Summary
שיטה פשוטה לזיהוי חיידקים פתוגנים העדיפות היא להשתמש phage כתב מהונדסים גנטית. אלה phage הכתב, אשר הן ספציפיות למין מסוים המארח שלהם, הם מסוגלים במהירות transducing תגובה אות bioluminescent לתאי המארח. בזאת, אנו מתארים את השימוש phage הכתב לצורך זיהוי של
Abstract
Pestis Yersinia ו anthracis Bacillus הם קטגוריה פתוגנים חיידקיים כי הם סוכני סיבתי של המגיפה ואת אנתרקס, בהתאמה 1. למרות התרחשות טבעית של שתי מחלות "כיום נדיר יחסית, את האפשרות של קבוצות טרור באמצעות אלה פתוגנים כמו bioweapon הוא אמיתי. בגלל communicability הטבועה של המחלה, כמובן קליניים מהירה, שיעור תמותה גבוה, זה קריטי, כי התפרצות להתגלות מהר. לכן מתודולוגיות המספקים איתור אבחון מהיר חיוניים על מנת להבטיח יישום מיידי של צעדים לבריאות הציבור ההפעלה של ניהול משברים.
רקומביננטי phage הכתב עשוי לספק גישה מהירה ספציפי לגילוי של י ' pestis ו-B anthracis. המרכז לבקרת מחלות ומניעתן משתמש כעת תמוגה מבחני קלאסית phage לזיהוי אישר אלה חיידקים פתוגנים 2-4. מבחני אלו לנצל טבעי phage שהם ספציפיים ממס עבור המארחים חיידקי שלהם. לאחר לילה צמיחה של החיידק מעובדים בנוכחות phage הספציפי, היווצרות הפלאק (תמוגה חיידקי) מספק זיהוי חיובי של יעד חיידקי. למרות מבחני האלה הם חזקים, הם סובלים משלושה חסרונות: 1) הם המעבדה מבוססת, 2) הם דורשים בידוד טיפוח חיידקים מן המדגם חשד, ו 3) הם לוקחים 24-36 שעות כדי להשלים. כדי לטפל בבעיות אלה, רקומביננטי "אור מתויג" phage הכתב היו מהונדסים גנטית על ידי שילוב harveyi Vibrio luxAB גנים לתוך הגנום של י ' pestis ו-B anthracis phage ספציפי 5-8. הכתב כתוצאה phage luxAB הצליחו לזהות יעד ספציפי שלהם במהירות (תוך דקות) וברגישות הענקת פנוטיפ bioluminescent לתאי הנמען. חשוב לציין, זיהוי הושג גם עם תאים הנמען מעובדים או עם מעושה נגוע דגימות קליניות 7.
למטרות הדגמה, כאן אנו מתארים את השיטה לגילוי phage בתיווך של י ידוע pestis לבודד באמצעות phage כתב luxAB בנויים המגפה CDC אבחון phage ΦA1122 6,7 (איור 1). שיטה דומה, עם שינויים קלים (למשל שינוי הטמפרטורה צמיחה התקשורת), ניתן להשתמש לצורך זיהוי של B. anthracis מבודד באמצעות B. phage anthracis Wβ כתב: luxAB 8. השיטה מתארת את התמרה phage בתיווך של פנוטיפ biolumescent י 'טיפח pestis התאים הנמדדים לאחר מכן באמצעות luminometer microplate. היתרונות העיקריים של שיטה זו על פני מבחני תמוגה המסורתית הפאג הוא קלות השימוש, התוצאות מהירה, את היכולת לבחון דגימות בו זמנית בפורמט 96-microtiter גם צלחת.
באיור 1. סכמטית איתור. Phage מעורבבים עם המדגם, phage מדביק את התא, luxAB באים לידי ביטוי, ואת bioluminesces התא. עיבוד המדגם אינו הכרחי; phage ותאי מעורבבים ומדד לאחר מכן לאור.
Protocol
1. י ' pestis חיסון צלחת
- Streak י pestis A1122 (BeiResources # NR15) תרבויות המניות על לוריא-Bertani (LB) אגר (מילר). השתמש בטכניקה סטרילית לבצע את כל י pestis מניפולציות בסוג הכיתה השנייה הקבינט. biosafety י pestis A1122 הוא רמה biosafety (מנהלת הליגה) 2 נשלל זן סוכן לבחור. היא חסרה גם את צמד 75 kb סידן נמוכה (LCR) בתגובה ארסיות פלסמיד, ואת מוקד PGM הנדרשים ארסיות. לגדל י pestis על 28 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות בטמפרטורה סטטית מבוקרת האוויר בחממה. קצב הגידול של י ' pestis איטי עם זמן דור של 1.25 ש 9.
2. Y. pestis נוזלי מדיה חיסון
- העברת י 'אחת pestis המושבה לתוך צינור סטרילי 17 x 100 מ"מ תרבות המכילה 2 מ"ל של מרק LB באמצעות לולאה סטרילי חיסון מתכת. בחר מושבת כי הוא אחיד בגודל, מעיד על במושבות אחרות, מופרדת בבירור משאר המושבות על הצלחת. צינור וורטקס בקצרה ולגדול תרבות ב 28 מעלות צלזיוס למשך כ 20 שעות בתוך חממה רועד (225 סל"ד).
3. י ' תוצאה pestis, phage בנוסף כתב, זיהוי bioluminescent
- לדלל את י 'בן לילה pestis 1:20 התרבות לתוך מרק LB טרי 50 מ"ל בז צינור (למשל, 500 μL של תאים לתוך 9.5 מ"ל של מדיום) ו לגדול ב 28 ° C עם רועד (225 סל"ד). לגדול עד צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (600) של 0.2 הוא הגיע (כ 5 שעות). תאים ומתרחב עדיפים לגילוי מאז היכולת של הפאג כדי transduce תגובה bioluminescent קשורה לקיומה והתאמה של החיידק המארח. עם זאת, מערכת הגילוי הוכח להיות תואם עם תאים שנקטפו בכל שלבי מחזור צמיחה 7.
- צור את המצע הדרוש התגובה bioluminescent על ידי הכנת 2% n-decanal פתרון. מערבבים 200 μL של n-decanal עם 9.8 מ"ל של מרק LB. וורטקס בתוקף במשך 5 s. ראש luminometer microplate מזרק עם 2 מ"ל של הפתרון n-decanal 2%. שנקבע מראש luminometer כדי autoinject 67 μL הפתרון decanal כדי microplate כל טוב ומיד לקרוא את המדגם עבור 10 s.
- לוותר aliquots 1 מ"ל של LB לתוך מרק 3 צינורות תרבות. הוסף 20 μL של הפתרון phage מניות הכתב (מניות של 5 x 10 9 יחידות פלאק ויוצרים [PFU] / mL) אל צינור כל אחד; phage התקשורת דגימות לבד משמש שליטה שלילי. בהעדרו של י ' תאים pestis, תוספת של הפאג הכתב לא צריך לתגובה bioluminescent.
- לוותר aliquots 1 מ"ל של י ' תרבות pestis (משלב 3.1) תוך 6 צינורות תרבות. הוסף 20 μL של המניה phage הכתב 3 של תרבויות (תרבויות מבחן). שאר 3 תרבויות לשמש מלאה שלילית של התאים לבד "(autobioluminescence רקע). מערבבים תרבויות ידי vortexing בקצרה, ו -200 יבול μL מכל מדגם (בפעם 0 לקרוא) ו לוותר לתוך צלחת microtiter לבן 96-היטב. דגירה התרבות הנותרים ב 28 ° C עם רועד (225 סל"ד).
- מדוד את זמן 0 דגימות פליטת אור (יחידות אור יחסי, RLU) באמצעות luminometer microplate.
- 200 קציר μL של כל דגימה לאחר 10, 20, 30, 40, 50, ו 60 שלאחר כתב דקות phage בנוסף, ולמדוד את המדגם עבור פליטת אור. אם י תאים pestis נוכחים, phage הכתב יהיה ספציפי להיקשר אל התא, להזריק DNA שלה, ולהשתמש המארחים מכונות תעתיק ו translational לתמלל ולתרגם את הגנים כתב luxAB (איור 1).
- עוצמת האות ואת זמן התגובה אות הוא יחסי למספר תאים הנוכחי. בריכוזים גבוהים של תאים (10 -10 5 8 CFU / mL), גידול משמעותי לעומת RLU שולט צריך להיות ברור בתוך 20 דקות. בריכוזים נמוכים התא, (10 2 -10 4 CFU / mL), גידול משמעותי RLU צריך להיות ברור בתוך 40-60 דקות.
- לחלופין, כדי לזרז את תהליך זיהוי ללא צורך י תוצאה pestis, מושבה מהצלחת בוגר טרי עשוי להיות מעורב (על ידי vortexing) ישירות צינור 1.5 Eppendorf מ"ל עם μL 200 של מרק LB מחסה phage הכתב. מחלקים את התערובת תא / phage לבאר צלחת microtiter. דגירה את הצלחת microtiter ב 28 ° C ו לקרוא את המדגם עבור פליטת אור אחרי 60 דקות (נקודת זמן אחת בלבד).
4. נציג התוצאות:
הפעם נציג במהלך ניסוי של הפאג הכתב בתיווך זיהוי של י ' pestis מתואר באיור 2. שולט שלילית של 1) phage לבד (ללא תאים), או 2) תאים בלבד (ללא phage) לספק רמות הבסיס של פליטת אור RLU של כ -20 לאורך 60 דקות incubation (רמות הבסיס הן ספציפיות luminometer). לעומת זאת, עלייה פליטת אור על דגימות הבדיקה (phage הכתב והתאים) ניכרת בכל 15 דקות אחרי כן phage. עוצמת האות צריכה לעלות בהתמדה במשך 60 דקות. Incubations לפרקי זמן ממושך (מעל 80 דקות), יביא אות כי תהיה ירידה של האות שיא בשל phage תמוגה בתיווך של התאים המארחים. תוצאות דומות מתקבלים בטמפרטורות דגירה של 37 ° C למרות הטמפרטורה האופטימלית עבור י ' צמיחה pestis היא 28 ° C 9.
איור 2. Phage בתיווך זיהוי bioluminescent של י ' pestis. בזמן 0, phage הכתב והתאים היו מעורבים, מודגרות ב 28 ° C, פליטת אור (RLU) היה פיקוח לאורך זמן. גידול משמעותי RLU (* סטודנטים מבחן t, p <0.05) ניכר בתוך 15 דקות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה זו ממחישה את יכולתו של הפאג הכתב כדי לזהות במהירות Y. pestis מאז phage הכתב יכול transduce תגובה bioluminescent האות י 'תרבותי pestis תאים בתוך 20 דקות אחרי כן phage. Phage עיתונאי הוא גם מסוגל לזהות ישירות י pestis ב מטריצות קליני, ללא תנאי מוקדם של בידוד 7 הטיפוח הבאים. בהשוואה תמוגה מבחני תקן הפאג אשר בדרך כלל דורשים 48 שעות להשלמת, זה מקטין באופן משמעותי את הזמן כדי זיהוי.
מחקרים קודמים הראו כי phage wild-type ΦA1122 יכול lyse כמעט כל י טבעי pestis מבודד, והוא "ספציפי" עבור י ' pestis 6,10,11, עם זאת, חלק י ' זנים pseudotuberculosis הוכחו להיות ΦA1122 רגישים כאשר גדל בטמפרטורות מעל 20 מעלות צלזיוס 6,10,12. הסיבה רגישות טמפרטורה רגיש ההפרש אינו ידוע, אך ככל הנראה בשל לטמפרטורה תלויי שינויים על פני שכבות תא / הרכב. לפיכך, אזהרה הפוטנציאל של מערכת זיהוי כתב phage היא האפשרות של תגובה חיוביות שגויות עם זנים מן מקרוב הקשורות מינים י pseudotuberculosis. ביצוע assay phage כתב בטמפרטורה מגבילים (20 ° C) ימנע איתות חיובי כוזב דגימות שעשויות להכיל י pseudotuberculosis. לפיכך, סגוליות יכול להיות נשלט לחלוטין בעת שימוש תרבויות מבודדות גדלה בטמפרטורה מסוימת.
איתור לסיכום, אבחון מהיר של י ' pestis חיונית תחזית חיובית מאז המגפה, המכה במיוחד דלקת ריאות, הוא כמעט תמיד קטלני אם הטיפול לא מנוהל בתוך 24 שעות הראשונות לאחר הופעת הסימפטומים. שיטה זו יש פוטנציאל לענות על הצרכים הללו לצורך זיהוי של אושר מבודד תרבותי או בתוך מטריצות רלוונטיות קלינית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר קטן חדשנות עסקית של המכונים הלאומיים לבריאות (NIAID, 1R43AI082698-01) ו - USDA המכון הלאומי של המזון והחקלאות (NIFA, 2009-33610-20028).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco LB agar, Miller | VWR international | 90003-346 | |
| Difco LB broth, Miller | VWR international | 90003-350 | |
| 17 x 100 mm culture tubes | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| n-Decanal | Sigma-Aldrich | D7384 | |
| Veritas microplate luminometer | Turner Biosystems | 9100-001 | |
| Microlite microtiter 96-well plate | VWR international | 62402-984 |
References
- Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents. Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).
- Chu, M. C. Laboratory manual of plague diagnostic tests.. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta. (2000).
- , (1999).
- Inglesby, T. V. Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management. JAMA. 287, 2236-2252 (2002).
- Schuch, R., Fischetti, V. A. Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance. J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).
- Garcia, E. The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes. J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).
- Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis. Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).
- Schofield, D. A., Westwater, C. Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis. Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).
- Chu, M. C. CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis. , Centers for Disease Control and Prevention. 1-19 (2001).
- Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage. J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).
- Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella. J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).
- Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR. PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).
