Summary
En enkel metod för identifiering av prioriterade bakterier är att använda genmanipulerade reporter fag. Dessa reporter fag, som är specifika för just deras värdart kan snabbt transducing en självlysande signal svar på värdceller. Häri beskriver vi användning av reportern fag för detektion av
Abstract
Yersinia pestis och anthracis Bacillus är kategori A-bakterier som är smittämnen som pest och mjältbrand, respektive 1. Även naturliga förekomsten av båda sjukdomarna "är nu relativt sällsynt, är möjligheten att terroristgrupper använder dessa patogener som biovapen verklig. På grund av sjukdomen inneboende smittsamhet, snabb kliniskt förlopp och hög dödlighet, är det viktigt att ett utbrott kan upptäckas snabbt. Därför metoder som ger snabb upptäckt och diagnos är en förutsättning för omedelbart genomförande av folkhälsan åtgärder och aktivering av krishantering.
Rekombinant reporter phage kan ge en snabb och specifik metod för detektion av Y. pestis och B. anthracis. Den Centers for Disease Control and Prevention använder för närvarande klassiska analyser fagolys för bekräftade identifiera dessa bakterier 2-4. Dessa analyser dra nytta av naturligt förekommande fag som är specifika och lytisk för bakteriell värdar. Efter natten tillväxt av den odlade bakterien i närvaro av det specifika fag ger bildningen av plack (bakterier lysering) en positiv identifiering av bakterier målet. Även om dessa tester är robusta, lider de av tre brister: 1) de är laboratoriebaserade, 2) de kräver bakteriell isolering och odling från misstänkta provet, och 3) de tar 24-36 timmar att slutföra. För att hantera dessa frågor, var rekombinant "light-märkta" reporter fag genetiskt modifierade genom att integrera Vibrio harveyi luxAB gener i genomet av Y. pestis och B. anthracis specifika phage 5-8. Den resulterande luxAB reporter phage kunde upptäcka sina specifika mål genom att snabbt (inom minuter) och lyhördhet ger en självlysande fenotyp till mottagare celler. Viktigt var detektering fås antingen med odlade mottagaren celler eller med mock-infekterade kliniska prover 7.
För demonstrationsändamål Här beskriver vi metoden för fag-medierad upptäckt av en känd Y. pestis isolera med en luxAB reporter fag konstrueras från CDC pesten diagnostiska fag ΦA1122 6,7 (figur 1). En liknande metod, med smärre modifieringar (t.ex. förändring i tillväxt temperatur och media), kan användas för detektion av B. anthracis isolat med B. anthracis reporter phage Wβ:: luxAB 8. Metoden beskriver fag-medierad transduktion av en biolumescent fenotyp till odlats Y. pestis celler som sedan mäts med en mikroplattor luminometer. De stora fördelarna med denna metod än de traditionella analyser fagolys är enkel att använda, snabba resultat, och möjlighet att testa flera prover samtidigt i en 96-håls mikrotiterplattan format.
Figur 1. Detection schematiska. Blandas med provet The fag, infekterar fag cellen luxAB uttrycks, och bioluminesces cellen. Exempel på behandling inte är nödvändig, den fag och cellerna blandas och därefter för ljus.
Protocol
1. Y. pestis tallrik ympning
- Streak Y. pestis A1122 (BeiResources # NR15) stamkulturer på Luria-Bertani (LB) agar (Miller). Använd steril teknik och utföra alla Y. pestis manipulationer i en klass II typ A biosäkerhet skåp. Y. pestis A1122 är en biosäkerhetsnivå (BSL) 2 undantas välja agent stam. Den saknar både 75 kb paret låg kalcium svar (LCR) virulens plasmiden, och PGM locus som krävs för virulens. Väx Y. pestis vid 28 ° C i 48 timmar i en statisk temperatur kontrollerad luft inkubator. Tillväxttakten av Y. pestis är långsam med en generationstid på 1,25 tim 9.
2. Y. pestis flytande medier inympning
- Överför enstaka Y. pestis koloni i en steril 17 x 100 mm kulturen tub innehåller 2 ml LB buljong med en steril ögla metall ympningen. Välj en koloni som är enhetlig i storlek, är betecknande för de andra kolonierna, och är tydligt skild från resten av kolonier på plattan. Vortexröret kort och växa kultur vid 28 ° C i ca 20 h på en skakande inkubator (225 rpm).
3. Y. pestis utväxt, reporter fag Dessutom, och självlysande upptäckt
- Späd natten Y. pestis kultur 1:20 till frisk LB buljongen i en 50 ml Falcon rör (t ex 500 mikroliter av celler i 9,5 ml medium) och växa vid 28 ° C med skakningar (225 rpm). Växa tills en optisk densitet vid 600 nm (A 600) på 0,2 uppnås (ca 5 h). Aktivt växande celler är att föredra för att upptäcka eftersom möjligheten för phage till transduce en självlysande svar är korrelerad till livskraft och fitness i värdlandet bakterier. Ändå har upptäckt systemet visat sig vara kompatibel med celler skördas vid alla stadier av tillväxt cykel 7.
- Generera underlaget som behövs för den självlysande reaktionen genom att förbereda en 2% n-decanal lösning. Blanda 200 mikroliter av n-decanal med 9,8 ml LB buljong. Vortexa kraftigt i 5 s. Prime mikroplattan luminometer injektorn med 2 ml av 2% n-decanal lösning. Förinställda för luminometer att autoinject 67 mikroliter av decanal lösning till varje mikroplattor väl och sedan omedelbart läsa provet i 10 s.
- Tillsätt 1 mL alikvoter av LB buljong i 3 provrör. Tillsätt 20 mikroliter av reportern phage stamlösning (lager av 5 x 10 9 plaque forming units [PFU] / ml) till varje rör, de fag och media ensam prover fungerar som en negativ kontroll. I avsaknad av Y. pestis celler, bör tillägg av reportern phage framkalla inte en självlysande svar.
- Tillsätt 1 mL alikvoter av Y. pestis kultur (från steg 3.1) i 6 provrör. Tillsätt 20 mikroliter av reportern phage lager till 3 av de kulturer (test kulturer). De återstående tre kulturer fungera som ett "celler ensam" negativ kontroll (bakgrunden autobioluminescence). Blanda kulturer genom att vortexa kort och skörda 200 mikroliter från varje prov (för tiden 0 läser) och lämna ut till en vit 96-bra mikrotiterplattan. Inkubera resterande kulturen vid 28 ° C med skakningar (225 rpm).
- Mät tiden 0 prover för mareld (relativt lätta enheter, RLU) med mikroplattan luminometer.
- Harvest 200 mikroliter av varje prov efter 10, 20, 30, 40, 50 och 60 min efter reporter fag dessutom och mäta provet för mareld. Om Y. pestis celler är närvarande, kommer reportern phage binder specifikt till cellen, injicera sitt DNA och använda värdar transkriptionell och translationell maskiner att transkribera och översätta luxAB reportern gener (Figur 1).
- Styrkan i signalen och signalen svarstiden är proportionell mot antalet celler närvarande. Vid höga koncentrationer av celler (10 5 -10 8 CFU / mL), en betydande ökning av RLU jämfört med kontrollerna skall vara tydlig inom 20 min. Vid lägre cell koncentrationer (10 2 -10 4 CFU / mL) bör en betydande ökning av RLU vara tydlig inom 40-60 min.
- Alternativt, för att påskynda identifieringsprocessen utan behov av Y. pestis utväxt, en koloni från en nyligen blivit platta kan blandas (genom att vortexa) direkt i ett 1,5 ml Eppendorf-rör med 200 mikroliter i LB buljong hysa reportern phage. Fördela cellen / fag blandningen i en brunn i en mikrotiterplatta. Inkubera mikrotiterplatta vid 28 ° C och läs provet för mareld efter 60 min (enda tidpunkten endast).
4. Representativa resultat:
En representant tidsförloppet experimentet reporter fag medierad upptäckt av Y. pestis är avbildad i figur 2. De negativa kontrollerna av 1) fag ensam (inga celler), eller 2) celler ensam (ingen fag) ger grundläggande nivåer av mareld på cirka 20 RLU hela 60 min inklubation (utgångsvärde nivåer är luminometer specifika). Däremot är en ökning bioluminescens för provföremål (reporter fag och celler) tydligt vid 15 min efter phage tillägg. Signalstyrkan ska öka stadigt under 60 min. Inkubationer under längre tidsperioder (över 80 min), kommer att resultera i en signal som kommer att minska från toppen signal på grund av fag medierad lys av värdceller. Liknande resultat erhålls vid inkubation temperaturer på 37 ° C även om den optimala temperaturen för Y. pestis tillväxt är 28 ° C 9.
Figur 2. Fag-medierad självlysande detektion av Y. pestis. Vid tiden 0, var reporter fag och celler blandas, inkuberas vid 28 ° C, och mareld (RLU) övervakades över tid. En betydande ökning av RLU (* Studenter t-test, p <0,05) är tydlig inom 15 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod visar förmåga reportern phage att snabbt upptäcka Y. pestis sedan reportern phage kan transduce en självlysande signal svar på odlade Y. pestis celler inom 20 minuter efter phage tillägg. Reportern phage är också möjligt att direkt upptäcka Y. pestis i klinisk matriser, utan en förutsättning för isolering och efterföljande odling 7. Jämfört med vanliga tester fagolys som generellt kräver 48 timmar för färdigställande, minskar detta avsevärt det dags att upptäcka.
Tidigare studier har visat att vildtyp ΦA1122 phage kan Lyse nästan alla fysiska Y. pestis isolat, och är "särskilda" för Y. pestis 6,10,11, men vissa Y. pseudotuberculosis stammar har visat sig vara ΦA1122 mottagliga när den odlas vid temperaturer över 20 ° C 6,10,12. Orsaken till den temperaturkänsliga differential känslighet är okänd, men förmodligen på grund av temperatur-beroende förändringar i lager cellytan / komposition. Därför är en potentiell nackdel med reportern phage system för upptäckt möjligheten av ett falskt positivt svar med stammar från den närbesläktade arter Y. pseudotuberculosis. Analysen utförs reporter phage vid restriktiva temperatur (20 ° C) kommer att förhindra en falsk positiv signal i prover som kan innehålla Y. pseudotuberculosis. Således kan specificitet noggrant kontrolleras när man använder isolerade kulturer vuxit vid en viss temperatur.
Sammanfattningsvis, snabb upptäckt och diagnos av Y. pestis är en förutsättning för en positiv prognos sedan pesten, speciellt lungpest, är nästan alltid dödlig om behandling inte ges under de första 24 timmar efter symtomdebut. Denna metod har potential att tillgodose dessa behov för de bekräftade identifiering av odlade isolerar eller inom kliniskt relevanta matriser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av Small Business Innovation Research program för National Institutes of Health (NIAID, 1R43AI082698-01) och USDA National Institute of livsmedels-och jordbruksorganisation (NIFA, 2009-33610-20028).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco LB agar, Miller | VWR international | 90003-346 | |
| Difco LB broth, Miller | VWR international | 90003-350 | |
| 17 x 100 mm culture tubes | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| n-Decanal | Sigma-Aldrich | D7384 | |
| Veritas microplate luminometer | Turner Biosystems | 9100-001 | |
| Microlite microtiter 96-well plate | VWR international | 62402-984 |
References
- Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents. Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).
- Chu, M. C. Laboratory manual of plague diagnostic tests.. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta. (2000).
- , (1999).
- Inglesby, T. V. Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management. JAMA. 287, 2236-2252 (2002).
- Schuch, R., Fischetti, V. A. Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance. J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).
- Garcia, E. The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes. J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).
- Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis. Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).
- Schofield, D. A., Westwater, C. Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis. Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).
- Chu, M. C. CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis. , Centers for Disease Control and Prevention. 1-19 (2001).
- Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage. J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).
- Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella. J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).
- Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR. PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).
