Summary
Um método simples para a identificação de patógenos bacterianos prioridade é a utilização de fagos repórter geneticamente modificadas. Estes fagos repórter, que são específicas para sua espécie de hospedeiro particular, são capazes de transdução rapidamente uma resposta de sinal bioluminescentes para células hospedeiras. Relata-se o uso de fagos repórter para a detecção de
Abstract
Yersinia pestis e Bacillus anthracis Categoria A são bactérias que são os agentes causadores da praga e antraz, respectivamente 1. Embora a ocorrência natural de ambas as doenças "agora é relativamente rara, a possibilidade de grupos terroristas com estes patógenos como uma arma biológica é real. Por causa da comunicabilidade inerente da doença, evolução clínica rápida e alta taxa de mortalidade, é fundamental que um surto ser detectados rapidamente. Portanto metodologias que proporcionam a rápida detecção e diagnóstico são essenciais para garantir a implementação imediata de medidas de saúde pública e ativação de gestão de crises.
Fago recombinante repórter pode proporcionar uma abordagem rápida e específica para a detecção de Y. pestis e B. anthracis. Os Centros de Controle e Prevenção de Doenças atualmente usam os ensaios de lise clássica fago para a identificação confirmada destes patógenos bacterianos 2-4. Estes ensaios aproveitar naturalmente fago que são específicas e lítico para seus hospedeiros bacterianos. Após o crescimento durante a noite da bactéria cultivada na presença do fago específico, a formação de placas (lise bacteriana) fornece uma identificação positiva do alvo bacteriana. Embora estes ensaios são robustos, eles sofrem de três problemas: 1) eles são em laboratório; 2) requerem isolamento bacteriano e cultivo da amostra suspeita, e 3) eles levam 24-36 h para completar. Para tratar dessas questões, fago recombinante repórter "light-com a tag" foram geneticamente modificados através da integração do Vibrio harveyi luxAB genes no genoma de Y. pestis e B. anthracis fago específico 5-8. O fago repórter resultando luxAB foram capazes de detectar o seu alvo específico, rapidamente (em minutos) e com sensibilidade conferir um fenótipo bioluminescentes para células receptoras. Importante, a detecção foi obtido tanto com células cultivadas ou destinatário com mock-infectados amostras clínicas 7.
Para fins de demonstração, aqui descrever o método para a detecção fago-mediada de um Y. conhecida pestis isolar usar um fago repórter luxAB construído a partir da praga CDC diagnóstico fago ΦA1122 6,7 (Figura 1). Um método semelhante, com pequenas modificações (por exemplo, mudança na temperatura de crescimento e media), pode ser usado para a detecção de B. anthracis isola usando o B. anthracis Wβ fago repórter:: luxAB 8. O método descreve a transdução mediada por fagos de um fenótipo biolumescent para Y. cultivada pestis células que são posteriormente medido com um luminômetro. As principais vantagens deste método sobre os ensaios de lise tradicional fago é a facilidade de uso, os resultados rápidos, e a capacidade de testar múltiplas amostras ao mesmo tempo em um formato de placa de 96 poços de microtitulação.
Figura 1. Esquema de detecção. O fago são misturados com a amostra, o fago infecta a célula, luxAB são expressos, e os bioluminesces celular. Processamento da amostra não é necessário; o fago e são misturadas e, posteriormente, medido para a luz.
Protocol
1. Y. pestis inoculação placa
- Streak Y. pestis A1122 (BeiResources # NR15) em culturas de Luria-Bertani (LB) ágar (Miller). Use técnica estéril e executar todas as Y. manipulações pestis em um tipo II classe A biossegurança gabinete. Y. pestis A1122 é um Nível de Biossegurança (BSL) 2 estirpe agente excluídos selecionar. Falta-lhe tanto os 75 kb par de cálcio de baixa virulência de resposta (LCR) plasmídeo, eo locus pgm que são necessários para a virulência. Crescer Y. pestis a 28 ° C por 48 h em uma temperatura controlada de ar estática incubadora. A taxa de crescimento de Y. pestis é lento com um tempo de geração de 1,25 h 9.
2. Y. pestis líquido media inoculação
- Transferência de um único Y. pestis colônia em um estéril 17 x 100 milímetros tubo de cultura contendo 2 mL de caldo LB usando um loop de inoculação estéril metal. Selecione uma colônia que é uniforme em tamanho, é indicativo de outras colônias, e é claramente separada do resto das colônias na placa. Tubo de vórtice brevemente e crescer a cultura a 28 ° C por aproximadamente 20 h em uma incubadora de agitação (225 rpm).
3. Y. conseqüência pestis, além fago repórter, e detecção bioluminescentes
- Diluir o Y. overnight pestis 1:20 cultura em caldo LB fresco em um tubo falcon de 50 mL (por exemplo, 500 mL de células em 9,5 mL de meio) e crescer a 28 ° C com agitação (225 rpm). Crescer até uma densidade óptica a 600 nm (A 600) de 0,2 é atingido (cerca de 5 h). Células em crescimento activo são preferíveis para a detecção desde a capacidade dos fagos para transduzir uma resposta bioluminescentes está correlacionada com a viabilidade e adequação das bactérias host. No entanto, o sistema de detecção foi mostrado para ser compatível com células colhidas em todas as fases do ciclo de crescimento 7.
- Gerar o substrato necessário para a reação bioluminescente, preparando uma solução de 2% n-Decano. Misturar 200 mL de n-Decano com 9,8 mL de caldo LB. Vortex vigorosamente durante 5 s. Primeiro a microplaca luminômetro injector com 2 mL da solução 2% n-Decano. Pré-definir o luminômetro para autoinject 67 mL da solução decanal a cada microplaca e logo em seguida ler a amostra para 10 s.
- Dispense um alíquotas mL de caldo LB em 3 tubos de cultura. Adicionar 20 mL da solução-mãe repórter fago (estoque de 5 x 10 9 unidades formadoras de placa [UFP] / mL) a cada tubo; o fago e amostras de mídia só serve como um controle negativo. Na ausência de Y. células pestis, a adição do fago repórter não deve provocar uma resposta bioluminescente.
- Dispense um alíquotas mL da Y. pestis cultura (a partir do passo 3.1) em 6 tubos de cultura. Adicionar 20 mL do estoque fago repórter a 3 das culturas (culturas de teste). Os restantes três culturas servir de "células sozinho 'controle negativo (autobioluminescence fundo). Mix culturas em vortex brevemente, e 200 mL de colheita de cada amostra (para o tempo 0 lido) e dispensar em uma placa de microtitulação de 96 poços branco. Incubar a cultura restantes a 28 ° C com agitação (225 rpm).
- Medir o tempo 0 amostras para bioluminescência (unidade relativa de luz, RLU), utilizando o luminômetro.
- ML colheita 200 de cada amostra após 10, 20, 30, 40, 50 e 60 min Além fago pós-repórter, e medir a amostra de bioluminescência. Se Y. pestis células estão presentes, o fago repórter vai se ligam especificamente para a célula, injetar seu DNA, e usar o hosts maquinaria transcricional e translacional para transcrever e traduzir os genes repórter luxAB (Figura 1).
- A força do sinal eo tempo de resposta do sinal é proporcional ao número de células presentes. Em altas concentrações de células (10 5 a 10 8 UFC / mL), um aumento significativo na RLU comparados com os controles devem ser evidente dentro de 20 min. Em concentrações mais baixas de células, (10 2 -10 4 UFC / mL), um aumento significativo na RLU deve ser evidente dentro de 40-60 min.
- Como alternativa, para agilizar o processo de detecção sem a necessidade de Y. pestis conseqüência, uma colônia de uma placa de recém-cultivada pode ser misturado (em vórtice) diretamente em um tubo eppendorf 1,5 mL com 200 mL de caldo LB abrigar o fago repórter. Dispense a mistura de células / fago em um poço de uma placa de microtitulação. Incubar a placa de microtitulação a 28 ° C e ler a amostra para bioluminescência após 60 min (único momento apenas).
4. Resultados representativos:
A experiência é claro representante tempo de fago repórter mediada detecção de Y. pestis é retratado na Figura 2. Os controles negativos de 1) fago sozinho (sem células), ou 2) células sozinho (sem fago) fornecem níveis basais de bioluminescência de aproximadamente 20 em todo o RLU 60 min incubation (níveis basais são específicos luminômetro). Em contraste, um aumento de bioluminescência para as amostras de teste (fago repórter e células) é evidente aos 15 min após a adição do fago. A intensidade do sinal deve aumentar de forma constante durante 60 min. Incubações por períodos de tempo prolongado (mais de 80 min), resultará em um sinal de que vai diminuir a partir do sinal de pico devido à lise mediada fago das células do hospedeiro. Resultados semelhantes foram obtidos em temperaturas de incubação de 37 ° C, embora a temperatura ótima para Y. crescimento pestis é de 28 ° C 9.
Figura 2. Phage mediada detecção bioluminescente de Y. pestis. No tempo 0, fago repórter e as células foram misturadas, incubados a 28 ° C, e bioluminescência (RLU) foi monitorado ao longo do tempo. Um aumento significativo em RLU (* Estudantes t-test, p <0,05) é evidente dentro de 15 min.
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Discussion
Este método demonstra a capacidade do fago repórter para detectar rapidamente Y. pestis desde o fago repórter pode converter uma resposta de sinal bioluminescente para Y. cultivadas pestis células dentro de 20 min após a adição do fago. O fago repórter também é capaz de detectar diretamente Y. pestis em matrizes clínico, sem o pré-requisito de isolamento e cultivo de 7 subseqüente. Em comparação com os ensaios fago padrão de lise, que normalmente exige 48 h para a conclusão, este diminui significativamente o tempo de detecção.
Estudos anteriores demonstraram que o tipo selvagem fago ΦA1122 pode lisar quase todos naturais Y. pestis isolados, e é "específica" para Y. pestis 6,10,11, porém alguns Y. cepas pseudotuberculosis foram mostrados para ser ΦA1122 suscetíveis quando cultivada em temperaturas acima de 20 ° C 6,10,12. A razão para a suscetibilidade diferencial de temperatura-sensível é desconhecida, mas provavelmente devido à temperatura-dependente mudanças nas camadas de superfície celular / composição. Portanto, uma ressalva potencial do sistema de detecção de repórter fago é a possibilidade de uma resposta falso-positivo com cepas da estreitamente relacionados espécies Y. pseudotuberculosis. Realização do ensaio fago repórter na temperatura restritiva (20 ° C) vai impedir que um falso sinal positivo nas amostras que podem conter Y. pseudotuberculosis. Assim, a especificidade pode ser estritamente controlada ao usar culturas isoladas crescido a uma temperatura específica.
Na detecção de resumo, rápido e diagnóstico de Y. pestis é essencial para um prognóstico positivo, pois a praga, a peste pneumônica, especialmente, é quase sempre fatal se o tratamento não é administrado dentro das primeiras 24 horas após o início dos sintomas. Este método tem o potencial de atender a essas necessidades para a identificação confirmada de isolados cultivados ou dentro de matrizes clinicamente relevantes.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pequenas Business Innovation Research do National Institutes of Health (NIAID, 1R43AI082698-01) e do USDA Instituto Nacional de Alimentação e Agricultura (Nifa, 2009-33610-20028).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco LB agar, Miller | VWR international | 90003-346 | |
| Difco LB broth, Miller | VWR international | 90003-350 | |
| 17 x 100 mm culture tubes | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| n-Decanal | Sigma-Aldrich | D7384 | |
| Veritas microplate luminometer | Turner Biosystems | 9100-001 | |
| Microlite microtiter 96-well plate | VWR international | 62402-984 |
References
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