Summary
该协议提供克隆细胞系的选择和钙生物发光检测，以分析其同源GPCRs的合成节肢动物神经肽的构效关系的说明。此法可用于受体deorphanization和构效关系研究合成的模拟设计和肽/药物导致发现。
Abstract
节肢动物激素受体调节许多重要的生理和行为的过程，因为他们的新农药的潜在目标。其中大部分属于G蛋白偶联受体（GPCRs）超家族。我们一直专注于描绘从蜱和蚊子节肢动物激肽受体。节肢动物激肽与myotropic，利尿，和神经递质功能的多功能神经肽。在这里，为昆虫激肽的结构 - 活性关系系统的分析方法上两个异肽受体表达系统的描述。我们myotropic，利尿，和/或虱子和蚊子的消化过程可能破坏生物稳定性的激肽类似物的发展提供了重要的相关信息。
从南部的牛蜱， 小牛蜱microplus（Canestrini），和蚊子埃及伊蚊 （林奈），激肽受体稳定表达的哺乳动物细胞系CHO - K1。完成了这些受体的功能分析使用的钙的生物发光板检测措施细胞内的生物发光后肽的应用程序，这些重组细胞的细胞质中钙的含量来确定。这个方法需要的aequorin蛋白的优势，从发光水母中分离出一种photoprotein。我们aequorin质粒（mtAEQ/pcDNA1）瞬时转染稳定表达激肽受体的细胞株。这些细胞，然后用辅助因子腔肠，复合物与细胞内aequorin。这个键断裂中的钙存在，发光指示的钙离子浓度的发光水平。由于激肽受体通过细胞内钙离子的释放的信号，信号强度相关肽的药效。
此协议是一个合成几个先前所描述的的协议进行了修改，它提出通过功能板块分析（Staubly等人，2002年和马厩等 ，1997年在哺乳动物细胞系的稳定，对GPCRs的表达一步一步的指示。 ）。使用这种方法，我们能够建立稳定的细胞系表达的蚊子和蜱激肽受体，比较三个蚊子激肽的药效，确定配体 - 受体相互作用的关键氨基酸位置，并执行半通量筛选肽库。由于昆虫激肽容易快速内源性肽酶降解，它们在使用中受到严重限制为控制虫害或内分泌学研究的工具。因此，我们还测试了含氨基异丁酸（AIB），以提高其效力和生物稳定性的激肽类似物。这种肽抗模拟在生物稳定昆虫激肽类似物发展的一个重要的带头作用，并可能在神经肽为基础的节肢动物控制策略的发展援助。
Protocol
1。建立稳定的细胞系
- 克隆GPCR的利益，并把它插入到一个表达载体，结合各地的起始密码子在哺乳动物系统的最优核糖体结合“（科扎克，1986）5'科扎克一致序列（GCCA / GCCATGG）。在这里，我们使用的蚊子激肽受体 （Holmes等，2003; Pietrantonio等，2005）。打勾激肽受体的质粒pcDNA3.1/Bm-KR，质粒pcDNA3.1/Aedae-KR。的pcDNA3.1（ - ）向量编码氨苄青霉素抗性选择在哺乳动物细胞中的细菌和新霉素（G418）电阻的选择。
- 成长的CHO - K1空单元格（不含质粒）（ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯，美国）或其他所需的细胞株中的T - 25烧瓶（BD猎鹰）在37 ° C（在5％ 二氧化碳培养箱Holmes 等 ，2003）。除另有指明外，所有进一步孵化，在这些情况下应该做的。保持生长介质中的空细胞（10％胎牛血清的F12K培养基）1X抗生素Antimycotic（Invitrogen公司，CA）。
- 要拆分单元格，温暖了所有的解决方案，以37 ° C删除旧的T - 25烧瓶中，用5 mL PBS冲洗，然后取出PBS。 trypsinize细胞，加2毫升PBS胰蛋白酶- EDTA（34毫升PBS，2毫升7.5％的碳酸氢钠，4毫升10X胰蛋白酶EDTA）2分钟。加入3毫升培养基和抽吸介质向上和向下混合细胞。传输介质与细胞成一个锥形管和离心2分钟〜200-300克（1000转）。弃上清，在5毫升培养基重新悬浮细胞。稀释悬浮细胞，以1:5或1:10的新鲜培养液的浓度，并转移在一个新的T - 25烧瓶5毫升。
- 后细胞茁壮成长（2-3天左右），种子成的T - 25的组织培养瓶中的CHO - K1细胞和不含抗生素的增长它们在生长培养基过夜，直到他们在30％左右汇合（约18小时）。可通过倒置荧光显微镜下观察细胞的汇合程度。
- 对每一个样品的准备下面的混合物：
- 结合1-2微克DNA（例如：使用265μg/μlpcDNA3.1/Aedae-KR4μl）100μLOPTI - MEM我降低血清培养基（Invitrogen公司）。
- 混入100μLF12K无血清培养6μL脂质体试剂（InvitrogenTM），比例为1:1的脂质体的DNA。在室温下孵育30-45分钟。
- 从细胞中移除旧的生长介质，并用5毫升F12K无血清培养的细胞，然后取出F12K无血清培养。在15毫升管，轻轻混匀到1.8毫升新鲜F12K培养基转染混合物在下拉明智的时尚。然后，从步用PBS 1.5洗涤细胞，并添加新的细胞转染的解决方案。孵育18小时。
- 更改介质F12K不含抗生素中加10％胎牛血清和孵育过夜。分割成两个T - 25烧瓶F12K培养基，加不加抗生素，另外18小时10％胎牛血清（分裂的细胞，请参见步骤1.3）的细胞。
- 更换介质的选择性培养基（F12K培养基加上10％胎牛血清，800μg/mlGENETICIN Invitrogen公司）。使用3-4周的选择性培养基对培养细胞。随着时间的推移，这将选择有稳定纳入到他们的基因组DNA质粒的细胞。继续保持细胞维持液（F12K培养基加上10％的胎儿与GENETICIN400μg/ml牛血清）。定期冻结冻结媒体（20％二甲基亚砜的选择性培养基）以1:1的比例，以防止意外污染的情况下失去的细胞株。
- 选择克隆的细胞株：作为第一步，trypsinize和离心机在步骤1.3中的细胞维持液1.8步。重新悬浮细胞，在维持液5毫升，0.5毫升的细胞暂停，并添加4.5毫升新鲜的维持液作10倍稀释。转移到96孔板，12口井的10倍稀释，每孔加入100μL选择单细胞。
- 继续使这些细胞的10倍连续稀释100μL的每一个细胞（最终稀释度通常将在10 -11 10 -19;总人数的10倍连续稀释 〜19）的最后一个理论悬挂。紧随每个稀释度，转移到96孔板，12口井100μL的稀释。经过18小时的潜伏期，观察下一个倒光或荧光显微镜和标记井，似乎只包含一个单细胞，或包含，显然是从一个单细胞分成两个细胞的96孔板。保持每三天观察每天和改变介质。
- 当井是80％confluENT（约一周），与200μLPBS冲洗标记的水井和trypsinize与100μLPBS胰蛋白酶- EDTA溶液。转移到一个6孔板，用1 ml维持液标记每个细胞。这些细胞成长为3天，然后转移到个人的T25烧瓶细胞。测试这些细胞使用钙激动剂肽（请参阅第2节）生物发光检测。
- 选择1细胞中的钙的生物发光板检测的最高响应1.11步骤线，并执行第二次单细胞选择以下步骤1.9-1.11。定期冻结的细胞株。
- 从步骤1.12所述的二次选择，选择2-3个细胞系中的钙的生物发光板检测的最高响应，并保持他们的文化，为进一步钙的生物发光板检测。跟踪通过号码。不时，从早期的通道冻结的细胞系，这样你可以随时回去给他们，如果有更多的通道细胞系一贯停止执行。
2。钙的生物发光板检测
- 结扎成记者感兴趣的基因的表达载体。在这里，我们使用aequorin质粒mtAEQ/pcDNA1（从博士。CJP Grimmelikhuijzen和丹麦哥本哈根大学的迈克尔威廉姆森，礼物）。变换在大肠杆菌中的质粒大肠杆菌细胞MC1061/PS（Invitrogen公司），净化他们使用QIAprep自旋小量制备试剂盒（QIAGEN公司） 。在最后一步洗脱无EDTA的，没有水用Tris缓冲质粒。
- 种植步骤1.13细胞株，表达所需的受体在维持液。当细胞90％汇合，trypsinize，离心机，然后再暂停在步骤1.3维持液5毫升的细胞。显微镜下细胞计数（亮线Hemacytometer）稀释细胞（约维持液的10倍），计数细胞数。调整细胞数约为2 × 10 5细胞/毫升（平均20个细胞，在9个方格中的一个显示在Hemacytometer）。种子2毫升稀释细胞在媒体到六孔板的每个孔。孵育24小时（细胞应达到约60％汇合后孵化）。
- 更改OPTI - MEM培养基中6井板的媒体。每口井，混合96μLOPTI - MEM 4μLFuGENE 6转染试剂（罗氏生物化学）在离心管中，并让在室温下坐了5分钟。添加到每管1微克aequorin / pcDNA 1质粒DNA，然后轻轻摇动1分钟的样品，在室温孵育15-20分钟。在滴加方式添加每个混合物，同时轻轻摇晃孔板每孔。 6小时孵育板和改变F12K无抗生素的培养基中含有10％胎牛血清的介质。
- 在6孔板中的细胞24小时后孵化，trypsinize，离心和重新悬浮细胞作为第1.3步。计数的细胞数40万细胞/毫升步骤2.1，并转移到每孔96孔白色薄底部微孔板（中光学3610）100μL（共40000 cells/100μL）。孵育24小时，直到大约80％的细胞汇合。这是生物发光检测细胞的最佳浓度。
- 钙的DMEM媒体在黑暗中含有5微米腔肠（Invitrogen公司）（Invitrogen）的准备（腔肠90μl/well是光敏感）。从2.4板，删除旧的媒体，并添加到每孔90μl。孵育3小时在黑暗中板在37 ° C和5％的CO 2，之后，在板的细胞准备进行测试。
3。仪器操作和数据分析
- 每个生物发光酶标仪是不同的。我们执行我们的实验使用NOVOstar（BMG Labtechnologies）bioluminensence模式酶标仪。如果您使用不同的仪器，你必须适应的协议。
- 在使用前清除酶标仪泵（或总理泵）。板固定板之前关闭在房间里的光线。一旦该板块的持有人已关闭，关闭的灯。
- 肽（在1.5 mL Eppendorf管）溶解在无钙DMEM媒体。设置“吸深度”和“定位”，使用前肽的解决方案。挑战10μL不同的肽浓度（FFFSWG - NH2，白，K1 - 3，或其他所需的肽）（10倍）的细胞，并立即开始录制的光发射。我们已建立记录每口井，每2秒的总时间为50秒的光发射（465 nm）的仪器。
- 确保包括阳性对照，如积极的模拟（模拟FFFSWGa已被使用，塔内加- 巴盖什沃尔等，2009）和向量只转染的细胞，如阴性对照。阴性对照将在数据分析的必要设置基线的阈值（见代表性的结果）。一个不相关的，非活性肽也可以增加一条，作为阴性对照。
- 运行完成后，洗净的仪器泵（或总理泵），然后把你的下一个肽样品。保存您的数据，并再次冲洗泵。
- 数据处理：光发射的数据传输到Microsoft Excel数据表，从每口井。
- 粘贴的数据从Excel Prism软件GraphPad软件公司（美国加利福尼亚州圣迭戈，）4.0。各肽浓度是X轴和生物发光单位是Y轴的。要正常化的数据，绘制日志响应曲线。选择一个非线性回归曲线拟合的分析（S形的剂量 - 反应方程可变斜率），以获取每个肽的浓度反应曲线。该方案地块最终的价值和让欧共体50。
- 每次实验应重复进行数据分析的3倍。
4。代表性的成果：
蚊子埃及伊蚊激肽受体的CHO - K1细胞中表达时，表现为multiligand受体和功能三个endogenours白激肽，激肽1-3 Aedae为1 nm的低浓度，测试单独使用钙的生物发光板检测。图1显示了效力的排名顺序获得Aedae - K - 3> Aedae - K - 2> Aedae - K - 1，根据各自的 EC 50值Aedae - K - 3，16.04 NM; Aedae - K - 2，26.6 nm和Aedae - K - 1，48.85纳米，有统计学显着性差异（P <0.05）（Pietrantonio 等 ，2005）。
我们也采用了这种检测，以确定哪些肽残留量激肽的肽受体相互作用的关键。昆虫肽肽C端五肽，又称为核心的生物活性，所需的最小序列。表1，激肽的肽核心类似物合成的核心肽五肽FFSWGa丙氨酸更换系列和钙的生物发光板检测（塔内加-巴盖什沃尔等，2006）测试。我们发现，1苯丙氨酸和色氨酸的氨基酸，两种受体的昆虫激肽的活性至关重要。
该试剂盒还可以用来测试加强生物稳定性设计的肽。表2显示含有氨基异丁酸（AIB）蜱重组激肽受体和图2测试设计的肽类似物，显示上打勾肽钙CHO - K1细胞表达的受体的6个α-氨基异丁酸类似物的活性比较生物发光板法（塔内加-巴盖什沃尔等 ，2009）。六肽模拟FFFSWGa添加为受体活性的阳性对照。模拟FF [AIB] WGA导致比这六肽控制模拟较为活跃。两个aminoisobutyric酸的替代品，[AIB] DT [AIB] WGA，模拟测试（表2和图2）的双取代类似物的最有力的。
这个实验已可应用于见Nachman和Pietantonio（2010），Nachman 等更多的例子。 （2009年），塔内加-巴盖什沃尔等 。 （2008A），塔内加-巴盖什沃尔等 。 （2008B）。
图1。估计白激肽CHO - K1钙的生物发光板检测E10细胞的有效浓度（EC 50）。浓度反应曲线的Y轴是从每个观察到的最大反应的百分比表示的生物发光单位肽。数据点代表平均在3次独立实验获得六个复制。酒吧代表标准错误。 （一）估计Aedae - K1 EC 50 = 48纳米。 （二）估计Aedae - K2 EC 50 = 26纳米。 （三）估计Aedae - K3 EC 50 = 16纳米。欧共体50 Aedae - K3 <欧共体50 Aedae - K2 <欧共体50 Aedae - K1，P <0.05。 GraphPad棱镜4.0软件统计分析和图形。
图2。蜱激肽受体表达CHO - K1细胞钙的生物发光板检测的6个α-氨基异丁酸类似物的活性比较。Y轴代表观察到的生物发光的浓度百分比表示每个模拟％ ，最大的生物发光单位与观察每个模拟测试的所有浓度之间的最大响应。 GraphPad棱镜4.0软件进行统计分析和图形。
| 勾选受体细胞系 | 蚊子受体细胞系 | 肽 | 欧共体50（NM） | 1毫米的最大的生物发光反应 | 欧共体50（NM） | 1毫米的最大的生物发光反应 | |||
| AFSWGa | 我 | 我 | 我 | 我 | |||||
| FASWGa | 586 | 5600 | ND | 400 | |||||
| FFAWGa | 64 | 12800 | 621 | 3050 | |||||
| FFSAGa | 我 | 我 | 我 | 我 | |||||
| FFSWAa | 417 | 10600 | 2800 | 1830 | |||||
| FFSWGa | 590 | 10800 | ND | 525 | |||||
| FSWGa | 我 | 我 | 我 | 我 | |||||
| FFSWa | 我 | 我 | 我 | 我 | |||||
| FFSWG - OH | 我 | 我 | 我 | 我 | |||||
| FFFSWGa | 259 | 13000 | 562 | 万 | |||||
| FF [AIB] WGA | 29 | 12700 | 445 | 9300 | |||||
表1。估计的效力（EC 50）和最大的生物发光反应，蜱及蚊虫受体转染细胞系的所有测试肽*.
*欧共体50估计诱导半最大反应所需的浓度。我：无效，如果生物发光反应是少于300个单位（矢量只转染的细胞水平）。答：肽FFSWGa各自的残留物已被丙氨酸取代的位置。 ND：模拟测试，但要么不十分活跃或不活跃，在较低molarities，从而不能确定的EC50。
| K - AIB - 1 | [AIB] DT [AIB] WGA |
| K - AIB - 2 | [αMEF] DT [AIB] WGA |
| K - AIB - 3 | AC - R [AIB] DT [AIB] WGA |
| K - AIB - 4 | AC - R [β3F] DT [AIB] WGA |
| K - AIB - 5 | [AIB] RFF [AIB] WGA |
| K - AIB - 6 | [AIB - AIB - AIB - AIB] RFF [AIB] WGA |
表2。肽类似物（K）的含有氨基异丁酸（AIB）测试上打勾重组激肽受体。 AC：乙酰;α我：α甲基-苯丙氨酸;β3F：β3-苯丙氨酸;一个：酰胺。
Discussion
我们能够执行的蛛形纲（蜱，螨虫和蜘蛛），蜱激肽受体的发现的神经肽受体的功能特性，使用该协议。这种方法有三个主要的应用。第一，这项技术可应用于配基活性受体通过测量deorphanization。二，法可以解决配体 - 受体结构 - 活性关系（SAR）。三，方法可用于药物发现。此外，该协议可用于研究活动在几乎所有的GPCR受体激动剂或拮抗剂。我们开始筛选小型图书馆，以适应本议定书。我们利用该细胞系不表达无处不在的G 蛋白摹16。我们并不需要它，因为节肢动物激肽受体的信号通过Gq蛋白和细胞内钙离子级联和他们保存在哺乳动物细胞中的信号属性，如下所示。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
博士。 CJP Grimmelikhuijzen，从丹麦哥本哈根大学（丹麦）和迈克尔威廉姆森赞赏提供aequorin质粒。我们的合作者，罗纳德J博士Nachman ARS，USDA（美国德克萨斯州），是公认的肽合成和提供NOVOstar酶标仪。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| CHO-K1 cells | ATCC | CCL-61 | Manassas, VA, USA |
| F12K medium | Invitrogen | 21127 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F0643 | |
| Trypsin-EDTA (10x) | Invitrogen | 15400 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectin Reagent | Invitrogen | 18292-011 | |
| GENETICIN | Invitrogen | 10131035 | |
| MC1061/P3 Ultracomp | Invitrogen | C663-03 | |
| QIAprep spin miniprep kit | Qiagen | 19064 | |
| FuGENE 6 Transfection reagent | Roche Group | 11 814 443 001 | |
| 96-well white thin bottom microtitere plate | Costar | 3610 | |
| calcium-free DMEM media | Invitrogen | 21068 | |
| C–lenterazine | Invitrogen | C-2944 | |
| Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | Horsham, PA | |
| NOVOstar | BMG Labtechnologies | ||
| Prism software 4.0 | GraphPad Software Inc. | San Diego, CA, USA | |
| T-25 and T-75 Flasks | BD Biosciences | 353014 and 353135 |
References
- Kozak, M. An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Research. 15, 8125-8148 (1987).
- Nachman, R., Pietrantonio, P. V. Interaction of mimetic analogs of insect kinin neuropeptides with arthropod receptors. Neuropeptide systems as Targets for Parasite and Pest Control. Geary, T. , Landes Bioscience. Madamme Curie Library. (2010).
- Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V., Coast, G. M. Towards the development of novel pest management agents based upon insect kinin neuropeptide analogs. Annals of the New York Academy of Sciences. , 1163-11251 (2009).
- Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Isaac, R. E., Coast, G. M., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Biostable agonists that match and/or exceed the activity of insect kinins on recombinant arthropod GPCRs. General and Comparative Endocrinology. 162, 122-128 (2009).
- Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Kaczmarek, K., Zabrocki, J., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Comparison of insect kinin analogs with cis-peptide bond, type VI-turn motifs identifies optimal stereochemistry for interaction with a recombinant arthropod kinin receptor from the southern cattle tick Boophilus microplus. Peptides. 29, 295-301 Forthcoming.
- Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Williams, H., Reyes-Rangel, G., Juaristi, E., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Identification of selective and non-selective, biostable beta-amino acid agonists of recombinant insect kinin receptors from the southern cattle tick Boophilus microplus and mosquito Aedes aegypti. Peptides. 29, 302-309 Forthcoming.
- Taneja-Bageshwar, S., Strey, A., Zubrzak, P., Pietrantonio, P. V., Nachman, R. J. Comparative structure-activity analysis of insect kinin core analogs on recombinant kinin receptors drom southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) and mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 62, 128-140 (2006).
- Pietrantonio, P. V., Jagge, C., Taneja-Bageshwar, S., Nachman, R. J., Barhoumi, R. The mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is a multiligand receptor for the three Aedes kinins. Insect Molecular Biology. 14, 55-67 (2005).
- Holmes, S. P., Barhoumi, R., Nachman, R. J., Pietrantonio, P. V. Functional analysis of a G protein-coupled receptor from the Southern cattle tick Boophilus microplus (Acari: Ixodidae) identifies it as the first arthropod myokinin receptor. Insect Molecular Biology. 12, 27-38 (2003).
- Staubli, F., Jorgensen, T. J. D., Cazzamali, G., Williamson, M., Lenz, C., Sondergaard, L., Roepstorff, P., Grimmelikhuijzen, C. J. P. Molecular identification of the insect adipokinetic hormone receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 99, 3446-3451 (2002).
- Stables, J., Green, A., Marshall, F., Fraser, N., Knight, E., Sautel, M., Milligan, G., Lee, M., Rees, S. A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein coupled receptor. Analytical Biochemistry. 252, 115-126 (1997).
