Summary
Eine einfache Methode zur Identifizierung der prioritären bakteriellen Erregern ist gentechnisch Reporter Phagen verwenden. Diese Reporter-Phagen, die spezifisch für ihre besonderen Wirtsarten sind, sind in der Lage schnell Transduktion eines Biolumineszenz-Signal Antwort auf Wirtszellen. Hier beschreiben wir die Verwendung von Reporter Phagen für den Nachweis von
Abstract
Yersinia pestis und Bacillus anthracis sind Kategorie A bakterielle Erreger, die die Erreger der Pest und Milzbrand sind jeweils 1. Obwohl das natürliche Vorkommen beider Krankheiten "ist jetzt relativ selten sind, ist die Möglichkeit terroristischer Gruppen mit diesen Erregern als Biowaffe Echtzeit. Wegen der Krankheit innewohnende Kommunikationsfähigkeit, schnelle klinischen Verlauf und eine hohe Sterblichkeitsrate, ist es entscheidend, dass ein Ausbruch schnell erkannt werden. Deshalb Methoden, die eine schnelle Erkennung und Diagnose stellen sind unerlässlich, um eine sofortige Umsetzung der Maßnahmen des Gesundheitswesens und die Aktivierung des Krisenmanagements gewährleisten.
Rekombinante Phagen-Reporter kann einen schnellen und spezifischen Ansatz für den Nachweis von Y. pestis und B. anthracis. Die Centers for Disease Control and Prevention nutzen derzeit das klassische Phagen Lyse-Assays für die bestätigten Identifizierung dieser bakteriellen Erregern 2-4. Diese Assays profitieren von natürlich vorkommenden Phagen, die spezifisch und lytisch sind für ihre bakteriellen Wirten. Nach Wachstum über Nacht der kultivierten Bakterien in Gegenwart der spezifischen Phagen, bietet die Bildung von Plaques (bakterielle Lyse) eine positive Identifikation der bakteriellen Ziel. Obwohl diese Tests robust sind, leiden sie unter drei Mängel: 1) sie sind im Labor basiert, 2) die sie benötigen bakterielle Isolierung und Kultivierung von den verdächtigen Probe, und 3) nehmen sie 24-36 h in Anspruch nehmen. Um diese Probleme anzugehen, wurden rekombinante "light-Tag"-Reporter Phagen genetisch durch die Integration der Vibrio harveyi luxAB Gene in das Genom von Y. entwickelt pestis und B. anthracis spezifische Phagen 5-8. Die daraus resultierende luxAB Reporter Phagen konnten ihre spezifische Ziel von schnell zu erkennen (in Minuten) und sensibel Übertragung einer Biolumineszenz Phänotyp an den Empfänger-Zellen. Wichtig ist, war die Detektion entweder mit kultivierten Zellen oder Empfänger mit Mock-infizierte klinische Proben 7 erhalten.
Zu Demonstrationszwecken hier beschreiben wir das Verfahren für die Phagen-vermittelte Erkennung eines bekannten Y. pestis isolieren mit einem luxAB Reporter Phagen von der CDC Pest diagnostische Phagen ΦA1122 6,7 (Abb. 1) konstruiert. Eine ähnliche Methode, mit geringfügigen Änderungen (zB Änderung des Wachstums Temperatur und Medien), kann für den Nachweis von B. verwendet werden anthracis-Isolate mit der B. anthracis Reporter Phagen Wβ: luxAB 8. Die Methode beschreibt die Phagen-vermittelte Transduktion eines biolumescent Phänotyp angebaut Y. pestis Zellen, die anschließend gemessen werden mit einem Mikrotiterplatten-Luminometer. Die wesentlichen Vorteile dieser Methode gegenüber der traditionellen Phagen Lyse-Assays ist die einfache Handhabung, die schnelle Ergebnisse, und die Möglichkeit, mehrere Proben gleichzeitig Test in einer 96-well Mikrotiterplatten-Format.
Abbildung 1. Erkennung schematisch. Die Phagen werden mit der Probe vermischt, infiziert der Phage die Zelle, luxAB ausgedrückt sind, und die Zelle bioluminesces. Probenvorbereitung ist nicht notwendig, die Phagen und Zellen vermischt und anschließend für Licht gemessen.
Protocol
1. Y. pestis Platte Impfung
- Streak Y. pestis A1122 (BeiResources # NR15) Stammkulturen auf Luria-Bertani (LB)-Agar (Miller). Verwenden Sie sterile Technik und erfüllen alle Y. pestis Manipulationen in einer Klasse-II-Typ A Biosicherheitswerkbank. Y. pestis A1122 ist ein Biosafety Level (BSL) 2 ausgeschlossen wählen Agent Belastung. Es fehlt sowohl die 75 kb Paar Low-Calcium-Reaktion (LCR) Virulenzplasmid und pgm locus, dass für die Virulenz erforderlich sind. Wachsen Sie Y. pestis bei 28 ° C für 48 h in einer statischen temperaturgeregelten Luft Inkubator. Die Wachstumsrate von Y. pestis ist langsam mit einer Generationszeit von 1,25 h 9.
2. Y. pestis flüssigen Medien Impfung
- Übertragen einer einzigen Y. pestis Kolonie in eine sterile 17 x 100 mm Kultur Röhrchen mit 2 ml LB-Medium mit einer sterilen Impföse Metall. Wählen Sie eine Kolonie, die eine einheitliche Größe ist, ist bezeichnend für die anderen Kolonien, und sich deutlich von dem Rest der Kolonien auf der Platte getrennt. Vortex Tube kurz und wachsen bei 28 ° C für ca. 20 h in einem Schüttelinkubator (225 rpm).
3. Y. pestis Auswuchs, Reporter Phagen hinaus und Biolumineszenz-Erkennung
- Verdünnen Sie die Nacht Y. pestis Kultur 1:20 in frischem LB-Medium in einem 50 ml Falcon-Röhrchen (z. B. 500 ul der Zellen in 9,5 ml Medium) und wachsen bei 28 ° C unter Schütteln (225 rpm). Wachsen, bis eine optische Dichte bei 600 nm (A 600) von 0,2 erreicht ist (ca. 5 h). Aktiv wachsende Zellen sind zu bevorzugen für den Nachweis, da die Fähigkeit des Phagen zu transduzieren einem biolumineszierenden Reaktion auf die Lebensfähigkeit und die Fitness des Wirtes Bakterien korreliert ist. Dennoch hat das Detektionssystem konnte gezeigt werden, kompatibel mit Zellen in allen Phasen des Wachstumszyklus 7 geerntet.
- Generieren Sie das Substrat, die für die Biolumineszenzreaktion durch Herstellung einer 2% n-Decanal Lösung. Mix 200 ul n-Decanal mit 9,8 ml LB-Brühe. Vortex kräftig 5 s. Prime der Mikroplatten-Luminometer Injektor mit 2 ml der 2%-n-Decanal Lösung. Pre-set das Luminometer auf 67 ul der Decanal Lösung für jede Mikrotiterplatten und dann autoinject sofort lesen Sie die Probe für 10 s.
- Dispense 1 mL Aliquots von LB-Medium in 3 Kulturröhrchen. Add 20 uL des Reporters Phagen-Stammlösung (stock von 5 x 10 9 Plaque-bildenden Einheiten [PFU] / ml) in jedes Röhrchen, die Phagen-und Medien-alone-Proben dient als negative Kontrolle. In Abwesenheit von Y. pestis-Zellen, sollte die Zugabe des Reporters Phagen nicht entlocken eine Biolumineszenz Antwort.
- Dispense 1 mL Aliquots der Y. pestis Kultur (aus Schritt 3.1) in 6 Kulturröhrchen. Add 20 uL des Reporters Phagenstock bis 3 der Kulturen (Testkulturen). Die restlichen 3 Kulturen dienen als "Zellen allein" Negativ-Kontrolle (Hintergrund autobioluminescence). Mix Kulturen durch Vortexen kurz, und die Ernte 200 ul von jeder Probe (für die Zeit 0 zu lesen) und verzichten in eine weiße 96-well Mikrotiterplatten. Inkubieren Sie die verbleibenden Kultur bei 28 ° C unter Schütteln (225 rpm).
- Messen Sie die Zeit 0 Muster für Biolumineszenz (relative light units, RLU) mit dem Mikrotiterplatten-Luminometer.
- Ernte 200 ul jeder Probe nach 10, 20, 30, 40, 50 und 60 min post-Reporter Phagen hinaus und messen Sie die Probe für die Biolumineszenz. Wenn Y. pestis Zellen vorhanden sind, wird der Reporter Phagen spezifisch an die Zellen binden, injizieren ihre DNA, und die Gastgeber der Transkription und Translation Maschinen zu transkribieren und übersetzen die luxAB Reportergene (Abbildung 1).
- Die Stärke des Signals und der Signal-Response-Zeit ist proportional zu der Anzahl der Zellen zu präsentieren. Bei hohen Konzentrationen von Zellen (10 5 -10 8 CFU / ml), einen signifikanten Anstieg in RLU im Vergleich zu den Kontrollen sollten innerhalb von 20 min deutlich. Am unteren Zelle Konzentrationen (10 2 -10 4 KBE / ml), sollte eine deutliche Steigerung in RLU werden innerhalb von 40-60 min deutlich.
- Alternativ zur Erkennung ohne die Notwendigkeit für Y. beschleunigen pestis Auswuchs, eine Kolonie von einer frisch gewachsenen Platte gemischt (durch Vortexen) direkt in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 200 ul LB-Brühe, Beherbergung der Reporter Phagen werden. Dosieren Sie die Zelle / Phagen Mischung in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte. Inkubieren Sie die Mikrotiterplatte bei 28 ° C und lesen Sie die Probe für die Biolumineszenz nach 60 min (single Zeitpunkt nur).
4. Repräsentative Ergebnisse:
Ein Vertreter Zeitverlauf Experiment Reporter Phagen-vermittelte Erkennung von Y. pestis ist in Abbildung 2 dargestellt. Die negativen Kontrollen von 1) Phagen allein (keine Zellen), oder 2)-Zellen allein (ohne Phagen) bieten Baseline-Wertes der Biolumineszenz von ca. 20 RLU während der 60 min inkl.ubation (Ausgangswerte sind Luminometer spezifisch). Im Gegensatz dazu ist eine Zunahme der Biolumineszenz für die Testproben (reporter Phagen und Zellen) bei 15 min nach dem Phagen Neben evident. Die Signalstärke sollte stetig über 60 min. Inkubationen für längere Zeit (über 80 min), wird in ein Signal, das von der Spitze Signal aufgrund vermittelte Lyse der Wirtszellen Phagen Rückgang führen wird. Ähnliche Ergebnisse werden bei einer Inkubationstemperatur von 37 ° C gewonnen wurde, obwohl die optimale Temperatur für Y. pestis Wachstum beträgt 28 ° C 9.
Abbildung 2. Phage-vermittelte Biolumineszenz Detektion von Y. pestis. Zum Zeitpunkt 0, Reporter Phagen und Zellen wurden gemischt, bei 28 ° C, und Biolumineszenz (RLU) wurde im Laufe der Zeit überwacht. Ein signifikanter Anstieg in RLU (* Studenten t-Test, p <0,05) liegt auf der Hand innerhalb von 15 min.
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Discussion
Diese Methode zeigt die Fähigkeit des Reporters Phagen schnell erkennen Y. pestis, da die Reporter Phagen können transduzieren eines Biolumineszenz-Signal Antwort auf kultivierten Y. pestis-Zellen innerhalb von 20 min nach dem Phagen hinaus. Der Reporter Phagen ist auch in der Lage direkt nachzuweisen Y. pestis in klinischen Matrizen, ohne die Voraussetzung der Isolation und der anschließende Kultivierung 7. Im Vergleich zu den Standard-Phagen-Lyse-Assays die in der Regel 48 h für die Fertigstellung dieses deutlich verringert die Zeit zur Erkennung.
Frühere Studien haben gezeigt, dass die Wildtyp-ΦA1122 Phagen können fast alle natürlichen Y. lysieren pestis-Isolate, und ist "spezifisch" für Y. pestis 6,10,11, aber einige Y. pseudotuberculosis-Stämme haben sich gezeigt, dass ΦA1122 anfällig, wenn sie bei Temperaturen über 20 ° C 6,10,12 gewachsen. Der Grund für die Temperatur-sensitive Differential Anfälligkeit ist unbekannt, aber vermutlich aufgrund der Temperatur-abhängigen Veränderungen in der Zelle Oberflächenschichten / Komposition. Daher ist eine mögliche Einschränkung des Reporters Phagen Detection System die Möglichkeit eines falsch-positive Reaktion mit Stämmen aus den eng verwandten Spezies Y. pseudotuberculosis. Performing the Reporter Phagen-Assay bei der restriktiven Temperatur (20 ° C) verhindert ein falsch positives Signal in Proben, die Y. enthalten können pseudotuberculosis. So kann die Spezifität streng kontrolliert werden, wenn unter Verwendung von isolierten Kulturen bei einer bestimmten Temperatur gewachsen.
Zusammenfassend schnelle Erkennung und Diagnose von Y. pestis ist für eine positive Prognose seit der Pest, vor allem Lungenpest wesentlich ist, ist fast immer tödlich, wenn die Behandlung nicht innerhalb der ersten 24 Stunden nach Symptombeginn verabreicht. Diese Methode hat das Potenzial, diese Anforderungen für die bestätigt Identifizierung von kultivierten Isolaten oder innerhalb von klinisch relevanten Matrizen erfüllen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Small Business Innovation Research-Programm des National Institutes of Health (NIAID, 1R43AI082698-01) und der USDA National Institute of Food and Agriculture (NIFA, 2009-33610-20028) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco LB agar, Miller | VWR international | 90003-346 | |
| Difco LB broth, Miller | VWR international | 90003-350 | |
| 17 x 100 mm culture tubes | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| n-Decanal | Sigma-Aldrich | D7384 | |
| Veritas microplate luminometer | Turner Biosystems | 9100-001 | |
| Microlite microtiter 96-well plate | VWR international | 62402-984 |
References
- Darling, R. G., Catlett, C. L., Huebner, K. D., Jarrett, D. G. Threats in bioterrorism. I: CDC category A agents. Emerg Med Clin North Am. 20, 273-309 (2002).
- Chu, M. C. Laboratory manual of plague diagnostic tests.. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta. (2000).
- , (1999).
- Inglesby, T. V. Anthrax as a biological weapon, 2002: updated recommendations for management. JAMA. 287, 2236-2252 (2002).
- Schuch, R., Fischetti, V. A. Detailed genomic analysis of the Wbeta and gamma phages infecting Bacillus anthracis: implications for evolution of environmental fitness and antibiotic resistance. J Bacteriol. 188, 3037-3051 (2006).
- Garcia, E. The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage phiA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes. J Bacteriol. 185, 5248-5262 (2003).
- Schofield, D. A., Molineux, I. J., Westwater, C. Diagnostic bioluminescent phage for detection of Yersinia pestis. Journal of Clinical Microbiology. 47, 3887-3894 (2009).
- Schofield, D. A., Westwater, C. Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis. Journal of Applied Microbiology. 107, 468-478 (2009).
- Chu, M. C. CDC: Basic laboratory protocols for the presumptive identification of Yersinia pestis. , Centers for Disease Control and Prevention. 1-19 (2001).
- Gunnison, J. B., Larson, A., Lazarus, A. S. Rapid differentiation between Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis by action of bacteriophage. J Infect Dis. 88, 254-255 (1951).
- Lazarus, A. S., Gunnison, J. B. The Action of Pasteurella pestis Bacteriophage on Strains of Pasteurella, Salmonella, and Shigella. J Bacteriol. 53, 705-714 (1947).
- Sergueev, K. V., He, Y., Borschel, R. H., Nikolich, M. P., Filippov, A. A. Rapid and sensitive detection of Yersinia pestis using amplification of plague diagnostic bacteriophages monitored by real-time PCR. PLoS One. 5, e11337-e11337 (2010).
