Summary
Un metodo semplice per l'identificazione di batteri patogeni priorità è quella di utilizzare fago giornalista geneticamente modificato. Queste fago reporter, che sono specifici per la loro specie ospite particolare, sono in grado di trasduzione rapidamente una risposta bioluminescente segnale alle cellule ospite. Qui, descriviamo l'uso del fago giornalista per la rilevazione di
Abstract
Yersinia pestis e Bacillus anthracis sono di categoria A batteri patogeni che sono gli agenti causali della peste e antrace, rispettivamente 1. Anche se la presenza naturale di entrambe le malattie 'è ora relativamente rara, la possibilità di gruppi terroristici con questi patogeni come arma biologica è reale. A causa della intrinseca comunicabilità della malattia, rapido decorso clinico, e alto tasso di mortalità, è fondamentale che un focolaio essere rilevati rapidamente. Pertanto le metodologie che consentono il rilevamento rapido e la diagnosi sono essenziali per garantire l'attuazione immediata di misure di sanità pubblica e l'attivazione della gestione delle crisi.
Fago ricombinante giornalista può fornire un approccio rapido e specifico per l'individuazione di Y. pestis e B. anthracis. I Centri per il Controllo delle Malattie e la Prevenzione attualmente utilizzano il classico test lisi dei fagi per l'identificazione ha confermato di questi batteri patogeni 2-4. Questi test sfruttare naturale fago che sono specifici e litico per i loro ospiti batterici. Dopo una crescita durante la notte del batterio coltivato in presenza del fago specifico, la formazione di placche (lisi batterica) fornisce una identificazione positiva del target batterico. Anche se questi test sono robusti, soffrono da tre difetti: 1) sono di laboratorio, 2) che richiedono l'isolamento e la coltura batterica dal campione sospetto, e 3) prendono 24-36 ore per essere completato. Per affrontare questi problemi, ricombinante "light-tag" fago giornalista sono stati geneticamente modificati, integrando le Vibrio harveyi luxAB geni nel genoma di Y. pestis e B. anthracis fago specifico 5-8. La risultante dei fagi giornalista luxAB sono stati in grado di rilevare i loro target specifico, mediante una rapida (pochi minuti) e sensibile che conferisce un fenotipo bioluminescente di cellule riceventi. È importante sottolineare che il rilevamento è stato ottenuto sia con cellule riceventi coltivate o con campioni clinici mock-infettate 7.
A scopo dimostrativo, qui si descrive il metodo per il fago-mediata rilevamento di un noto Y. pestis isolare con un fago luxAB giornalista costruito dalla peste CDC diagnostica fago ΦA1122 6,7 (Figura 1). Un metodo simile, con piccole modifiche (ad esempio cambiamento della temperatura di crescita e media), possono essere utilizzati per la rilevazione di B. anthracis isola con il B. anthracis fago Wβ reporter:: luxAB 8. Il metodo descrive il fago-mediata trasduzione di un fenotipo biolumescent ad essere coltivato Y. pestis cellule che vengono successivamente misurata con un luminometro per micropiastre. I principali vantaggi di questo metodo il test tradizionale lisi dei fagi è la facilità di utilizzo, i risultati rapidi e la possibilità di testare campioni multipli simultaneamente in un formato a 96 pozzetti di micropiastre.
Figura 1. Schema di rilevamento. I fagi sono mescolati con il campione, il fago infetta il cellulare, luxAB sono espressi, e il bioluminesces cellula. Trattamento dei campioni non è necessaria; il fago e le cellule sono mescolate e successivamente valutate per la luce.
Protocol
1. Y. pestis piastra inoculazione
- Streak Y. pestis A1122 (BeiResources # NR15) colture su Luria-Bertani (LB) agar (Miller). Utilizzare una tecnica sterile ed eseguire tutte le Y. manipolazioni pestis in un tipo di classe II A cabinet. biosicurezza Y. pestis A1122 è un livello di biosicurezza (BSL) 2 ceppo esclusi agente selezionare. Manca sia la coppia 75 kb basso contenuto di calcio di risposta (LCR) plasmide di virulenza, e il luogo pgm che sono necessari per la virulenza. Crescere Y. pestis a 28 ° C per 48 ore a temperatura statica aria incubatrice. Il tasso di crescita di Y. pestis è lenta con un tempo di generazione di 1,25 h 9.
2. Y. pestis liquido mezzi inoculazione
- Trasferire un singolo Y. colonia pestis in una sterile 17 x 100 mm Tubo di coltura contenente 2 ml di brodo LB sterile utilizzando un anello di metallo inoculazione. Seleziona una colonia che è uniforme nelle dimensioni, è indicativo delle altre colonie, ed è chiaramente separato dal resto delle colonie sulla piastra. Tubo vorticoso brevemente e far crescere la cultura a 28 ° C per circa 20 ore in una agitazione incubatore (225 giri).
3. Y. pestis escrescenza, fago Inoltre giornalista, e il rilevamento bioluminescenti
- Diluire la notte Y. pestis 1:20 cultura in brodo LB fresco in un tubo da 50 ml falco (ad esempio, 500 ml di cellule in 9,5 ml di terreno) e crescono a 28 ° C con agitazione (225 giri). Crescere fino a una densità ottica a 600 nm (A 600) di 0,2 si raggiunge (circa 5 h). Cellule in attiva crescita sono da preferire per il rilevamento in quanto la capacità del fago per trasdurre una risposta bioluminescente è correlato alla vitalità e benessere dei batteri ospitante. Tuttavia, il sistema di rilevazione ha dimostrato di essere compatibile con le cellule raccolte in tutte le fasi del ciclo di crescita 7.
- Generare il substrato necessario per la reazione bioluminescente preparando un 2% di n-decanale soluzione. Mescolare 200 ml di n-decanale con 9,8 ml di brodo LB. Energicamente per 5 s. Primo la micropiastra luminometro iniettore con 2 mL di n-2% decanale soluzione. Pre-impostare il luminometro al autoinject 67 microlitri della soluzione del decanale ad ogni micropiastra bene e poi subito a leggere il campione per 10 s.
- Dispensare 1 ml di brodo LB in 3 provette di coltura. Aggiungere 20 ml di soluzione madre giornalista fago (stock di 5 x 10 9 unità placca formando [UFP] / mL) a ciascuna provetta, il fago e dei media di campioni da solo funge da controllo negativo. In assenza di Y. cellule pestis, l'aggiunta del fago giornalista non dovrebbe suscitare una reazione bioluminescente.
- Dispensare 1 ml di Y. pestis cultura (dal punto 3.1) in 6 tubi cultura. Aggiungere 20 ml di stock fago giornalista a 3 delle culture (culture di prova). I restanti 3 culture servire come 'cellule solo' di controllo negativo (autobioluminescence sfondo). Mescolare culture vortexando brevemente, e la raccolta 200 ul di ciascun campione (per leggere il tempo 0) ed erogare in un piatto bianco microtitolo a 96 pozzetti. Incubare la cultura rimanendo a 28 ° C con agitazione (225 giri).
- Misurare il tempo 0 campioni per bioluminescenza (unità di luce relativa, RLU) utilizzando il luminometro per micropiastre.
- Harvest 200 ul di ciascun campione dopo 10, 20, 30, 40, 50 e 60 minuti post-giornalista Inoltre fago, e misurare il campione per bioluminescenza. Se Y. pestis cellule sono presenti, il fago giornalista si legano specificamente alla cellula, inietta il suo DNA, e utilizzare i padroni di casa macchinario trascrizionale e traslazionale di trascrivere e tradurre i geni reporter luxAB (Figura 1).
- La forza del segnale e il tempo di risposta del segnale è proporzionale al numero di cellule presenti. Ad alte concentrazioni di cellule (10 5 -10 8 UFC / ml), un significativo aumento RLU rispetto ai controlli dovrebbe essere evidente entro 20 min. A concentrazioni cella inferiore, (10 2 -10 4 UFC / ml), un significativo aumento RLU dovrebbe essere evidente entro 40-60 min.
- In alternativa, per accelerare il processo di rilevamento senza la necessità di Y. escrescenza pestis, una colonia da un piatto fresco cresciuto possono essere mescolati (nel vortex) direttamente in una provetta Eppendorf 1,5 ml con 200 ml di brodo LB ospitare il fago reporter. Dispensare la cellula / fago miscela in un pozzo della micropiastra. Incubare la micropiastra a 28 ° C e leggere il campione per bioluminescenza dopo 60 min (punto di volta sola).
4. Rappresentante dei risultati:
Un rappresentante esperimento durata di fago giornalista mediata rilevamento di Y. pestis è illustrato nella figura 2. I controlli negativi di 1) fago da solo (senza cellule), o 2) le cellule da solo (senza fago) forniscono livelli basali di bioluminescenza di circa 20 RLU tutto il min 60 incubation (livelli basali sono specifici luminometro). Al contrario, un aumento della bioluminescenza per i campioni di prova (fagi giornalista e cellule) è evidente a 15 minuti dopo l'aggiunta dei fagi. La potenza del segnale dovrebbe aumentare costantemente più di 60 min. Incubazioni per periodi di tempo prolungati (oltre 80 min), si tradurrà in un segnale che scenderà dal segnale di picco a causa di fagi lisi mediata delle cellule ospiti. Risultati simili si ottengono a temperature di incubazione di 37 ° C anche se la temperatura ottimale per Y. crescita pestis è di 28 ° C 9.
Figura 2. Fago-mediata rilevazione bioluminescenti di Y. pestis. Al tempo 0, fagi giornalista e le cellule sono state mescolate, incubate a 28 ° C, e la bioluminescenza (RLU) è stata monitorata nel tempo. Un aumento significativo RLU (* Studenti t-test, p <0,05) è evidente entro 15 min.
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Discussion
Questo metodo dimostra la capacità del fago giornalista per rilevare rapidamente Y. pestis dal fago giornalista può trasdurre una risposta bioluminescente segnale colto Y. pestis cellule entro 20 minuti dopo l'aggiunta dei fagi. Il fago giornalista è anche in grado di rilevare direttamente Y. pestis in matrici clinica, senza il presupposto di isolamento e 7 successiva coltivazione. Rispetto ai test standard di lisi fagica che in genere richiedono 48 ore per il completamento, questo riduce sensibilmente i tempi di rilevazione.
Studi precedenti hanno dimostrato che il wild-type fago ΦA1122 può lisare quasi tutti naturali Y. pestis isolati, e 'specifico' per Y. pestis 6,10,11, tuttavia, alcuni Y. ceppi pseudotuberculosis hanno dimostrato di essere ΦA1122 suscettibili, se coltivate a temperature superiori a 20 ° C 6,10,12. La ragione per la temperatura-sensibili suscettibilità differenziale è sconosciuta, ma presumibilmente a causa della temperatura-dipendente cambiamenti negli strati superficiali della cellula / composizione. Quindi, un avvertimento potenziale del sistema di rilevazione dei fagi giornalista è la possibilità di un falso positivo di risposta con ceppi dal strettamente legati specie Y. pseudotuberculosis. Esecuzione del test dei fagi giornalista alla temperatura restrittiva (20 ° C) impedisce un falso segnale positivo in campioni che possono contenere Y. pseudotuberculosis. Così, la specificità può essere strettamente controllati durante l'utilizzo culture isolate cresciute ad una temperatura specifica.
In sintesi, rapida individuazione e la diagnosi di Y. pestis è essenziale per una prognosi positiva in quanto la peste, la peste polmonare in particolare, è quasi sempre fatale se il trattamento non viene somministrato entro le prime 24 ore dopo l'insorgenza dei sintomi. Questo metodo ha il potenziale per soddisfare queste esigenze per l'identificazione degli isolati confermato coltivate o all'interno di matrici di rilevanza clinica.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca Piccole Imprese per l'Innovazione del National Institutes of Health (NIAID, 1R43AI082698-01) e l'USDA Istituto Nazionale di Alimentazione e l'Agricoltura (NIFA, 2009-33610-20028).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco LB agar, Miller | VWR international | 90003-346 | |
| Difco LB broth, Miller | VWR international | 90003-350 | |
| 17 x 100 mm culture tubes | USA Scientific, Inc. | 1485-0810 | |
| n-Decanal | Sigma-Aldrich | D7384 | |
| Veritas microplate luminometer | Turner Biosystems | 9100-001 | |
| Microlite microtiter 96-well plate | VWR international | 62402-984 |
References
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