Summary
Un método simple para la identificación de los patógenos bacterianos prioridad es el uso de fagos reportero de la ingeniería genética. Estos fagos reportero, que son específicos de su especie huésped particular, son capaces de transducir una respuesta rápida de la señal bioluminiscente a las células huésped. En este documento, se describe el uso de fagos reportero para la detección de
Abstract
Yersinia pestis y Bacillus anthracis son de categoría A patógenos bacterianos que son los agentes causales de la peste y el ántrax, respectivamente 1. A pesar de la presencia natural de ambas enfermedades es ahora relativamente rara, la posibilidad de que grupos terroristas que utilizan estos agentes patógenos como un arma biológica es real. Debido a la comunicabilidad inherente de la enfermedad, curso clínico rápido y alta tasa de mortalidad, es fundamental que un brote se detectó rápidamente. Por lo tanto, las metodologías que proporcionan una rápida detección y el diagnóstico son esenciales para garantizar la aplicación inmediata de medidas de salud pública y la activación de la gestión de crisis.
Recombinante fago reportero puede ofrecer un enfoque rápido y específico para la detección de Y. pestis y B. anthracis. Los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades en la actualidad el uso de los ensayos de fagos lisis clásico para la identificación confirmado de estas bacterias patógenas 2-4. Estos ensayos de aprovechar de forma natural fagos que son específicos y lítico para sus huéspedes bacterianos. Después de un crecimiento durante la noche de la bacteria cultivada en la presencia de los fagos específicos, la formación de placas (lisis bacteriana) proporciona una identificación positiva de la diana bacteriana. A pesar de estas pruebas son sólidas, sufren de tres problemas: 1) son de laboratorio basado, 2) que requieren aislamiento bacteriano y el cultivo de la muestra sospechosa, y 3) tomar 24-36 horas para completar. Para abordar estas cuestiones, un recombinante de "luz-con etiqueta" fago reportero fueron genéticamente manipulados mediante la integración de los Vibrio harveyi luxAB genes en el genoma de la Y. pestis y B. anthracis específicos fago 5-8. El fago reportero luxAB resultantes fueron capaces de detectar su objetivo específico de acuerdo rápidamente (en minutos) y la sensibilidad que confiere un fenotipo bioluminiscente a las células receptoras. Es importante destacar que la detección se obtuvo, ya sea con las células receptoras cultivadas o con modelo de infectados muestras clínicas 7.
Para fines de demostración, aquí se describe el método para la detección de fagos mediada de un conocido Y. pestis aislar utilizando un fago reportero luxAB construido a partir de los CDC plaga de diagnóstico fago ΦA1122 6,7 (Figura 1). Un método similar, con ligeras modificaciones (por ejemplo, cambio en la temperatura de crecimiento y los medios de comunicación), se puede utilizar para la detección de B. anthracis aislamientos de la B. fago reportero anthracis Wβ:: luxAB 8. Este método describe la transducción mediada por fagos de un fenotipo de biolumescent cultivada Y. pestis células que posteriormente se midió utilizando un luminómetro de microplacas. Las principales ventajas de este método en los ensayos de lisis del fago tradicionales es la facilidad de uso, los resultados rápidos, y la capacidad para analizar muestras de forma simultánea en un formato de microtitulación de 96 pocillos.
Figura 1. Esquema de detección. El fago se mezclan con la muestra, el fago infecta a la célula, luxAB expresadas, y el bioluminesces celular. Procesamiento de las muestras no es necesario, el fago y las células se mezclan y posteriormente se valoran por la luz.
Protocol
1. Y. pestis inoculación placa
- Racha de Y. pestis A1122 (BeiResources # NR15) los cultivos de acciones en Luria-Bertani (LB) agar (Miller). Una técnica estéril y realizar todas las Y. pestis manipulaciones en un tipo de clase II Un gabinete de bioseguridad. Y. pestis A1122 es un nivel de bioseguridad (BSL) 2 cepa excluidos agente de selección. Se carece de los 75 kb par bajo contenido de calcio de respuesta (LCR) plásmido de virulencia, y el locus PGM que se requieren para la virulencia. Crecer Y. pestis a 28 ° C durante 48 horas a una temperatura controlada de aire estático incubadora. La tasa de crecimiento de Y. pestis es lenta, con un tiempo de generación de 1,25 h 9.
2. Y. pestis medios líquidos inoculación
- La transferencia de un solo Y. pestis colonia en una estéril 17 x 100 mm tubo de cultivo que contiene 2 ml de caldo LB con un asa metálica inoculación estéril. Seleccione una colonia que es de tamaño uniforme, es indicativo de las otras colonias, y está claramente separada del resto de las colonias en la placa. Tubo de vórtice brevemente y hacer crecer la cultura a 28 ° C durante aproximadamente 20 horas en una incubadora de agitación (225 rpm).
3. Y. consecuencia pestis, además de fago reportero, y la detección de bioluminiscencia
- Diluir la noche a la mañana Y. pestis 1:20 cultura en medio LB fresco en un tubo de 50 ml halcón (por ejemplo, 500 l de las células en 9,5 ml de medio) y crecer a 28 ° C con agitación (225 rpm). Crecer hasta una densidad óptica a 600 nm (A 600) de 0,2 que se alcanza (aproximadamente 5 h). Las células en crecimiento activo son preferibles para la detección ya que la capacidad de los fagos para la transducción de una respuesta bioluminiscente se correlaciona con la viabilidad y la adecuación de la bacteria huésped. Sin embargo, el sistema de detección se ha demostrado que es compatible con las células recolectadas en todas las etapas del ciclo de crecimiento del 7.
- Generar el sustrato necesario para la reacción bioluminiscente en la preparación de un 2% de n-decanal solución. Mezcla de 200 l de n-decanal con 9,8 ml de caldo de LB. Agitar vigorosamente durante 5 s. El primer inyector de la microplaca luminómetro con 2 ml de 2% de la n-decanal solución. Pre-establecido para el luminómetro autoinject 67 l de la solución decanal a cada micro pozo e inmediatamente leer la muestra durante 10 s.
- Dispensar alícuotas de 1 ml de caldo de LB en 3 tubos de cultivo. Añadir 20 l de la solución de fago reportero de acciones (stock de 5 x 10 9 unidades formadoras de placa [UFP] / mL) a cada tubo, el fago y las muestras de los medios de comunicación solo sirve como control negativo. En ausencia de Y. células pestis, la adición del fago reportero no debe provocar una respuesta bioluminiscente.
- Dispensar alícuotas de 1 ml de la Y. pestis mediante cultivo (desde el paso 3.1) en 6 tubos de cultivo. Añadir 20 l de la acción del fago reportero a 3 de los cultivos (cultivos de ensayo). Los restantes tres culturas servir como "células por sí solas" control negativo (autobioluminescence de fondo). Mezcla de culturas con el vortex brevemente, y la cosecha de 200 l de cada muestra (por el momento 0 leer) y se distribuye en una placa de microtitulación de 96 pocillos de blanco. Incubar el cultivo restante a los 28 ° C con agitación (225 rpm).
- Medir el tiempo de 0 muestras de bioluminiscencia (unidades relativas de luz, RLU) con el luminómetro microplaca.
- Cosecha de 200 l de cada muestra después de 10, 20, 30, 40, 50 y 60 minutos después de la periodista además de fagos, y medir la muestra de la bioluminiscencia. Si Y. pestis células están presentes, el fago reportero se unirán específicamente a la célula, inyecta su ADN, y el uso de los anfitriones de maquinaria de transcripción y traducción de transcribir y traducir los genes reportero luxAB (Figura 1).
- La fuerza de la señal y el tiempo de respuesta de la señal es proporcional al número de células presentes. En altas concentraciones de células (10 5 10 8 UFC / ml), un aumento significativo en RLU comparación con los controles deben ser evidentes dentro de los 20 min. En las concentraciones de células inferior, (10 2 -10 4 UFC / ml), un aumento significativo en RLU debe ser evidente en 40-60 min.
- Por otra parte, para acelerar el proceso de detección sin necesidad de Y. consecuencia pestis, una colonia de una placa recién crecido puede ser mixto (mediante agitación) directamente en un tubo Eppendorf de 1,5 ml con 200 l de caldo de LB albergar el fago reportero. Prescindir de la mezcla de células / fago en un pozo de una placa de microtitulación. Incubar la placa de microtitulación de 28 ° C y leer la muestra de la bioluminiscencia después de 60 minutos (solo punto de tiempo solamente).
4. Los resultados representativos:
Un experimento de tiempo por supuesto representante del fago reportero mediada la detección de Y. pestis se muestra en la Figura 2. Los controles negativos de 1) fago solo (sin células), o 2) células por sí solas (sin fago) proporcionar los niveles de referencia de la bioluminiscencia de aproximadamente 20 RLU toda la inc 60 minubation (niveles de referencia son específicos luminómetro). Por el contrario, un aumento de la bioluminiscencia de las muestras de ensayo (fago reportero y células) se hace evidente a los 15 minutos después de la adición del fago. La intensidad de la señal debe aumentar de manera constante durante 60 min. Incubaciones por períodos de tiempo prolongado (más de 80 min), se traducirá en una señal de que se reducirá desde el pico de la señal debido a la lisis mediada por fagos de las células huésped. Resultados similares se obtienen a temperaturas de incubación de 37 ° C aunque la temperatura óptima para la Y. crecimiento pestis es de 28 ° C 9.
Figura 2. Fagos mediada por la detección de bioluminiscente de Y. pestis. En el momento 0, fago reportero de las células y se mezclan, se incuba a 28 ° C, y la bioluminiscencia (RLU) fue monitorizada a través del tiempo. Un aumento significativo en RLU (* Estudiantes t-test, p <0,05) es evidente en los 15 minutos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este método demuestra la capacidad del fago reportero para detectar rápidamente Y. pestis desde el fago reportero puede transducir una señal de respuesta bioluminiscente de cultivo Y. pestis células dentro de los 20 minutos después de la adición del fago. El fago reportero también es capaz de detectar directamente Y. pestis en las matrices de clínica, sin el requisito de aislamiento y posterior cultivo 7. En comparación con los ensayos de lisis del fago estándar que generalmente requieren 48 horas para su realización, este disminuye significativamente el tiempo de detección.
Estudios previos han demostrado que el fago de tipo salvaje ΦA1122 puede lisar casi todos los naturales Y. pestis aislados, y es "específica" de Y. pestis 6,10,11, sin embargo, algunos Y. pseudotuberculosis cepas han demostrado ser susceptibles ΦA1122 cuando se cultiva a temperaturas superiores a 20 ° C 6,10,12. La razón de la susceptibilidad diferencial sensible a la temperatura es desconocida, pero probablemente debido a cambios en función de la temperatura en las capas de la superficie celular / composición. Por lo tanto, una advertencia potencial del sistema de detección de fago reportero de la posibilidad de una respuesta de falsos positivos con cepas de Y. estrechamente relacionados con las especies pseudotuberculosis. Realizar el ensayo del fago reportero de la temperatura restrictiva (20 ° C) impedirá que una señal de falsos positivos en las muestras que contienen Y. pseudotuberculosis. Por lo tanto, la especificidad puede ser estrictamente controlados cuando se utiliza culturas aisladas crecido a una temperatura específica.
En resumen, la rápida detección y diagnóstico de la Y. pestis es esencial para un pronóstico positivo, ya que la plaga, la peste neumónica en especial, casi siempre es mortal si el tratamiento no se administra en las primeras 24 horas después de la aparición de los síntomas. Este método tiene el potencial para satisfacer estas necesidades para la identificación de las cepas cultivadas confirmado o dentro de las matrices de relevancia clínica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por el programa Small Business Innovation Research de los Institutos Nacionales de Salud (NIAID, 1R43AI082698-01) y el Departamento de Agricultura Instituto Nacional de la Agricultura y la Alimentación (NIFA, 2009-33610-20028).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco LB agar, Miller | VWR international | 90003-346 | |
| Difco LB broth, Miller | VWR international | 90003-350 | |
| 17 x 100 mm culture tubes | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| n-Decanal | Sigma-Aldrich | D7384 | |
| Veritas microplate luminometer | Turner Biosystems | 9100-001 | |
| Microlite microtiter 96-well plate | VWR international | 62402-984 |
References
- Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents. Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).
- Chu, M. C. Laboratory manual of plague diagnostic tests.. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta. (2000).
- , (1999).
- Inglesby, T. V. Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management. JAMA. 287, 2236-2252 (2002).
- Schuch, R., Fischetti, V. A. Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance. J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).
- Garcia, E. The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes. J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).
- Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis. Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).
- Schofield, D. A., Westwater, C. Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis. Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).
- Chu, M. C. CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis. , Centers for Disease Control and Prevention. 1-19 (2001).
- Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage. J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).
- Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella. J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).
- Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR. PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).
