Summary
Fare beyni infiltre lökositler elde etmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, sürekli Percoll degrade ve süreksiz Ficoll degrade lökosit zenginleştirilmiş katmanı seçin ve arındırmak için kullanır. İzole lökositler akım sitometrik ölçümleri ile karakterize olabilir.
Abstract
Biz farelerin beyin infiltre lökositler (BILs) hazırlamak için bir metodu tanımlar. Biz tüm beyin hücrelerinin infiltre bir lökosit zenginleştirilmiş nüfus nasıl arındırmak için hızlı bir intrakraniyal enjeksiyon tekniği ile Theiler fare ensefalomiyelit virüsü (TMEV) ile enfekte fareler nasıl gösterilmektedir. Kısaca, fare, kapalı bir odasında izofluran ile anestezi ve serbest el frontal korteksin içine Hamilton şırınga ile enjekte edilir. Fare sonra bir Tenbroeck doku değirmeni ile RPMI ayıklanır ve homojenize izofluran doz aşımı ve bütün beyinleri tarafından enfeksiyondan sonra değişik zamanlarda öldürüldü. Beyin homojenatlarında miyelin ve diğer hücre enkaz kaldırmak için sürekli% 30 Percoll degrade ile santrifüj edilir. Hücre süspansiyonu daha sonra 40 mikron gergin, yıkanmış ve süreksiz Ficoll-Paque Plus degrade santrifüj lökosit seçin ve arındırmak için. Lökosit sonra yıkanır ve flow sitometri ile işaretleyicidir için uygun tamponlar yeniden süspanse. Flow sitometri, enfeksiyonun erken aşamalarında C57BL / 6 farelerde doğuştan gelen bağışıklık hücreleri bir nüfusa ortaya koymaktadır. 24 saat enfeksiyonu, bağışıklık hücrelerinin birden fazla altkümelerini Gr1 +, CD11b + ve F4/80 + hücreler zenginleştirilmiş bir nüfusa sahip, BILs mevcut . Bu nedenle, bu yöntem, beyinde akut enfeksiyon bağışıklık yanıtı karakterize yararlıdır.
Protocol
1. İntrakranial virüs enjeksiyonu:
Aşağıdaki teknik değiştirilmiş ve laboratuar ve meslektaşları tarafından yaygın olarak kullanılmıştır. Kısaca, intrakranial enjeksiyon Theiler fare ensefalomiyelit virüsü (TMEV) veya sahte-enfeksiyon Daniel suşu (1, 10) beyin infiltre lökositler (BILs) ortaya çıkarmak için genç farelerde (yaş tercihen 5-6 hafta) yapılır. Daniel zorlanma, fasulye zorlanma ve GDVII suşu arasında farklılık olacağını lütfen unutmayınız. BILs hasat amaçla, fareler TMEV, 2x10 5 PFU almak ve 24 saat için bulaşmış.
- Otomatik olarak 1 ml Hamilton şırınga, bir iğne (27 gauge ¼ Kendall) takın ve virüsü 10 ul teslim ayarlayabilirsiniz.
- 10 mcL DMEM içinde TMEV hava kabarcıkları dikkat şırıngaya çekin. Uygun olduğunda, sahte enfekte olmuş fareler virüs DMEM 10 ul alırsınız.
- Enjeksiyondan hemen önce, izofluran yaklaşık 1 ml altında pamuk substrat ile bir tel ızgara içeren bir fanus içine dökün.
- Toe-tutam duyarsız ve uçucu anestezik immobilize çan kavanoz tel ızgara üzerine koyun fareler direclty hafif anestezi olana kadar, yaklaşık 10-15 saniye. Fare rahatsız edici ve kostik madde gibi, izofluran ile doğrudan temas etmemelidir.
- Fareler anestezi altında iken, tıraş ve mürekkep kullanılarak kafatası frontal korteks bölgede hızlı bir şekilde uygun koordinatları enjeksiyon için hazırlar. Enjeksiyon için genel konumu bregma için ön 1 mm ve 1 mm sagital sütür (Şekil 1) sağ tarafta lateral. Stereotaktik enjeksiyon bazı deneysel durumlar için uygun olsa da, biz, mürekkep ya da tıraş olmadan ücretsiz el enjeksiyon deneylerin çoğunluğu için uygun olduğunu buldular. Her iki eksen boyunca iğne ucu ile kürk Kesme enjeksiyon için uygun.
- Bir enjeksiyon yapmak için, şark yaklaşık 3 mm derinliğe kadar kafatası ve kemik aracılığı ile basın iğne dik.
- Hamilton şırınga düğmesine basarak ve çekilmeden önce beyin girmek için virüs için 2 saniye bekledikten beyin içine Express virüs.
- Dikkatlice iğneyi çıkarın ve temiz, kuru bir kafes içinde fare. Fare anesteziden hızlı bir şekilde uyanırsınız ve birkaç dakika içinde normal işlevini devam ettirmek. Hayvan ötenazi olarak enjeksiyon yerinde aşırı kanama, anormal belirtileri sergileyen fareler uygun önem vermek uygun olabilir. Uygun hayvan Sağlığı ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu kurallar National Institutes 6 ve bağlılığı ele takip edilmelidir.
2. Beyin-infiltre lökosit hücre hazırlama:
- , 10 ml RPMI 1640, 9 ml Percoll ve 1 ml 10X PBS ve tüpler beyin kaldırma işlemi sırasında, bankta RT oturup, 30 ml kapasiteli tutabilir yuvarlak alt Oak Ridge santrifüj tüplerine hazırlayın.
- Oda sıcaklığında (RT) Ficoll-Paque Plus getirin.
- Değiştirilmiş izofluran doz aşımı 5 hayvan Euthanize ve hızlı bir şekilde buz üzerinde 5 ml RPMI içeren 15 ml konik bir tüp, paslanmaz çelik bir doku spatula ve yer kullanarak beyin kaldırmak. Bazı durumlarda, PBS-perfüzyon BILs hazırlanması periferik kan hücreleri dolaşan kaldırmak için uygun olabilir. Fare, tam ve doğru olarak anestezi öncesinde PBS-perfüzyon olmalıdır.
- Beyin ve 7 ml cam Pyrex marka Tenbroeck doku değirmeni RPMI çözüm aktarın ve hafifçe 10-15 vuruş ile homojenize.
- Homojenizatör ve iki kez pipetlemeyin yukarı ve aşağı doğru pipetleyin ek bir 5 ml RPMI. Transferi beyin Homojenat (yaklaşık 10 ml), önceden hazırlanmış yuvarlak alt tüp ve invert 2-3 kez hafifçe karıştırın.
- Beckman Allegra X-22R klinik santrifüj F0360 sabit açılı rotor RT 30 dakika 7800g ave beyin Homojenat Spin.
- Santrifüj sonra, degrade üst yüzen miyelin enkaz kaldırmak. Kırmızı kan hücresi pelet (Şekil 2) yukarıda yüzer lökosit tabakası toplayın.
- 50 ml konik içine lökosit tabakası, 40 mikron hücre süzgecinden süzün. RMPI ile 50 ml hacmi çözüm getirin.
- Spin tüpler RT az 5 dakika 1500 rpm (600g ave) bir klinik santrifüj içeren seyreltilmiş hücre süspansiyonu.
- Süpernatantı aspire ve hücre pelletini toplamak. 1 ml FACS Tampon pelet (% 1 sığır serum albumin,% 0.02 sodyum kalsiyum azid ve magnezyum PBS) süspanse edin ve 5 ml yuvarlak alt FACS tüpler hücre süspansiyonu aktarmak.
- 1 ml Ficoll-Paque Plus ile dikkatlice altında yatan süspansiyon.
- 2500 rpm (1400 verdi) hiçbir fren RT 25 dakika klinik santrifüj tüp dönerler.
- 1 ml pipet ve yeni 5 ml FACS tüp transfer arabirimi (Şekil 2) beyaz, kabarık katmanı kaldırın. Yıkama c4 ml FACS tamponu ile arşın.
- Pelet hücrelerin klinik santrifüj RT az 5 dakika 1500 rpm (600g ave) tüp dönerler.
- Süpernatant aspire ve hücre pelletini toplamak. Lökosit pelletini tekrar uygun tampon ve yeni bir FACS tüp içinde buz üzerinde tutmak.
- Tripan mavi dışlama hücre canlılığını değerlendirmek ve flow sitometri ile analiz, hücre güvenin. Genel olarak, araştırmacılar yaklaşık 5 x 10 5 hücre / hayvan satın almak için bekleyebilirsiniz.
3. Akış sitometrik işaretleyicidir
- Lökosit sayımı ve izole sonra, klinik bir santrifüj 1500 rpm (600 verdi), 3 dakika boyunca hücrelerinin dönerler .
- Aşağıdaki içeren tampon engelleme pelletini tekrar: 2.4G2 hibridoma (Fc blok; anti-CD16/32) supernatant FACS tampon, 10:05:01 'lik bir oran fetal sığır serumu ve 4 30 dakika boyunca inkübe ° C .
- Hazırlayın ve 4 1:200 ve inkübe bir konsantrasyon az 30 dakika süreyle bloke hücreleri ° C karanlıkta konjuge ekstrasellüler antijenlere karşı antikorlar ekleyin. Leke ve 200 ul hücreler, bir 96-iyi V-alt plaka kuluçkaya yatmaktadır. Uygun kontroller gerekli lekesiz hücreleri ve florokrom tazminat örnekleri, içerir.
- 96-kuyucuğu rotor uygun bir klinik santrifüj 1500 rpm (600 verdi) 3 dakika RT boyanan hücrelerin dönerler.
- Süpernatantı aspire ve hücreleri hafifçe aşağı yukarı 3 kez pipetleme ve 200 ul FACS tampon ile yıkayın.
- Yukarıdaki yıkama tekniği iki kez tekrarlayın.
- Yıkandıktan sonra,% 2 paraformaldehid FACS tüplerine transfer hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Fixation Biyogüvenlik Seviye 2 reaktiflerin enfekte hücreleri akım sitometri analizi için gereklidir.
- Değiştirilmiş bir akım sitometri yöntemi 8 BD FACS Calibur sabit hücreler çalıştırın ve çevrimdışı FlowJo, WinMDI veya diğer mevcut flow sitometri analiz yazılımı kullanarak dosyaları analiz.
- Örnek başına 50-100,000 olayların analizi genellikle yeterli işaretleyicidir için gereklidir.
Bu deneyde kullanılan doğrudan konjuge antikorları:
CD45 klon 30-F11 ile tespit edildi. Ly6C / G klon Gr1, RB6-8C5 ile tespit edildi. CD11b klonu M1/70 ile tespit edildi. F4/80 klonu BM8 ile tespit edildi.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Biz 24 saat sonrası enfeksiyon (Şekil 3) fare BILs için hücre fenotipleme sonuçları göstermektedir. Lökositler, bağışıklık hücreleri algılamak için PerCP-konjuge anti-fare CD45 ile boyandı, PE-konjuge anti-fare Ly6C / G hücreleri algılamak için inflamatuar monositler, APC-konjuge anti-fare CD11b ve APC-konjuge anti-fare F4/80 tespit etmek için monosit soy. BD FACS Calibur enstrüman analizi yapıldı.
Şekil 1. Enjeksiyon yerinde Anatomik lokalizasyon. Enjeksiyon yerinde bregma için ön 1 mm ve sağ tarafta sagital sütür 1 mm lateralinde yer alır.
Şekil 2. Lökositler ve BILs degrade ayrılması İllüstrasyon lökositler başlangıçta doğrudan miyelin enkaz katmanı altında ve Percoll degrade RBC pelet üzerinde toplanır. Ficoll degrade arayüzünde beyaz, kabarık bir katman (BILs) toplanır.
Şekil 3. 24 saat sonrası enfeksiyon Fare lökositlerin beyin infilatrating lökositlerin immünfenotip beyin doku intrakranial enfeksiyon sonrası 24 saat hayvanlar hazırlanan homojenatlarında ayırıcı yoğunluğu santrifüj tarafından izole edilmiştir. Hücreler fare CD45 karşı floresan-konjuge antikor ile boyandı, Ly6C / G, CD11b ve F4/80. İlk yolluk forward scatter (FSC), hücre boyutu bir göstergesi (C) karşı CD45, bağışıklık hücreleri için bir belirteç, komplo yapıldı. CD45 hi (A, D), CD45 lo (B, E), ve CD45 negatif (F, G) popülasyonları ardından monosit ve makrofaj belirteçlerinin Ly6C / G, F4/80 (A, B, göreceli ekspresyon düzeyleri incelendi F) ve CD11b (D, E, G). Ly6C / G + F4/80 + CD11b + inflamatuar monositler çevreden bu hücrelerin infiltrasyonu ile tutarlı CD45 yüksek nüfus (A, D), neredeyse sadece bulundu. Buna karşılık, Ly6C/G-F4/80 lo CD11b + makrofajlar CD45 lo (B, E) ve CD45 negatif (G), yerleşik fenotip ile tutarlı nüfus, neredeyse sadece bulundu . Sayısız deneylerde, CD45 hi bulaşmamış veya sahte-enfeksiyon beyin hücreleri veya Ly6C / G + F4/80 + CD11b + inflamatuar monositler asla riayet varTed fareler (veriler gösterilmemiştir).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz rutin beyin infiltre hücre hazırlama kalitesini belirlemek için flow sitometri ve bağışıklık hücrelerini 2, 9 farklı nüfusu ayırt etmek. Akut zaman noktalarında, BILs yöntemi CD45hi CD45lo nüfus makrofajların yanı sıra yüksek oranda nüfus içinde yüksek oranda inflamatuar monositlerin verir. Bu, beynin içinde bir tekrarlanabilir immün yanıt sağlam yöntemi ile karakterize edilebilir olduğunu gösterir.
Bu tekniği fare beyin bağışıklık hücreleri iyi karakterize nüfus gerektiren deneyler için özel bir önem taşımaktadır. Daha önce kuyruk damar enjeksiyonu 7 ile bilgisayar fareleri içine infiltre lökositler beynimizin enjekte edilerek evlatlık transferi deneyleri yapılan ve çeşitli in vitro deneyler 9 ile BILs nitelendirmiştir. Bizim BILs hazırlık ikamet eden makrofaj ve mikroglia dahil olmak üzere, beyin yerleşik hücreleri, bağışıklık hücrelerinin farklı popülasyonlar ayırmak gerekir deneyler özellikle yararlıdır. Diğer bir ilginç uygulama, efektör fonksiyonları 3. belirlemek için 7 gün enfeksiyonu BILs izole edilen total RNA üzerinde yapılan gerçek zamanlı RT-PCR analizi içerir . Örneğin, TMEV ile enfekte perforin-yetkili ve yetersiz beslenen hayvanların 7 gün enfeksiyonu toplanan BILs GAPDH, granzim B ve perforin RNA ölçülür. Ayrıca, NKG2D akut enfekte olmuş fareler 4 beyin takas TMEV nasıl katkıda bulunduğunu belirlemek için bizim BILs yöntemi kullanılmıştır .
Yöntemin pek çok kritik yönü vardır. Lökositlerin aşırı stresten kaçınmak ve uygun dansitometrik ayırma sağlamak için ön hazırlık oda sıcaklığına kadar tüm çözümler getirmek şarttır. Stres lökosit hücre ölümü, özellikle canlı hücrelerden oluşan bir nüfus adoptively bir dizi hayvan aktarılır in vivo deneyler için onları güvenilmez kılan katkıda bulunur. Ayrıca soğuk Percoll kullanımı sadece süreksiz degrade yoğunluğu değişir, ama aynı zamanda lökositlerin kalitesini etkiler tespit ettik. Başka kritik unsur, beyin dokusu yeterli ve yumuşak homojenizasyon. Biz bu yetersiz ve kaba homojenizasyon mikroskobu ve akım sitometri ile görülen hücre artıkları bol miktarda beyin dokusu sonuçları bulduk. Hücre döküntüler de uygun boyutta hücre süzgeç ile beyin Homojenat süzme değil neden olabilir. Uygun dikkat daha fazla deney ve analiz için geniş ve yeterli BILs hazırlanması önemli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Mayo Clinic (CLH) erken bir kariyer geliştirme ödülü, NINDS (CLH) hibe NS64571 tarafından desteklenen ve Donald ve Frances Herdrich (CLH) cömert bir hediye. Biz yardım için Mayo Clinic Sitometrisi Core teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalge Nunc international | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche Group | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbr–ck tissue grinder | Fisher Scientific | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Biosciences | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman Coulter Inc. | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman Coulter Inc. | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman Coulter Inc. | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | eBioscience | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | eBioscience | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
- Buenz, E. J., Howe, C. L.
- Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay. Cytometry A. 71, 170-173 (2007).
- Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis. J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).
- Deb, C., Howe, C. L. NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain. J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).
- Donovan, J., &, P. B. rown, , P.
- Donovan, J., Brown, P.
- Donovan, J., Brown, P.
- Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur. Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).
- Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination. J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).
- Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
