Summary
Простой метод определения приоритетных бактериальных патогенов является использование генной инженерии репортер фага. Эти репортер фага, которые являются специфическими для их конкретных видов хозяев, способны быстро трансдуцирующих биолюминесцентного ответный сигнал к клеткам хозяина. Здесь мы опишем использование репортер фага для обнаружения
Protocol
1. Y. Pestis пластины прививки
- Подряд Y. Pestis A1122 (BeiResources # NR15) фондовых культур на Лурия-Бертани (LB) агар (Миллер). Использование стерильных и выполнять все Y. Pestis манипуляций в класс типа II биобезопасности кабинета. Y. Pestis A1122 является уровень биобезопасности (BSL) 2 исключены выбрать штамм агента. Ей не хватает и 75 кб пару низкокальциевой ответа (LCR) плазмиды вирулентности, и локус PGM, которые необходимы для вирулентности. Расти Y. Pestis при 28 ° С в течение 48 ч в статическом контролем температуры воздуха инкубатора. Темпы роста Y. Pestis медленно с периодом в 1,25 ч 9.
2. Y. Pestis жидких сред прививки
- Передача одного Y. Pestis колонии в стерильный 17 х 100 мм в пробирку с 2 мл LB бульоне использованием стерильной петлей прививки металла. Выберите колонии, которая приблизительно одинаковыми по размеру, свидетельствует о других колоний, и четко отделены от остальной колонии на пластине. Вихревые трубки кратко и выращивать культуры при 28 ° C в течение примерно 20 часов в инкубатор встряхивания (225 оборотов в минуту).
3. Y. Pestis результат, кроме репортера фага, и биолюминесцентного обнаружения
- Развести ночь Y. Pestis культуры 1:20 на свежий бульон LB в 50 мл сокола трубки (например, 500 мкл клеток в 9,5 мл среды) и расти при 28 ° C при встряхивании (225 оборотов в минуту). Вырасти до оптической плотности при 600 нм (600) от 0,2 достигается (около 5 ч). Активно растущие клетки являются более предпочтительными для обнаружения так как способность фагов для трансдукции биолюминесцентного ответ коррелирует с жизнеспособностью и приспособленность бактерий хозяев. Тем не менее, система обнаружения было показано, чтобы быть совместимым с клеток, полученных на всех этапах цикла роста 7.
- Создание подложки необходимо для биолюминесцентного реакции путем подготовки 2% н-деканский решение. Смешайте 200 мкл н-деканский с 9,8 мл LB бульоне. Vortex энергично в течение 5 секунд Премьер микропланшет люминометра инжектор с 2 мл 2% н-деканский решение. Предустановленные люминометра к autoinject 67 мкл деканский решение каждого микропланшета хорошо, а затем сразу же читать образца в течение 10 с
- Внесите 1 мл аликвоты LB бульоне на 3 трубы культуры. Добавьте 20 мкл фондовом репортер фага решение (запас 5 х 10 9 бляшкообразующих единиц [PFU] / мл) в каждую пробирку; фага и средств массовой информации только образцы выступает в качестве отрицательного контроля. При отсутствии Y. Pestis клеток, добавление фага репортер не должен вызывать биолюминесцентного отклика.
- Внесите 1 мл аликвоты Y. Pestis культуры (с шагом 3,1) на 6 труб культуры. Добавьте 20 мкл фондовом фага репортера по 3 из культур (тест-культур). Остальные 3 культур служить "клеток одиночку" отрицательный контроль (фон autobioluminescence). Смешайте культур вортексе кратко, и урожай 200 мкл из каждого образца (на данный момент 0 чтение) и обойтись в белый 96-луночного планшета. Инкубируйте остальные культуры при 28 ° C при встряхивании (225 оборотов в минуту).
- Мера времени 0 образцы для биолюминесценции (относительные световые единицы, РГ), используя планшет люминометра.
- Урожай 200 мкл каждого образца после 10, 20, 30, 40, 50 и 60 мин после репортер фага Кроме того, и измерять образец для биолюминесценции. Если Y. Pestis клетки присутствуют, репортер фага будет специфически связываться с клетки, вводят его ДНК, а также использовать хостов транскрипции и трансляции машины, чтобы расшифровать и перевести luxAB гены репортера (рис. 1).
- Сила сигнала и сигналов времени ответа пропорциональна числу клеток присутствует. При высоких концентрациях клеток (10 5 -10 8 КОЕ / мл), значительное увеличение РГ сравнению с контрольной группой должны быть очевидны в течение 20 мин. При более низких концентрациях клетки, (10 2 -10 4 КОЕ / мл), значительное увеличение РГ должны быть очевидны в течение 40-60 мин.
- Кроме того, для ускорения процесса обнаружения без необходимости Y. Pestis нарост, из колонии только что выросли пластина может быть смешанной (по вортексе) непосредственно в 1,5 мл Eppendorf трубка с 200 мкл LB бульоне укрывательство репортер фага. Внесите клеток / фага смесь в лунку планшет. Инкубируйте планшет при 28 ° C и читать образец для биолюминесценции через 60 мин (в одной точке времени только).
4. Представитель результаты:
Представитель эксперимента конечно время репортер фага опосредованного обнаружения Y. Pestis изображен на рисунке 2. Отрицательного контроля: 1) фага в одиночку (нет клеток), или 2) клетки в одиночку (не фага) базовых уровней по биолюминесценции около 20 РГ протяжении 60 мин вклubation (базовые уровни люминометра специфические). С другой стороны, увеличение биолюминесценции для испытания образцов (фаг репортер и клеток) очевидна на 15 минут после того фага. Сигнала должна возрастать более чем на 60 мин. Инкубацию в течение длительного периода времени (более 80 мин), приведет к сигнал, который будет снижаться по сравнению с пиковым сигнала из-за фага опосредованный лизис клеток-хозяев. Аналогичные результаты получены при инкубации температуре 37 ° С, хотя оптимальная температура для Y. Pestis роста составляет 28 ° C 9.
Рисунок 2. Фаг-опосредованной биолюминесцентного выявления Y. Pestis. В момент времени 0, фаг репортер и клетки были смешаны, инкубировали при 28 ° C, и биолюминесценции (РГ) было наблюдать во времени. Значительное увеличение РГ (* Студенты т-тест, р <0,05), очевидно, в течение 15 мин.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод демонстрирует способность репортер фага для оперативного выявления Y. Pestis с репортером фага может преобразовывать биолюминесцентного ответный сигнал, культурный Y. Pestis клетки в течение 20 минут после того фага. Репортер фага также способен непосредственно обнаружения Y. Pestis в клинической матриц, без условием выделения и последующего культивирования 7. По сравнению с стандартными фага лизис анализов, которые обычно требуют 48 часов для завершения, это значительно уменьшает время обнаружения.
Предыдущие исследования показали, что дикого типа ΦA1122 фага может лизировать почти все природные Y. Pestis изоляты, и "специфические" для Y. Pestis 6,10,11, однако некоторые Y. псевдотуберкулеза штаммов было показано, что ΦA1122 восприимчивы при выращивании при температуре выше 20 ° C 6,10,12. Причина чувствительных к температуре дифференциальная восприимчивость неизвестна, но предположительно из-за температурных изменений в клеточной поверхности слоев / композиции. Таким образом, потенциал предостережение системы обнаружения фага репортер возможность ложно-положительный отклик со штаммами из близкородственных видов Y. псевдотуберкулеза. Выполнение анализа репортер фага на ограничительные температуры (20 ° С) предотвращает ложное срабатывание сигнала в образцах, которые могут содержать Y. псевдотуберкулеза. Таким образом, специфичность может быть строго контролируется при использовании изолированных культурах, выращенных при определенной температуре.
Таким образом, быстрое выявление и диагностика Y. Pestis имеет важное значение для положительного прогноза с чумой, особенно легочной чумы, почти всегда заканчивается смертельным исходом, если лечение не введен в течение первых 24 часов после появления симптомов. Этот метод имеет потенциал для удовлетворения этих потребностей для подтвердил идентификации культурных изолятов или в клинически значимых матриц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано малого бизнеса инновационных исследований программы Национального института здоровья (NIAID, 1R43AI082698-01) и Министерства сельского хозяйства США Национального института сельского хозяйства и продовольствия (НИФА, 2009-33610-20028).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco LB agar, Miller | VWR international | 90003-346 | |
| Difco LB broth, Miller | VWR international | 90003-350 | |
| 17 x 100 mm culture tubes | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| n-Decanal | Sigma-Aldrich | D7384 | |
| Veritas microplate luminometer | Turner Biosystems | 9100-001 | |
| Microlite microtiter 96-well plate | VWR international | 62402-984 |
References
- Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents. Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).
- Chu, M. C. Laboratory manual of plague diagnostic tests.. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta. (2000).
- , (1999).
- Inglesby, T. V. Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management. JAMA. 287, 2236-2252 (2002).
- Schuch, R., Fischetti, V. A. Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance. J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).
- Garcia, E. The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes. J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).
- Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis. Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).
- Schofield, D. A., Westwater, C. Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis. Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).
- Chu, M. C. CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis. , Centers for Disease Control and Prevention. 1-19 (2001).
- Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage. J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).
- Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella. J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).
- Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR. PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).
