently GFAP (적색)에 얼룩했다. 세포 핵은 파란색 (Hoechst는 얼룩)에 그려져있다.
그림 3. 간 별 모양의 세포가 myofibroblasts로 구분. C57BL / 6 마우스에서 분리된 간장 별 모양의 세포는 7 일 교양되었습니다. 그 후, 그들은 챔버 슬라이드로 전송하고 aSMA (빨간색으로 표시)과 마이 오신 IIA (녹색에 묘사된)에 얼룩했다. 세포 핵은 Hoechst (파란색)과 counterstained되었습니다.
| SC1 버퍼 | |
| EGTA | 190mg |
| 포도당 | 900mg |
| HEPES | 1M 재고 솔루션 10 ML |
| KCl | 400mg |
| 나 2 HPO 4 X 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| 아니 2 PO 4 X H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| 페놀 레드 | 6mg |
| DH 2 O | 1리터까지 작성 |
| SC2 버퍼 | |
| CaCl 2 X 2 시간 2 O | 560mg |
| HEPES | 1M 재고 솔루션 10ml |
| KCl | 400mg |
| 나 2 HPO 4 X 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| 아니 2 PO 4 X H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| 페놀 레드 | 6mg |
| DH 2 O | 1리터까지 작성 |
| GBSS - 버퍼 | |
| KCl | 370mg |
| CaCl 2 X 2 시간 2 O | 225mg |
| 포도당 | 991mg |
| KH 2 PO 4 | 30mg |
| MgCl 2 X 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 X 7 H 2 O | 70mg |
| 나 2 HPO 4 X 2 H 2 O | 75mg |
| NaHCO 3 | 227mg |
| 페놀 레드 | 6mg |
| DH 2 O | 1리터까지 작성 |
| GBSS - B 버퍼 | |
| CaCl 2 X 2 시간 2 O | 225mg |
| 포도당 | 991mg |
| KCl | 370mg |
| KH 2 PO 4 | 30mg |
| MgCl 2 X 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 X 7 H 2 O | 70mg |
| 나 2 HPO 4 X 2 H 2 O | 75mg |
| NaCl | 8g |
| NaHCO 3 | 227mg |
| 페놀 레드 | 6mg |
| DH 2 O | 1리터까지 작성 |
| Pronase 전자 재관류 솔루션 | |
| Pronase E | 100mg (4000 PU / MG 분) |
| SC2 버퍼 | 200ml |
| Collagenase P 재관류 솔루션 | |
| Collagenase P | 85mg (1.78 U / MG lyo) |
| SC2 버퍼 | 200ml |
| Pronase E - Collagenase P 솔루션 | |
| Pronase E | 50mg (4000 PU / MG 분) |
| Collagenase P | 85mg (1.78 U / MG lyo) |
| SC2 버퍼 | 50ml |
| DNase I 솔루션 | |
| DNase I | 6mg (ca. 2000U/mg) |
| GBSS - B | 3ml |
| Nycodenz 솔루션 | |
| Nycodenz | 8g |
| GBSS - A | 28ml |
표 1. 버퍼와 간장 별 모양의 세포의 분리에 필요한 효소 솔루션을 제공합니다. 모든 버퍼의 산도는 7.3-7.4로 조정해야합니다. 또한, 모든 버퍼의 무균 여과 권장합니다. 해당 효소 활동에 따라 사용되는 효소의 양을 적응하는 것이 중요합니다.
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Discussion
간장 별 모양의 세포는 간장에 필수적인 생리와 pathophysiological 프로세스를 조절. 또한, 별 모양의 세포가 그들에게 간장 면역 반응의 중요한 구성 요소를 렌더링, 항원 제시 속성을 보유하고 있습니다. 간장 별 모양의 세포가 간 세포에있는 전체 번호 10~15%을 구성하지만, 이러한 세포의 격리는 쭉 내려 가래의 perisinusoidal 공간에서 자신의 로컬 라이제이션으로 인해 도전이다.
여기 현장 소화와 후속 구배 원심 분리에 의해 마우스 간은에서 간장 별 모양의 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 immunologic의 assays에 적합한 매우 순수 별 모양의 세포의 절연을 허용합니다.
고립된 세포의 실체는 별 같은 모양, perinuclear 비타민 A - 저장 지질 vesicles 및 GFAP의 표현을 포함한 간장 별 모양의 세포의 세 가지 주요 특성을 고려하여 조절할 수 있습니다. immunofluorescent 얼룩 및 유동세포계측법에 의해 평가 이러한 기준에 따르면, 설명 프로토콜을 사용하여 얻은 별 모양의 세포가 일상적으로 ~ 99% 순수하고 있습니다. 별 모양의 세포 isolations의 잠재적인 오염 물질은 Kupffer 세포 간 돌기 세포 (DCS)입니다. 따라서, 우리는 표면 분자 F4/80 (Kupffer 세포)와 CD11c (DCS)에 대한 유동세포계측법의 얼룩으로 별 모양의 세포 문화를 분석했다. 따라서, F4/80의 부재 +와 CD11c + 세포가 Kupffer 세포 또는 DC가로 별 모양의 세포 준비 오염을 제외. 따라서 더 이상의 농축이나 정렬 방법 간장 별 모양의 세포 격리 편리하고 빠른 절차에 대한 설명 프로토콜을 렌더링, 필요하지 않습니다.
간장 별 모양의 세포의 실체에 대하여, 그것은 체외 교양 세포에서 활성화 될 것을 명심하고 정지 별 모양의 세포에서 근본적으로 다른 myofibroblasts으로 차별화하는 것이 중요합니다. 이 변형되는 동안, 간장 별 모양의 세포에 의존 GFAP의 표현과 쉽게 체외 문화의 날 7 감지할 수 αSMA을 upregulate. 특히, 체외에서 별 모양의 세포의 활성화 적극 생체내 6들의 활성화 패턴을 유사합니다. 이것은 다른 콜라겐 생산 myofibroblast의 인구가 질병 개발 7 공헌 불구하고 간 섬유증, 예를 들어 그들의 참여에 의해 반영됩니다. 결론하려면 설명 프로토콜에 의해 얻은 간장 별 모양의 세포가 정지 별 모양의 세포뿐 아니라 그들의 차별화 무대에 따라 활성화 간 myofibroblasts에 대한 모델을 제공합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 바이오 메디컬 연구 및 NIH RO1 AI083426 - 01 (FW)에 우수 스미스 가족의 수상에 의해 투자되었다. 패트릭 Maschmeyer와 멜라니 Flach는 Boehringer Ingelheim 재단에서 박사 장학금 지원합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Collagenase P | Roche Group | 11249002001 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11960 | |
| DNase I | Roche Group | 10104159001 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv | |
| EGTA | Fluka | 3777 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Peristaltic Pump | Cole-Parmer | HV-7523-70 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 | |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 | |
| Silicone Tube | Masterflex (Cole Palmer) | HV-96440-14 | |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD Biosciences | 353108 | |
| Winged Infusion Set | Terumo Medical Corp. | 1SV27EL |
References
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- Geerts, A. H. istory heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).
- Gressner, A. M. &, Weiskirchen, R. Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets. J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).
- Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension. Gut. 50, 571-581 (2002).
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