Summary
Ein schnelles Verfahren zur Infiltration von Leukozyten aus dem murinen Gehirns zu erhalten, ist beschrieben. Diese Methode verwendet einen kontinuierlichen und diskontinuierlichen Percoll-Gradienten Ficollgradienten auszuwählen und zu reinigen, die Leukocyten-angereicherte Schicht. Isolierte Leukozyten kann dann durch durchflusszytometrische Messungen charakterisiert werden.
Abstract
Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung Gehirn infiltrieren Leukozyten (Bils) von Mäusen. Wir zeigen, wie man Mäuse mit Mäuse-Enzephalomyelitis Theiler ist Virus (TMEV) infizieren über eine schnelle intrakraniellen Injektionstechnik und wie man eine Leukocyten-angereicherte Population von infiltrierenden Zellen aus ganzen Gehirn zu reinigen. Kurz gesagt, werden die Mäuse mit Isofluran in einer geschlossenen Kammer und sind frei Hand injiziert mit einer Hamilton-Spritze in den frontalen Kortex. Mäuse werden dann zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion mit Isofluran Überdosierung und ganze Gehirn getötet werden extrahiert und in RPMI homogenisiert mit einem Tenbroeck Gewebe Mahlwerk. Hirnhomogenaten werden durch eine kontinuierliche 30% Percoll-Gradienten zentrifugiert, um das Myelin und andere Zelltrümmer zu entfernen. Die Zellsuspension wird dann bei 40 um angespannt, gewaschen und zentrifugiert auf eine diskontinuierliche Ficoll-Paque Plus-Gradienten zu wählen und reinigen die Leukozyten. Die Leukozyten werden dann gewaschen und in entsprechenden Puffern für Immunphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie. Durchflusszytometrie zeigt eine Bevölkerung von angeborenen Immunzellen in den frühen Stadien der Infektion in C57BL / 6 Mäusen. Nach 24 Stunden nach der Infektion, werden mehrere Untergruppen von Immunzellen in der Bils, mit einer angereicherten Population von Gr1 +, CD11b + und F4/80 + Zellen. Daher ist diese Methode zur Charakterisierung der Immunantwort auf eine akute Infektion in das Gehirn.
Protocol
1. Intrakranielle Virus Injektion:
Das folgende Verfahren wurde geändert und weitgehend durch unser Labor und Kollegen genutzt. Kurz gesagt, intrakranieller Injektion des Daniel Stamm murinen Enzephalomyelitis Theiler ist Virus (TMEV) oder schein-Infektion (1, 10) ist auf junge Mäuse (vorzugsweise 5-6 Wochen alt) durchgeführt, um Gehirn infiltrieren Leukozyten (Bils) zu entlocken. Bitte beachten Sie, dass die Ergebnisse wird zwischen den Daniel Stamm, die Bean-Stamm, und der GDVII Belastung unterscheiden. Für die Zwecke der Ernte Bils, erhalten Mäusen 2x10 5 PFU von TMEV und sind für 24 Stunden infiziert.
- Bringen Sie die Injektionsnadel (27 Gauge, ¼ in, Kendall), eine automatische 1 ml Hamilton-Spritze und auf 10 ul des Virus liefern.
- Erstellen Sie TMEV in 10 ul DMEM in die Spritze mit besonderer Aufmerksamkeit, um Luftblasen. Gegebenenfalls erhalten sham infizierten Mäusen 10 ul virenfrei DMEM.
- Unmittelbar vor der Injektion, pour etwa 1 mL von Isofluran in einer Glasglocke, dass ein Drahtgitter mit Baumwolle Substrat unterhalb enthält.
- Legen Sie einfach direkt auf Mäuse Drahtgitter in der Glocke, bis sie leicht narkotisiert werden, unempfindlich gegen toe-kneifen und immobilisiert durch die Inhalations-Anästhetika, ca. 10-15 Sekunden. Mäuse sollten nicht in direkten Kontakt mit Isofluran kommen, als Substanz kann irritierend sein und ätzend.
- Während der Narkose, bereiten Mäuse für die Injektion von schnellen Auffinden geeigneter Koordinaten im frontalen Kortex Region auf dem Schädel mit Rasier-und Farbgebung. Die allgemeine Lage für die Injektion ist 1 mm anterior zu Bregma und 1 mm seitlich der Sagittalnaht auf der rechten Seite (Abbildung 1). Während stereotaktische Injektion kann sinnvoll sein für einige experimentelle Situationen haben wir festgestellt, dass freie Hand Injektion ohne Rasieren oder Einfärben geeignet für die Mehrzahl der Experimente ist. Das Fell mit der Nadelspitze an beiden Achsen eignet sich für die Injektion.
- Um eine Injektion zu machen, richten Sie die Nadel senkrecht auf den Schädel, und drücken durch den Knochen auf ca. 3 mm Tiefe.
- Express-Virus in das Gehirn, indem Sie die Hamilton-Spritze gedrückt und wartet 2 Sekunden für das Virus auf das Gehirn vor Aberkennung geben.
- Entfernen Sie vorsichtig die Nadel und die Maus in einem sauberen, trockenen Käfig. Mäuse aus der Narkose erwachen und schnell wieder normale Funktion innerhalb weniger Minuten. Give gebührende Aufmerksamkeit zu Mäusen, die anormale Symptome aufweisen, wie zB starke Blutungen an der Injektionsstelle, wie Euthanasie der Tiere angemessen sein. Richtiger Umgang mit Tier 6 und die Einhaltung der National Institutes of Health and Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss Richtlinien müssen befolgt werden.
2. Brain-infiltrierenden Leukozyten Zellpräparation:
- Bereiten Rundboden-Oak Ridge Zentrifugenröhrchen mit einer Kapazität von 30 ml mit 10 ml RPMI 1640, 9 ml Percoll und 1 ml 10X PBS und Rohre sollten bei RT auf der Bank sitzen während des Gehirns Löschvorgang halten kann.
- Bringen Ficoll-Paque Plus Raumtemperatur (RT).
- Euthanize Tier durch veränderte Isofluran Überdosierung 5 und schnell zu entfernen, das Gehirn mit einem Edelstahl-Gewebe Spachtel und in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 5 ml RPMI auf Eis. Unter bestimmten Umständen kann PBS-Perfusion angemessen zu entfernen zirkulierenden peripheren Blutzellen aus dem Bils Vorbereitung. Mäuse sollten vollständig und ordnungsgemäß betäubt vor PBS-Perfusion.
- Transfer-Hirn-und RPMI-Lösung zu einem 7 ml Glas Pyrex Marke Tenbroeck Gewebe Mühle und sanft mit 10-15 Schlägen zu homogenisieren.
- Pipet weitere 5 ml RPMI in den Homogenisator und Pipette nach oben und unten zweimal. Transfer Hirnhomogenat (ca. 10 ml) auf den vorbereiteten Rundboden-Röhrchen und vorsichtig umdrehen 2-3 mal zu mischen.
- Spin Hirnhomogenat bei 7800g ave für 30 min bei RT in einer F0360 Festwinkelrotor in einem Beckman Allegra X-22R klinischen Zentrifuge.
- Nach dem Zentrifugieren zu entfernen Myelin Trümmer, schwebte auf der Oberseite der Steigung hat. Sammeln Sie die Leukozyten-Schicht, die oberhalb der roten Blutkörperchen Pellet (Abbildung 2) schwebt.
- Der Stamm Leukozyten Schicht durch ein 40 um Zellsieb in einen 50 ml konisch. Bringen Lösung bis zu 50 ml Volumen mit RMPI.
- Spin Röhrchen mit verdünnten Zellsuspension in einer klinischen Zentrifuge bei 1500 rpm (600g ave) für 5 min bei RT.
- Den Überstand aspirieren und sammeln das Zellpellet. Das Pellet in 1 ml FACS-Puffer (1% Rinderserumalbumin, 0,02% Natriumazid in Calcium-und Magnesium-freiem PBS) und übertragen Sie die Zellsuspension 5 ml Rundboden FACS-Röhrchen.
- Sorgfältig Unterlage Aufhängung mit 1 ml Ficoll-Paque Plus.
- Spin Röhrchen bei 2500 rpm (1400 gab) in klinischen Zentrifuge für 25 min bei RT ohne Bremse.
- Entfernen weißen, flauschigen Schicht an der Oberfläche (Abb. 2) mit 1 ml Pipette und Übertragung auf neue 5 ml FACS-Röhrchen. Wash cEllen mit 4 ml FACS-Puffer.
- Spin Röhrchen bei 1500 rpm (600g ave) für 5 min bei RT in klinischen Zentrifuge zur Pellet-Zellen.
- Saugen Sie den Überstand und sammeln Zellpellet. Resuspendieren Leukozyten Pellet in geeigneten Puffer und halten auf dem Eis in neuen FACS-Röhrchen.
- Zählen von Zellen, beurteilen die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Ausschluss und zu analysieren, mittels Durchflusszytometrie. Im Allgemeinen können die Ermittler erwarten, ca. 5 x 10 5 Zellen / Tier zu erwerben.
3. Durchflusszytometrische Immunphänotypisierung
- Nach Isolierung und Zählung der Leukozyten, Spin die Zellen für 3 Minuten bei 1500 rpm (600 gab) in einer klinischen Zentrifuge.
- Das Pellet in Blocking-Puffer mit folgendem Inhalt: FACS-Puffer, Überstand aus 2.4G2 Hybridom (Fc block; anti-CD16/32) und fötalem Rinderserum bei einem Verhältnis von 10.05.01 und inkubieren für 30 Minuten bei 4 ° C .
- Bereiten Sie und fügen konjugierte Antikörper gegen extrazelluläre Antigene, um die blockierten Zellen bei einer Konzentration von 1:200 und Inkubation für 30 Minuten bei 4 ° C im Dunkeln. Stain und inkubieren Zellen in 200 ul in einem 96-Loch-V-Bodenplatte. Entsprechende Kontrollen sind ungefärbte Zellen und Fluorochrom Entschädigung Proben, wie nötig.
- Drehen Sie die gefärbten Zellen bei RT für 3 Minuten bei 1500 rpm (600 gab) in einer klinischen Zentrifuge mit einem Rotor geeignet für 96-Well-Platten.
- Den Überstand aspirieren und waschen Sie die Zellen mit 200 ul FACS-Puffer durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren 3 mal.
- Wiederholen Sie die obigen Waschtechnik zweimal.
- Nach dem Waschen die Zellen in 2% Paraformaldehyd und Transfer zum FACS-Röhrchen. Fixation ist für den durchflusszytometrischen Analyse von Zellen des Biosafety Level 2 Reagenzien infiziert erforderlich.
- Führen Sie den fixierten Zellen auf einer BD FACS Calibur nach einer modifizierten Durchflusszytometrie Methode 8 und analysieren Dateien offline mit FlowJo, WinMDI oder anderen verfügbaren Durchflusszytometrie-Analyse-Software.
- Die Analyse der 50-100,000 Ereignisse pro Probe ist in der Regel für eine angemessene Immunphänotypisierung erforderlich.
Direkt konjugierte Antikörper in diesem Experiment verwendet:
CD45 wurde mit Klon 30-F11 erkannt. Ly6C / G wurde mit Klon Gr1, RB6-8C5 erkannt. CD11b wurde mit Klon M1/70 erkannt. F4/80 wurde mit Klon BM8 erkannt.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Wir zeigen Zelle Phänotypisierung Ergebnisse für Maus Bils 24 Stunden nach der Infektion (Abbildung 3). Leukozyten mit PerCP-konjugiertem anti-Maus CD45 gefärbt wurden, um Immunzellen erkennen, PE-konjugierten Anti-Maus Ly6C / G zu erkennen inflammatorischen Monozyten, APC-konjugierten Anti-Maus-CD11b und APC-konjugierten Anti-Maus F4/80, um Zellen zu erkennen von Monozyten Linie. Die Analyse wurde mit einem BD FACS Calibur Gerät durchgeführt.
Abbildung 1. Anatomische Lokalisation der Injektionsstelle. Die Injektionsstelle ist 1 mm anterior zu Bregma und 1 mm seitlich der Sagittalnaht auf der rechten Seite befindet.
Abbildung 2. Illustration von Gradienten Trennung von Leukozyten und Bils. Leukozyten werden zunächst direkt unterhalb des Myelin Trümmer Schicht und vor der RBC Pellet im Percoll-Gradienten gesammelt. Der weiße, flauschige Schicht (Bils) an der Schnittstelle von der Ficoll-Gradienten gesammelt.
Abbildung 3. Immunophänotyp von Gehirn-infilatrating Leukozyten bei 24 Stunden nach der Infektion. Maus Leukozyten wurden aus dem Gehirn durch Differential Dichtezentrifugation von Gewebehomogenaten von Tieren bei 24 Stunden nach der intrakraniellen Infektion vorbereitet isoliert. Die Zellen wurden mit Fluoreszenz-konjugierten Antikörper gegen Maus CD45 gefärbt, Ly6C / G, CD11b und F4/80. Initial-Gating wurde durch Auftragen CD45, einem Marker für Immunzellen gegen Vorwärtsstreuung (FSC), ein Indikator für die Größe der Zellen (C) durchgeführt. Die CD45 hallo (A, D), CD45 lo (B, E) und CD45 neg (F, G) Populationen wurden dann für die relative Expression der Monozyten und Makrophagen Marker Ly6C / G, F4/80 (A, B analysiert , F) und CD11b (D, E, G). Ly6C / G + F4/80 + CD11b + inflammatorischen Monozyten wurden fast ausschließlich in der CD45 hallo Bevölkerung (A, D), im Einklang mit der Infiltration dieser Zellen aus der Peripherie. Im Gegensatz dazu waren Ly6C/G-F4/80 lo CD11b + Makrophagen fast ausschließlich in der CD45 lo (B, E) und CD45 neg (G) Populationen, im Einklang mit einem Wohnsitz Phänotyp gefunden. In zahlreichen Versuchen haben wir noch nie CD45 hallo Zellen oder Ly6C / G + F4/80 + CD11b + inflammatorischen Monozyten in das Gehirn der infizierten oder schein-Infektion beobachtetTed Mäusen (Daten nicht gezeigt).
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Discussion
Wir verwenden routinemäßig Durchflusszytometrie, um sowohl die Qualität des Gehirns infiltriert Zellpräparation zu bestimmen und verschiedene Populationen von Immunzellen 2, 9 zu unterscheiden. Bei akuten Zeit-Punkte, ergibt unsere Bils Methode ein hoher Prozentsatz der inflammatorischen Monozyten in der CD45hi Bevölkerung sowie ein hoher Prozentsatz der Makrophagen in der CD45lo Bevölkerung. Dies deutet darauf hin, dass eine reproduzierbare Immunantwort im Gehirn robust können mit unserer Methode charakterisiert werden.
Diese Technik ist von besonderer Bedeutung für Experimente, dass eine gut charakterisierte Bevölkerung von Immunzellen aus dem Gehirn der Maus benötigen. Wir haben früher adoptiven Transfer Experimente durch Einspritzen von unserem Gehirn infiltrieren Leukozyten in Host-Mäuse via Schwanzvene Injektion 7 durchgeführt, und wir haben die Bils über verschiedene in-vitro-Experimenten 9 gekennzeichnet. Unsere Bils Vorbereitung ist besonders vorteilhaft in Experimenten, dass verschiedene Populationen von Immunzellen aus residenten Zellen des Gehirns, einschließlich Makrophagen und Mikroglia unterscheiden muss. Eine weitere Anwendung von Interesse sind real-time RT-PCR-Analyse auf Gesamt-RNA aus Bils bei 7 Tagen nach der Infektion isoliert zu identifizieren Effektorfunktionen 3 durchgeführt. Zum Beispiel messen wir GAPDH, Granzym B und Perforin RNA in Bils bei 7 Tagen nach der Infektion aus Perforin-kompetenten und-defizienten Tieren mit TMEV infiziert gesammelt. Wir haben auch unsere Bils Methode genutzt, um festzustellen, wie NKG2D zu Clearing TMEV trägt aus dem Gehirn von akut infizierten Mäusen 4.
Es gibt einige kritische Aspekte der Methode. Es ist wichtig, alle Lösungen auf Raumtemperatur vor der Zubereitung zu bringen unnötigen Stress auf die Leukozyten zu vermeiden und die richtigen densitometrische Trennung zu gewährleisten. Stress auf die Leukozyten trägt zum Zelltod, was sie besonders unzuverlässig in vivo Experimenten, bei denen eine Live-Population von Zellen, adoptiv in ein Wirtstier übertragen lässt. Wir haben auch festgestellt, dass die Verwendung von kaltem Percoll verändert nicht nur die Dichte des diskontinuierlichen Gradienten, sondern wirkt sich auch auf die Qualität der Leukozyten. Ein weiteres wichtiges Element ist ausreichend und schonende Homogenisierung von Hirngewebe. Wir haben, dass eine unzureichende und rau Homogenisierung von Hirngewebe führt reichlich Zelltrümmer durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie gesehen gefunden. Zelltrümmer können auch von nicht belasten die Hirnhomogenat mit dem entsprechend dimensionierten Zellsieb führen. Proper Liebe zum Detail ist der Schlüssel bei der Vorbereitung genügend und ausreichend Bils für weitere Experimente und Analysen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Grant NS64571 aus dem NINDS (CLH) unterstützt wird, durch eine frühzeitige Career Development Award von der Mayo Clinic (CLH), und durch ein großzügiges Geschenk von Donald und Frances Herdrich (CLH). Wir möchten die Mayo Clinic Durchflusszytometrie Core for Unterstützung danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TMEV | Howe Lab | N/A | |
| Daniel’s strain | Invitrogen | 21063-029 | |
| isoflurane | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| round-bottom Oak Ridge centrifuge tubes | Nalge Nunc international | 3118-0030 | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| 10X PBS | Roche Group | 11666789001 | |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Trypan Blue 0.4% (w/v) | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| 15 ml conical tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| 7 mL glass Pyrex brand Tenbr–ck tissue grinder | Fisher Scientific | 08-414-10B | |
| 40 μm cell strainer | BD Biosciences | 352340 | |
| 50 mL conical | BD Biosciences | 352070 | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| CMF-PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352054 | |
| fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| 2.4G2 hybridoma | ATCC | HB-197 | |
| Costar V-bottom plate | Corning | 3894 | |
| Allegra X-22R centrifuge or equivalent | Beckman Coulter Inc. | N/A | |
| 96-well plate bucket and rotor | Beckman Coulter Inc. | S2096 | |
| Fixed-angle rotor | Beckman Coulter Inc. | F0360 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| BD FACS Calibur | BD Biosciences | N/A | |
| FlowJo 7.5 | Tree Star, Inc. | N/A | |
| CD45 | BD Biosciences | 557235 | clone: 30-F11 |
| Gr1 (Ly6C/G) | BD Biosciences | 553128 | clone: RB6-8C5 |
| CD11b | eBioscience | 17-0112-83 | clone: M1/70 |
| F4/80 | eBioscience | 17-4801-82 | clone: BM8 |
References
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