Summary
一回膜貫通ドメイン（TMDS）のオリゴマー化の傾向を評価するための効率的な手順が説明されています。 ToxRに融合されたTMDからなるキメラタンパク質は、大腸菌のレポーター株に発現されています。 TMD誘発性オリゴマーはToxR、転写およびレポータータンパク質の生産、-ガラクトシダーゼの活性化の二量体化を引き起こす。
Abstract
リン脂質二重層で単にアンカーとしてのタンパク質の膜貫通ドメインの極端に簡略化ビューには、誤りであるので、長く持っています。多くの場合、膜貫通タンパク質は、アクションの非常に高度なメカニズムを進化させてきた。膜タンパク質はその構造と機能を調節することができる1〜3つの方法は、構造化された膜貫通のオリゴマーを形成する、疎水性ヘリックスの直接および特定の連絡先があります。4,5多くの最近の作業は6,7は 、それにもかかわらず。優先的に水溶液とドライブの蛋白質の関連付け、異なる分子間力と比較して膜の環境で見つかったアミノ酸の分布に焦点を当てているタンパク質の膜貫通ドメインにおける分子認識の研 究は、まだのものに遅れている水溶性の領域。主要なハードルが残っている：貫通オリゴマー化が達成できる驚くべき特異性と親和性にもかかわらず、それらの関連の8の直接測定が困難です。内在性膜蛋白質機能の研究に適用される伝統的な方法論が検討中のシーケンスの固有の不溶性によって妨げられることができる。膜貫通ドメインを表す合成ペプチドを研究から得られた生物物理学的な洞察は、有用な構造的洞察を提供することができます。しかし、細胞膜を模倣するためにこれらの研究で使用される洗剤ミセルまたはリポソーム系の生物学的関連性はしばしば疑問視され、ペプチドは、これらの条件の下で天然様の構造を採用していないと各機能の動作は、真のネイティブ膜内で作用機序を反映していない？天然のリン脂質二重層の膜貫通配列の相互作用を研究するためには、LangoschラボはToxR転写レポーターアッセイを開発した。関心の9膜貫通ドメインがペリプラズムとToxRの位置については、マルトース結合タンパク質とのキメラタンパク質として発現されるレポートを提供するオリゴマー化のレベル（図1）の。
過去10年間で、いくつかの他のグループ（例：エンゲルマン、DeGrado、シャイ）さらにこのToxRのレポーターアッセイを最適化し適用した。10-13、様々なToxRアッセイは、細胞膜のタンパク質間相互作用をテストするためのゴールドスタンダードとなっています。我々はここに主にLangoschによって開発されたプロトコルを、次の我々の研究室で行われた代表的な実験操作を示す。この一般的に適用できる方法では、E.の膜貫通ドメインの自己会合の解析に有用です。 β-ガラクトシダーゼの生産はTMDオリゴマー化の傾向を評価するために使用される大腸菌 、。 TMD誘発性二量体化すると、ToxRはβ-ガラクトシダーゼのLacZ遺伝子のアップレギュレーションを引き起こすCTXのプロモーターに結合する。比色読み出しはlyzed細胞へのONPGを添加することによって得られる。光吸収の種O - nitrophenolate（ONP）（図2）の産生におけるβ-ガラクトシダーゼの結果によるONPGの加水分解。
Protocol
1。クローニングの考慮事項
- NheIとBamHIの制限部位と5' -リン酸化によって挟ま関心のTMDを表す商業的に作製したオリゴヌクレオチドを順次消化pTox7（直接BamHI制限部位14日以降1塩基対の挿入によって私たちの研究室で修正された）（図3）に連結することができるBamHIおよびNheIで。例のオリゴヌクレオチドを以下に示します。
5'ctagcTMDSEQUENCEg3"
3'gTMDSEQUENCEcctag5"
TMDシーケンスは、12から24残基（より短い配列はおそらくベクトル符号化された疎水性残基により伸長される）でなければなりません。ここで、逐次残渣の挿入とToxRに対するTMDの相対的な回転に付随する残基の欠失の結果TMD設計4つのバリエーションを作成する必要がある、インタフェースを調査するために。最後に15,16は 、アラビノース濃度は0.001と0.01％の間で変化させてください（w / v）の異なるTMD配列の間のβ-ガラクトシダーゼの信号の最大の違いが観察される濃度を識別するために、異なる発現レベルをテストすること、異なる親和性が最高の区別することができる条件を特定することをお勧めします。アラビノースと抗生物質、0.4mMのIPTGに加えて別のTMDSとの間の親和性の違いを高めるために使用することができます。 ToxRの測定は、少なくとも4連で実行する必要があります。全体の手順が異なるプラスミドの変換で少なくとも3回繰り返す必要があります。
2。細菌培養の成長
- 静かに15mlの培養チューブに氷と転送に関するFHK12テントセル（200μl）を解凍します。プラスミドDNA（200 ng）を追加し、30分間氷上で細胞をインキュベートする。
- 42℃で90秒のためのインキュベーションにより、熱ショック細胞℃で2分間氷上でインキュベートしたC、。
- SOCメディア（800μl）を添加し、37℃でサンプルをインキュベート℃で1時間インキュベート振とうしながらC（300 rpm）を
- 三連で15 mlの培養管の形質転換混合物の50μlとクロラムフェニコール（30μg/ mlの）とアラビノース（0.0025％w / v）を、5 mlのLB培地に接種する。 37サンプルをインキュベート℃で20時間攪拌（300 rpm）し振とうしながら（文化の代わりに5μlを96ウェルプレートの培地100μlを接種するために使用することができます。このメソッドは、大量のサンプルを扱うときにエラーが若干高くなるものの、便利です。蒸発を避けるために、つながるとなるメディアとの最も外側の井戸を埋める、エラーが、サンプルのためにそれらを使用しないでください。最後に、蓋およびパラフィルムでプレート間のダブルラップジョイント）。
3。 β-ガラクトシダーゼ活性の測定
- 予熱プレートリーダー〜28℃の
- 上段（水層）をのみ取ることを確認しながら、大規模なピペットの先端でリザーバにZ -バッファを転送します。 96ウェルプレートのウェルに調製したばかりのZ-buffer/chloroformの100μlを移す。 4部プレートのウェルに各培養液5μlを移す。ブランクとなる4つのウェルから培養を省略します。
- 細胞密度を決定するためにプレートのOD 595を測定します。
- プレートの全ウェルにZ-buffer/SDSの50μlを追加します。細胞をlyzeに10分間プレートリーダーでプレートを振る。細胞懸濁液は、溶解後に明確であり、必要に応じて揺れのステップを繰り返すことを確認してください。不完全な溶解はZ-buffer/chloroformが新しく調製されていない示唆している。
- たてのすべてのウェルにZ-buffer/ONPG準備50μlを加え20分間毎に30秒プレートリーダーと測定OD 405にプレートを返します。
- 次式を（空白を減算することに注意してください）を使用してβ-ガラクトシダーゼ活性を算出する。 OD 405 /分の比率は、線形モデルのフィットを用いてOD 405の範囲0.0から1.0までのすべてのデータポイントを使用して計算する必要があります。
別の日に記録したときにミラーユニットは異なることがあります。したがって、GPAなどの基準の構造は、各試験で測定する必要があります。その値はToxR値の正常化に使用することができます。
4。タンパク質発現のための制御
- 西洋では構成要素間でも、タンパク質の発現を確認するためにブロッティング行います。微量遠心機で三連の文化や遠心50μlの（2000回転、4分）を組み合わせる。ピペッティングにより上清を除去し、2 ×サンプルローディングバッファーに残留ペレットを再懸濁します。
- 標準的な8％のゲルは7.5μLをロードし、1時間5分間125 Vで電気泳動を行う。転送後、抗MBP HRP標識抗体とインキュベートし、可視化、キメラタンパク質は時々48 kDaの周りに見られるいくつかの分解生成物と約70 kDaので観察される。内因性のMBPは、45 kDaの（図5を参照）で観察される。
5。適切な膜挿入のための制御
マルトース結合タンパク質の欠損細胞株は、キメラTMD構築物の適切な膜の挿入を評価するために使用されます。唯一の炭素源としてマルトースと最少培地で増殖させた場合、正常にペリプラズムにあるマルトース結合タンパク質と膜積分発現産物を発現する細胞のみが成長することができます。
- PD28のセルを（FHK12セルの説明と同様に）変換し、LB培地2 mlを接種する。 37細胞を成長° Cを一晩（300 rpm）し振とうしながら。
- ペレットは、3500 rpmで遠心分離により細胞を、10分、4℃と大きい先端または穏やかにボルテックスで穏やかにピペッティングによりPBS（2ml）に再懸濁により洗浄。ペレットは、細胞（上記のような）、二度目のPBSで洗浄、ペレット、最後にPBS（1 ml）に懸濁します。
- 37三連とインキュベートで5ミリリットル最少培地に接種するために再懸濁した細胞を25μlを使用して° C（300 rpm）し振とうしながら。プレートリーダーを用いて96ウェルプレートや読書に各サンプルの200μlを転送することにより、15〜25時間の間にOD 595の測定値、約2時間ごとにかかります。
6。代表的な結果：
図4に示すように膜貫通ドメインのオリゴマー化の傾向を分析するToxR転写レポーターアッセイの使用の例。以前に我々はToxRを含む様々な技術によってmultispanning膜積分タンパク質の潜在的な膜タンパク質- 1（LMP - 1）からの膜貫通ドメインのオリゴマー化を検討した14の膜貫通ドメイン5つが（TM5）オリゴマー化する強い傾向を示すことが示された。これは、陽性対照に匹敵する高いミラーユニット、、GPA、十分に確立された二量化シーケンスで示されています。 TM5の有害な突然変異、D150Aは、オリゴマー化するシーケンスの能力を低下させる。 LMP - 1 TM1は大幅にオリゴマー化せず、ただブランク、非形質転換FHK12細胞のための信号の上に、非常に低いミラーユニットの信号を示す。
ToxRのレポーターアッセイを描いた図は、1。漫画。膜貫通ドメイン（TMD）はToxR および LacZ の転写の活性化の二量体でオリゴマー化の結果を駆動する。 LacZの遺伝子産物は、β-ガラクトシダーゼは、オリゴマー化するTMDの傾向の尺度として定量することができる。
図2。光吸収種のo - nitrophenolate（ONP）の製造におけるβ-ガラクトシダーゼの結果によるONPGの加水分解。
図3。pToxR7のプラスミドマップ。
図4代表ToxR転写レポーターアッセイは、潜在的な膜蛋白質A - 1の膜貫通ドメインのオリゴマー化の傾向を分析する。膜貫通領域1（TM1）は唯一の弱い相互作用を示すながら貫通ドメイン5（TM5）は、強くoligomerizes。 TM5の突然変異のD150Aは大幅にオリゴマー化する能力が減少します。 GPAは、強い二量化のための正の制御シーケンスとして含まれています。空白は非形質転換FHK12セルを表します。
図5。タンパク質発現のウエスタンブロット。
図6。ペリプラズムへの適切な膜の挿入のために制御するPD28相補アッセイ。ネガティブコントロールは、マルトース結合タンパク質の欠損構造を表します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ToxR転写レポーターアッセイでは、オリゴマー化する可能性と膜貫通配列を同定するために手軽な方法です。相互作用が細菌の内膜内に発生しているので、このアッセイは、細胞膜模倣環境でシステムを研究の妥当性に関連する問題を回避することができます。単一のプラスミドに複数のTMDSのクローニングを容易に並列に行うことができ、全体のアッセイは96ウェルプレートフォーマットで行うことができることを考えると、このアッセイは、タンパク質配列の多数のハイスループット解析に使用することができます。17いったん相互作用が検出された、キーの機能残基が関与する構造的特徴のマッピングを可能にする、変異解析によって調べることができます。多くの場合、膜貫通型タンパク質の結晶構造解析は、機能の分子基盤を確立するためにそのようなToxRアッセイなどの代替ツールを必要とする、問題があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、国立衛生研究所を（1R21CA138373感謝し、この作品の金融支援のためのがん（SU2C）にスタンドアップ。HYのためのシドニーキンメル財団からのがん研究、キンメルScholarの賞の協会から2009年エリオン賞に感謝です。がん研究（SKF - 08 - 101）、および国立科学財団の学部初期のキャリア賞（NSF0954819）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI restriction enzyme | Invitrogen | 15201023 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| NheI restriction enzyme | Invitrogen | 15444011 | Invitrogen enzymes were found to be more efficient than alternative suppliers |
| 15 mL culture tubes | Fisher Scientific | 14-956-1J | |
| SOC media | TEKnova, Inc. | S0225 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| LB media | Sigma-Aldrich | L7275 | Made up to the appropriate volume and sterilized by autoclaving. |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | CO378 | Stock solution of 30 mg/ mL in ethanol stored in freezer |
| Arabinose | Fluka | 10839 | Stock solution of 2.5% (w/v) in water stored in freezer |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6858-06 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Sodium dodecylsulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 2-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside (ONPG) | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Z-buffer | 16.1 g Na2HPO4 5.5g NaH2PO4 0.75g KCl 0.246g MgSO4 Make up to 1 l, pH 7.0 |
||
| Z-buffer/chloroform | 200 mL β-mercapt–thanol, 2 mL chloroform, make up to 20 mL with Z-buffer. Vortex for 1 min, centrifuge for 1 min at 800 rpm. Make fresh for each plate. | ||
| Z-buffer/SDS | 160 mg SDS dissolved in 10 mL Z-buffer | ||
| Z-buffer/ONPG | 40 mg ONPG in 10 mL Z-buffer. Make fresh for each plate | ||
| β-mercapt–thanol | Calbiochem | 444203 | |
| Anti-MBP monoclonal antibody (HRP conjugated) | New England Biolabs | E8038S | |
| Minimal media with maltose | 1 x M9 salts, 0.4% maltose, 1 mg/ mL thiamin, 2 mM MgSO4 | ||
| 96-well flat bottom plate | Sarstedt Ltd | 83.1835.300 | |
| Plate-reader | Beckman Coulter Inc. | DTX880 Multimode Detector | |
| Water bath | VWR international | 89032-204 | |
| Shaking incubator | Forma Scientific |
References
- Parker, M. S. Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices. Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).
- Mo, W., Zhang, J. T. Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).
- von Heijne, G. Membrane-protein topology. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).
- Van Horn, W. D. Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase. Science. 324, 1726-1729 (2009).
- Hattori, M. Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis. Embo J. 28, 3602-3612 (2009).
- Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. Amino acid distributions in integral membrane protein structures. Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).
- Deber, C. M., Goto, N. K. Folding proteins into membranes. Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).
- Gerber, D., Shai, Y. In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane. J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).
- Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p, Fritz, H. J. Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator. J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).
- Russ, W. P., Engelman, D. M. TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).
- Berger, B. W. Consensus motif for integrin transmembrane helix association. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).
- Oates, J., King, G., Dixon, A. M. Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions. Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).
- Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins. J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).
- Sammond, D. W. Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1. , Forthcoming (2010).
- Li, R. Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes. J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).
- Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper. J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).
- Finger, C., Escher, C., Schneider, D. The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions. Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).
