Summary
Öncelikli bakteriyel patojenlerin tespiti için basit bir yöntem, genetiği muhabiri faj kullanmaktır. Kendi özel konak türe özgü Bu muhabir faj, konak hücreleri için bioluminescent sinyal yanıt hızla uyum sağlama yeteneğine sahiptir. Burada, biz tespiti için muhabir faj kullanımını tanımlamak
Abstract
Yersinia pestis ve Bacillus anthracis sırasıyla 1, veba ve şarbon etken bakteriyel patojenler Kategori. Her iki hastalık 'doğal olarak ortaya çıkan, nispeten nadir olmasına rağmen, bioweapon olarak bu patojenlerin kullanarak terörist grupların olasılığı gerçek. Hastalığın doğasında Bulaşıcılık, hızlı klinik seyri ve yüksek ölüm oranı nedeniyle bir salgın hızlı bir şekilde tespit edilmesi kritik öneme sahiptir. Bu nedenle hızlı algılama ve teşhis sağlayacak metodolojileri, halk sağlığı önlemlerinin ve kriz yönetimi aktivasyonu derhal uygulanmasını sağlamak için gerekli.
Rekombinant muhabiri faj Y. 'nin tespiti için hızlı ve spesifik bir yaklaşım sağlayabilir pestis ve B. anthracis Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri, şu anda bu bakteriyel patojenler 2-4 teyit tanımlanması için klasik faj lizis testleri kullanabilirsiniz. Bu deneyleri, doğal olarak bakteriyel bilgisayarlar için özel ve litik faj meydana gelen yararlanmak. Özel faj varlığında ekili bakterinin gecede büyüme sonra, plaklar oluşumunu (bakteriyel lizis) bakteri hedef olumlu bir tanımlama sağlar. Bu testlerin güçlü olmasına rağmen, üç eksiklikleri zarar: 1) laboratuvar bazlı, 2) şüpheli numune bakteri izolasyonu ve kültivasyonu gerektirir, ve 3) tamamlamak için 24-36 saat alır. Bu sorunları ele almak için, rekombinant "ışık etiketli" muhabiri faj genetik Vibrio harveyi luxAB genler Y. genom içine entegre ederek, mühendislik pestis ve B. anthracis özel faj 5-8. LuxAB muhabiri faj hızla kendi özel hedef tespit edebiliyoruz (dakika içinde) ve hassas alıcı hücrelere bioluminescent fenotip görüşmekte. Önemlisi, algılama ekili alıcı hücreleri ile veya sahte-enfekte klinik örneklerden 7 ya da elde edildi.
Gösteri amaçlı, burada bilinen bir Y. faj aracılı tespiti için bir yöntem tarif pestis CDC veba teşhis faj ΦA1122 6,7 (Şekil 1) inşa luxAB muhabiri faj kullanılarak izole. Küçük değişiklikler (örneğin büyüme sıcaklık ve ortam değişikliği), B. tespiti için benzer bir yöntem kullanılıyor olabilir anthracis B. kullanarak izole anthracis muhabiri faj Wβ: luxAB 8. Yöntemi ekili Y. biolumescent fenotip faj aracılı transdüksiyon açıklar sonradan mikroplak luminometre kullanarak ölçülür pestis hücreleri. Bu yöntemin geleneksel faj lizis deneyleri üzerinde önemli avantajları, kolay kullanımı, hızlı sonuçlar ve 96-iyi mikrotiter plate formatı aynı anda birden fazla örneklerini test etmek için yeteneği.
Şekil 1. Algılama şematik faj örneği ile karıştırılır, faj hücre, luxAB ifade edilir ve hücre bioluminesces bozar. Örnek işlem gerekli değildir; faj ve hücreler karıştırılır ve daha sonra ışık ölçülür.
Protocol
1.. Y. pestis plaka aşılama
- Streak Y. pestis A1122 Luria-Bertani üzerine stok kültürleri (LB) agar (BeiResources # NR15) (Miller). Steril tekniği kullanın ve tüm Y. gerçekleştirmek sınıf II tipi bir biyogüvenlik kabini. Y. pestis manipülasyonlar pestis A1122 bir Biyogüvenlik Seviyesi (BGS) 2 hariç etken suşun seçin. Bu her ikisi de 75 kb çifti düşük kalsiyum plazmid yanıt (LCR) virülans ve virülans için gerekli olan pgm lokus yoksundur. Y. büyütün 28 pestis ° C, statik sıcaklık, hava inkübatör kontrol 48 saat. Y. 'nin büyüme hızı pestis 1.25 saat 9 nesil zaman yavaştır.
2.. Y. pestis sıvı medya aşılama
- Bir tek Y. transfer LB et suyu, kısır bir metal aşılama döngü kullanarak 2 ml içeren steril bir 17 x 100 mm kültür tüpünün içine pestis koloni . Boyutu tekdüze bir koloni seçin, diğer kolonilerin göstergesidir ve plaka kolonilerin geri kalanından açıkça ayrılır. Vortex kısaca tüp ve 28 kültür büyümeye ° C sallayarak inkübatör (225 rpm) yaklaşık 20 saat.
3.. Y. pestis akıbet, muhabir faj Ayrıca, ve bioluminescent algılama
- Gecede Y. sulandırınız pestis kültür 50 ml şahin tüp taze LB suyu (örneğin, 9.5 mL orta içine hücre 500 mcL) 1:20 ve 28 ° C (225 rpm) sallayarak ile büyüyecek. 0.2 600 nm (600) bir optik yoğunluk (yaklaşık 5 saat) ulaşılana kadar büyütün. Aktif büyüyen hücreleri bioluminescent yanıt ana bakterilerin canlılığı ve fitness ilişkilidir uyum sağlamak faj yeteneği beri tespiti için tercih edilir. Bununla birlikte, algılama sistemi, büyüme döngüsünün 7 tüm aşamalarında hasat hücreleri ile uyumlu olacak şekilde gösterilmiştir .
- N% 2 dekana çözüm hazırlayarak bioluminescent reaksiyon için gerekli substrat oluşturun. LB et suyu 9.8 mL n-dekana 200 mcL karıştırın. 5 saniye süreyle kuvvetlice Vortex Başbakan, 2 mL% 2 n-dekana çözüm ile mikroplaka luminometre enjektör. Luminometre ve sonra her mikroplak dekana çözüm 67 mcL autoinject hemen 10 sn için örnek okumak için önceden ayarlanmış
- 3 kültür tüp içine 1 mL alikotları LB suyu koyun. Her bir tüp muhabiri faj stok solüsyonu (5 x 10 9 plak oluşturan birim stok [PFU] / ml) 20 mcL ekleyin; faj ve medya tek başına örnekleri negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. Y. 'nin yokluğunda pestis hücreleri, muhabir faj ek bir bioluminescent cevabı ortaya olmamalıdır.
- Y. 1 mL alikotları Uygulama 6 kültür tüp içine pestis kültür (3.1 adım). Kültürleri (testi kültürler) 3 muhabir faj stokunun 20 mcL ekleyin. Kalan 3 kültür, hücreleri tek başına 'negatif kontrol (arka plan autobioluminescence) olarak hizmet vermektedir. Kısaca vorteks kültürlerin karıştırın ve her bir örnek hasat 200 mcL (0 zaman okumak için) ve beyaz 96-iyi bir mikrotiter plate içine dağıtmak. Kalan kültür 28 ° C'de sallayarak (225 rpm).
- Mikroplak luminometre kullanarak biyoparlaklık (bağıl ışık birimleri, RLU) için 0 örnekleri ölçün.
- Hasat 200 10 saniye sonra her bir örnek mcL, 20, 30, 40, 50, ve 60 dakika sonrası muhabiri faj Ayrıca, biyoparlaklık için örnek ölçmek. Eğer Y. pestis hücreleri mevcuttur, muhabir faj, özellikle hücre bağlamak DNA'sı enjekte ve luxAB muhabiri genleri (Şekil 1) yazıya çevirmek için ev sahipliği yapan, transkripsiyonel ve translasyonel makine kullanım olacak .
- Sinyal gücü ve sinyal tepki süresi, hücre sayısı ile mevcut orantılıdır. 20 dakika içinde hücreler (10 5 -10 8 CFU / mL), kontrollere göre önemli bir artış RLU yüksek konsantrasyonlarda belirgin olmalıdır. Alt hücreye konsantrasyonlarda (10 2 -10 4 CFU / ml), RLU önemli bir artış, 40-60 dakika içinde belirgin olmalıdır .
- Alternatif olarak, Y. için gerek kalmadan algılama sürecini hızlandırmak için pestis akıbet taze yetişen bir tabak, bir koloni doğrudan muhabiri faj barındıran LB suyu 200 mcL ile 1.5 ml Eppendorf tüp (vorteks) karışık olabilir. Mikrotiter plate bir kuyunun içine hücre / faj karışımı koyun. Mikrotiter plate 28 ° C'de inkübe edin ve 60 dk sonra (sadece tek bir zaman noktasında) biyoparlaklık için örnek okuyun.
4. Temsilcisi sonuçları:
Bir temsilci, muhabir faj ders deney Y. algılama aracılı pestis, Şekil 2'de gösterilmiştir . 1 negatif kontroller) faj tek başına (hücreleri), ya da yalnız 2) hücreleri (yok faj), 60 dakika inc boyunca yaklaşık 20 RLU biyoparlaklık başlangıç düzeyleriubation (taban seviyelere luminometre özgüdür). Buna karşın, test örnekleri (muhabiri faj ve hücreleri) biyoparlaklık bir artış faj eklenmesinden sonra 15 dakika açıktır. Sinyal gücü, 60 dakika boyunca sürekli artmalıdır. Inkübatörü, uzun süre süreler (80 dk), ana hücreler aracılı lizis faj nedeniyle zirve sinyali azalacak bir sinyal neden olur. ° C olsa Y. için optimum sıcaklık 37 inkübasyon sıcaklıkları benzer sonuçlar elde pestis büyüme 28 ° C 9.
Şekil 2. Y. Faj aracılı bioluminescent algılama pestis. süresi 0, 28 ° C'de inkübe muhabiri faj ve hücreler, karışık, ve bioluminesans (RLU) zaman içinde takip edildi. RLU önemli bir artış (* Öğrenciler t-testi, p <0.05), 15 dakika içinde açıktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem, hızla Y. tespit muhabiri faj yeteneği gösterir muhabir faj beri pestis kültürlü Y. bioluminescent sinyal yanıt transduce pestis faj eklenmesinden sonra 20 dakika içinde hücreler. Muhabir faj da doğrudan Y. algılama yeteneğine sahiptir izolasyon ve sonraki ekimi 7 önkoşul olmadan klinik matrisler pestis. Genellikle 48 saat tamamlanması için gereken standart faj lizis deneyleri ile karşılaştırıldığında, önemli ölçüde bu algılama zamanını azaltır.
Önceki çalışmalar, yabani tip ΦA1122 faj neredeyse tüm doğal Y. lyse. göstermiştir pestis izole ve Y. için 'özel' pestis 6,10,11; Ancak, bazı Y. pseudotuberculosis suşları, 20 ° C 6,10,12 üzerindeki sıcaklıklarda yetiştirilen ΦA1122 duyarlı olması gösterilmiştir . Isıya duyarlı diferansiyel duyarlılık nedeni bilinmemektedir, ancak muhtemelen hücre yüzey katmanları / kompozisyon sıcaklığa bağlı değişikliklere nedeniyle. Bu nedenle, potansiyel bir muhabir faj algılama sistemi ihtar suşları ile yakından ilgili türler Y. yanlış pozitif yanıt olasılığı pseudotuberculosis. Kısıtlayıcı sıcaklığı (20 ° C) muhabiri faj tahlil yapılması Y. içeren olabilir örnekleri aldatıcı bir pozitif sinyal önleyecektir . pseudotuberculosis. Böylece, belirli bir sıcaklıkta yetiştirilen izole kültürlerin kullanıldığı özgüllüğü kesinlikle kontrol altına alınabilir.
Y. özeti, hızlı algılama ve teşhis pestis, veba, özellikle pnömonik veba bu yana olumlu bir prognoz için gerekli tedavi semptom başlangıcından sonra ilk 24 saat içinde uygulanabilir değilse, hemen hemen her zaman ölümcüldür . Bu yöntem, kültürlü izolatların teyit kimlik veya klinik olarak anlamlı matrisler içinde bu ihtiyaçları karşılamak için bir potansiyele sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Small Business Innovation Araştırma Programı (NIAID, 1R43AI082698-01) ve Gıda ve Tarım USDA Ulusal Enstitüsü (NIFA, 2009-33610-20028) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco LB agar, Miller | VWR international | 90003-346 | |
| Difco LB broth, Miller | VWR international | 90003-350 | |
| 17 x 100 mm culture tubes | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| n-Decanal | Sigma-Aldrich | D7384 | |
| Veritas microplate luminometer | Turner Biosystems | 9100-001 | |
| Microlite microtiter 96-well plate | VWR international | 62402-984 |
References
- Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents. Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).
- Chu, M. C. Laboratory manual of plague diagnostic tests.. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta. (2000).
- , (1999).
- Inglesby, T. V. Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management. JAMA. 287, 2236-2252 (2002).
- Schuch, R., Fischetti, V. A. Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance. J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).
- Garcia, E. The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes. J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).
- Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis. Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).
- Schofield, D. A., Westwater, C. Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis. Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).
- Chu, M. C. CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis. , Centers for Disease Control and Prevention. 1-19 (2001).
- Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage. J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).
- Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella. J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).
- Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR. PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).
