Summary
Pre-implantatie embryo's kunnen worden ingevroren na plaatsing in een hypertone cryoprotectief oplossing voor cellulaire uitdroging veroorzaken. Bij evenwicht, is het ijs kristalvorming geïnduceerd in de oplossing rond de embryo. Verdere uitdroging optreedt als het embryo langzaam afgekoeld tot temperaturen onder nul alvorens zich in vloeibare stikstof voor opslag.
Abstract
Pre-implantatie embryo's van runderen, schapen en geiten kan worden ingevroren voor korte of lange termijn opslag. Pre-implantatie embryo's bestaan voornamelijk uit water, en het vermijden van intracellulaire ijskristallen formatie tijdens de cryopreservatie proces is van het allergrootste belang om embryo levensvatbaar te houden. Embryo's worden geplaatst in een hypertone oplossing (1,4 - 1,5 m) van een cryoprotectief middel (CPA), zoals ethyleen glycol (EG) of glycerol (GLYC) om een osmotische gradiënt die cellulaire uitdroging vergemakkelijkt te creëren. Na het embryo bereiken osmotische evenwicht in het CPA-oplossing, worden ze individueel geladen in de hypertone CPA oplossing in 0,25 ml plastic rietjes voor het invriezen. Embryo's worden geplaatst in een gecontroleerde snelheid vriezer bij een temperatuur van -6 ° C. Ijskristal formatie wordt geïnduceerd in de CPA oplossing rond de embryo, en kristallisatie veroorzaakt een toename in de concentratie van de CPA buiten het embryo, waardoor nog meer cellulaire uitdroging. Embryo's worden gekoeld met een snelheid van 0,5 ° C / min, waardoor verdere uitdroging, tot een temperatuur van -34 ° C alvorens te worden ondergedompeld in vloeibare stikstof (-196 ° C). Gecryopreserveerde embryo's dient vooraf te worden ontdooid over te stappen naar een ontvanger (surrogaat) vrouwelijke. Rietjes met de embryo's worden verwijderd uit de vloeibare stikstof Dewar, gehouden in lucht op kamertemperatuur voor 3 tot 5 sec, en geplaatst in een 37 ° C waterbad voor 25 tot 30 sec. Embryo's gecryopreserveerde in GLYC zijn geplaatst in een 1 M oplossing van saccharose, gedurende 10 minuten voor het verwijderen van de CPA vóór de overdracht aan een ontvanger (surrogaat) vrouwelijke. Embryo's gecryoconserveerd in EG, mogen echter rechtstreeks worden overgebracht naar de baarmoeder van een ontvanger.
Protocol
1. Het evalueren van geschiktheid van embryo's voor cryopreservatie een
- Monsters geoogst van de voortplantingsorganen van de individuele donor vrouwelijke moet worden geplaatst in een isotone embryo holding medium voor 10 minuten voor de evaluatie met behulp van een stereomicroscoop. Wees er zeker van om embryo's te houden van elke donor vrouwelijke gescheiden van elkaar om identificatie van de afstamming van embryo transfer nakomelingen mogelijk te maken.
- Met behulp van een lage vergroting (≤ 10x), specimens van een individuele donor vrouwelijke moeten gescheiden worden in verschillende groepen, bestaande uit onbevruchte eicellen, embryo's ontaarden, of overdraagbaar kwaliteit embryo's. Alleen de kwaliteit graad 1 of 2 embryo's in het compacte morula door middel van uitgebreide blastocyst stadia van ontwikkeling zijn geschikt voor cryopreservatie, en alle andere opties worden verworpen (tenzij de ontvanger synchroon vrouwtjes zijn beschikbaar voor de kwaliteit graad 3 embryo's en een post-overdracht zwangerschap snelheid van ongeveer 25 -30% wordt aanvaardbaar geacht).
- Inspecteer de kwaliteit van graad 1 en 2 compact morula door middel van uitgebreide blastocyst stadium embryo's bij een vergroting ≥ 50x om ervoor te zorgen dat de zona pellucida van het embryo intact is en dat er geen materiaal (bijvoorbeeld, cellen, slijm) zich te houden aan de zona pellucida. Elke embryo met een gebarsten of ontbrekende zona pellucida of met een zona pellucida met aanhangend materiaal moet worden gescheiden van andere embryo's en ofwel worden vernietigd of afzonderlijk verwerkt.
2. Wassen van embryo's om Waarschijnlijkheid van de overdracht van ziekten 2 Verminder
- Verplaats zona pellucida-intacte embryo's in een minimaal volume van isotone embryo houden medium in het eerste putje van de embryo wassen medium (bv. fosfaat gebufferde zoutoplossing aangevuld met antibiotica en bovine serum albumine, pasgeboren kalf serum, of polyvinylalcohol). Te houden embryo's van elke donor vrouwelijke apart, en niet proberen om meer dan 10 embryo's wassen in een keer. Bewegen embryo's in een minimaal volume van medium in elke opeenvolgende wassen om een seriële verdunning ≥ 1:100 bereiken en zeker steriele embryo handling tips die zijn gewijzigd tussen elke opeenvolgende wasbeurt gebruiken.
- Bewegen embryo's tot en met 4 meer wasbeurten, zoals beschreven in 2.1.
- Indien de overdracht van virale ziekten is van belang, was embryo's twee keer in een 0,25% trypsine-oplossing, voor een totale gecombineerde blootstelling tijd om trypsine van niet meer dan 90 seconden.
- Na de twee trypsine wast, wast embryo's vijf keer meer in embryo's wassen medium zoals beschreven in 2.1.
- Na de laatste embryo te wassen, plaats embryo's in een isotone embryo holding medium.
3. Embryo's drogen Voorafgaand aan Cryopreservatie 3
- Embryo's moeten worden overgebracht in een minimaal volume van isotone embryo houden medium in een hypertone oplossing (1.4-1,5 molaire concentratie) van een cryoprotectief middel (CPA), zoals ethyleen glycol of glycerol.
- Laat embryo's te zitten in de vrieskou medium (hypertone CPA oplossing) totdat ze osmotisch evenwicht. Omdat ethyleenglycol doordringt embryonale cellen sneller dan doet glycerol, evenwicht tijden zijn doorgaans minder voor embryo's in ethyleen glycol (5 min) dan in glycerol (10 min). Een deel van deze equilibratietijd kan worden bereikt tijdens en na de embryo's worden geladen in rietjes (beschreven in de volgende stap).
4. Het laden van embryo's in een 0,25 ml plastic rietje voor Cryopreservatie
- Bevestig de katoen stekker einde van een 0,25 ml plastic rietje (11,5 cm werklengte) om een embryo het laden van het apparaat, en zuig ongeveer 1,3 cm van hypertone CPA-oplossing in een gemerkte rietje. Een verscheidenheid van de etikettering procedures bestaat, inclusief het gebruik van gedrukte etiketten gevoegd bij een rietje afdichting plug of op een andere stro verbonden met een rietje adapter.
- Verwijder het stro van de CPA-oplossing, en zuig ongeveer 0,15 cm van de lucht om een kleine luchtbel te creëren binnen het stro.
- Aspireren een enkel embryo in ongeveer 0,8 cm van hypertone CPA oplossing in het stro.
- Verwijder het stro van de CPA-oplossing en zuig ongeveer 0,15 cm van de lucht om een tweede kleine luchtbel in het stro (luchtbellen dienen om de embryo fysiek te isoleren binnen het stro) te creëren.
- Aspireren van ongeveer 9,1 cm van de CPA-oplossing volledig te vullen het stro, de zekerheid te trekken in een voldoende volume van de CPA oplossing voor het polyvinylchloride (PVC) poeder dat bestaat binnen de katoen-stekker van het stro te bevochtigen. De CPA-oplossing zorgt ervoor dat de PVC-poeder om gel en zegel dat uiteinde van het rietje.
- Seal het andere uiteinde van het rietje met PVC poeder, plastic rietje afdichtpluggen, of een sealmachine.
5. Het plaatsen van embryo's in een gecontroleerde snelheid Embryo Vriezen Machine
- Ofwel methanol bad of vloeibare stikstof damp invriezen machines kunnen worden geprogrammeerd voor de cryopreservatie van preimplantatie embryo's.
- Laad de rietjes met de Embry os in een machine waarvan de temperatuur het vriespunt is afgekoeld van kamertemperatuur tot -6 ° C. Laad rietjes katoen plug belanden (tenzij plastic rietje afdichtingspluggen of stro adapters worden gebruikt, in welk geval katoen plug einde is geplaatst naar beneden).
- Laat embryo's bij deze temperatuur te zitten gedurende minstens 2 minuten voordat u verder gaat.
6. Zaaien
- Zodra embryo's zijn afgekoeld tot -6 ° C, gebruik dan een tang onderkoelde in vloeibare stikstof (of een wattenstaafje stok ondergedompeld in vloeibare stikstof) om ijs kristalvorming in de CPA oplossing te induceren in het stro door het aanraken van de tang (of katoen getipt stick) naar de kolom van de oplossing boven of onder het embryo.
- Het water in de CPA-oplossing zal kristalliseren in de regio blootgesteld aan vloeibare stikstof, en ijskristallen zal verspreiden naar de kolom van de CPA oplossing direct rondom de embryo.
- Houd de embryo's bij het zaaien temperatuur gedurende 10 minuten alvorens verdere koeling.
7. Voortzetting van Uitdroging van embryo's
- Cool embryo's met een snelheid van 0,5 ° C / min naar beneden tot een temperatuur van -34 ° C. Dit afkoelsnelheid is belangrijk om te zorgen voor de voortdurende uitdroging van het embryo.
- Houd de embryo's bij -34 ° C gedurende 10 minuten voor het kelderen embryo's in vloeibare stikstof (-196 ° C).
- Plaats gecryopreserveerde embryo's in een passend label beker (gevuld met vloeibare stikstof), gekoppeld aan een passend label stok, en plaats de stok in een fles met een vloeibare stikstof Dewar voor korte of lange termijn opslag.
8. Ontdooien gecryopreserveerde Embryo's
- Trek de bus in de hals van de vloeibare stikstof Dewar, ervoor te zorgen dat de bus onder blijft de vorst lijn in de Dewar.
- Zoek de stok met het embryo te worden ontdooid, en snel en zorgvuldig het stro uit de beker, die zeker niet aan andere rietjes warm in de beker.
- Houd het rietje in de lucht voor 3-5 seconden (om de incidentie van een gebarsten zona pellucida 4 verminderen), en vervolgens ondergedompeld in een 37 ° C waterbad voor een extra 25-30 seconden.
- Verwijder het stro van het waterbad, veeg het stro (en let niet op de embryo identificatie vlekken op het stro), gebruik dan een rietje snij-apparaat afsnijden van de niet-katoen stekker van de stro (indien verzegeld met behulp van warmte of PVC-poeder ), of verwijder voorzichtig de plastic afsluitdop, en ofwel:
- laden het stro in een embryotransfer apparaat en overdracht zo snel mogelijk aan een synchrone embryo ontvanger (maar alleen als het embryo was gecryopreserveerde met behulp van ethyleen glycol als de CPA), of
- Houd het open uiteinde van het rietje meer dan een schotel met een 1,0 molaire concentratie van sucrose (een niet-doordringende verbinding), en gebruik een schaar af te snijden van de katoen stekker van het stro. Inhoud van het stro moet vrij kunnen stromen in de sucrose oplossing, maar indrukken van een klein kolom van lucht door het rietje kan nodig zijn als alle resten van het medium bestaat in het stro. Laat embryo's in sucrose oplossing blijft gedurende 10 minuten, en vervolgens over embryo's in een isotone embryo holding medium voor 10 minuten. Evalueer embryo's na ontdooien, te laden in een nieuw stro, en transfer naar geschikte ontvanger vrouwen.
9. Representatieve resultaten:
Een verscheidenheid aan factoren kan invloed hebben op de zwangerschap en de live-geboortecijfer als gevolg van de overdracht van de ingevroren-ontdooide pre-implantatie embryo's synchrone ontvanger vrouwen 5. Embryo's in ontwikkelingsfasen minder ver gevorderd dan compact morula of meer geavanceerd dan uitgebreid blastocyst vaak niet overleven de cryopreservatie proces alsook embryo's in het compacte morula, vroege blastocyst, blastocyst, en breidde blastocyst stadium van de embryonale ontwikkeling. Embryo's van kwaliteitsklasse 1 en 2 geven een hogere post-dooi zwangerschap tarieven dan wel de kwaliteit graad 3 embryo's (die meestal niet gecryopreserveerd vanwege de lage post-dooi zwangerschap tarieven). Embryo's mishandeld tijdens de embryo bevriezing of embryo ontdooien procedures waarschijnlijk verminderd zwangerschap tarieven vertonen. Embryo's aan ontvanger vrouwen wier oestrische cycli worden niet gesynchroniseerd met die van de donor vrouwelijke typisch produceren lagere kans op zwangerschap tarieven. Embryo's in vitro of gemanipuleerd in een of andere manier (bijvoorbeeld biopsie of doorsneden) meestal opbrengst lagere kans op zwangerschap tarieven. Onder optimale omstandigheden, zwangerschap tarieven verkregen na de overdracht van ingevroren en ontdooid in vivo verkregen embryo's is meestal 60-70% in vee 6,7, 65-75% bij schapen 8,9,10,11, en 60-70% bij geiten 12,13,14,15. Ook de zwangerschap tarieven verkregen na de overdracht van ingevroren en ontdooid in vitro geproduceerde embryo's is meestal 40-50% bij runderen 6,16, 25-35% bij schapen 17, en 30-40% bij geiten 18.
BLE 1 "/>Tabel 1. Verwachte percentage zwangerschappen na de overdracht van ingevroren en ontdooid embryo's van herkauwers binnen diersoorten te synchrone ontvanger vrouwen.
Discussion
Omdat embryo's bestaan voornamelijk uit water, is het cruciaal dat inplanting embryo's adequaat uitgedroogd en langzaam afgekoeld in overeenstemming met het protocol beschreven voor intracellulaire ijs kristalvorming te voorkomen. Zodra het koelproces is begonnen, is het belangrijk om een richting te veranderen temperatuur te behouden en om temperatuurschommelingen te voorkomen. Initiatie van ijskristal formatie ("zaaien") op een geschikte temperatuur voor de specifieke CPA oplossing is van cruciaal belang.
Wijzigingen aan deze langzame afkoeling / snel ontdooien methode voor pre-implantatie embryo cryopreservatie zijn de een-stap-methode (waarbij de laatste kolom van medium geladen in het stro is sucrose in plaats van de CPA-oplossing) 19 en de directe overdracht-methode (waarbij embryo's ingevroren in ethyleenglycol worden ontdooid en direct overgebracht naar de baarmoeder van een ontvanger vrouwelijke zonder eerst het verwijderen van de ethyleen glycol van het embryo) 20. Ter vermindering van het volume van ethyleen glycol gestort in de baarmoeder van een directe overdracht (DT) ontvanger vrouwelijk, is het raadzaam om de 0,25 ml stro te vullen met 6 cm holding medium voordat u verder gaat zoals eerder beschreven. Opgemerkt moet worden dat een vrijwillige norm bestaat binnen de commerciële embryo transfer industrie die inplanting embryo's ingevroren voor DT bevroren dienen te worden in geel-gekleurde rietjes en opgeslagen in het geel-gekleurde bekers in de vloeibare stikstof Dewar. De commerciële sector heeft ook specifieke etiketteringsvoorschriften voor alle ingevroren embryo's die moeten worden gevolgd.
Een alternatief voor deze methode is verglazing 21, een niet-evenwicht methode van cryopreservatie, waar een meer zeer geconcentreerde (6-8 M) CPA oplossing wordt afgekoeld ultra-snel waardoor de CPA oplossing om van vloeistof naar een "glazen" staat te veranderen zonder ijs kristalvorming. Verglazing is het waarschijnlijk beter geschikt voor cryopreservatie van embryo's die minder geavanceerd dan ontwikkelingsgebied compacte morula vanwege hun verhoogde temperatuur gevoeligheid.
Deze techniek is de toepassing voor het behoud van unieke kiemplasma middelen 22, alsmede de internationale commerciële embryo transfer-industrie, waar meer dan 55% van ongeveer 500.000 runderen pre-implantatie embryo's in het kalenderjaar 2008 waren gecryopreserveerd. 23
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Gedeeltelijke financiering van de USDA multi-state onderzoeksproject W-2171 "Germ Cell en de embryo-ontwikkeling en manipulatie voor verbetering van de veeteelt" is dankbaar erkend. De artistieke talenten van Ryan Callahan, die de technische illustraties voorbereid op het videogedeelte van dit artikel, zijn ook dankbaar erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioLife freeze medium | Agtech, Inc. | C18, C18A | 1.5 M ethylene glycol |
| Emcare ethylene glycol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC8, IC10 | 1.5 M ethylene glycol |
| ViGro ethylene glycol freeze plus | Bioniche Animal Health | EVM835 | 1.5 M ethylene glycol |
| Emcare 10% glycerol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC12 | 1.34 M glycerol |
| Emcare 1 M sucrose thaw | ICPBio Reproduction | IC16 | 1.0 M sucrose |
| ViGro one-step thaw | Bioniche Animal Health | EVM247, EVM847 | 1.0 M sucrose |
| ViGrothaw 1-2-3 plus | Bioniche Animal Health | EVM248, EVM848 | 5%, 2.5%, 0% glycerol with 0.5, 0.5, 0.6% sucrose |
| Emcare CSU thawing kit | ICPBio Reproduction | IC20 | 6%, 3%, 0% glycerol with 10.3% sucrose |
| BioLife holding and transfer medium | Agtech, Inc. | C15, C15A | modified PBS with 0.4% BSA (bovine serum albumin) |
| Emcare holding solution | ICPBio Reproduction | IC2, IC4, IC6 | 0.4% BSA (bovine serum albumin), MOPS buffer (inert zwitterions) |
| ViGro holding plus | Bioniche Animal Health | EVM024, EVM824 | |
| SYNGROHolding medium | Bioniche Animal Health | ESM024, ESM224, ESM828 | contains hyaluronan; no products of animal origin |
| BioLife modified D- PBS | Agtech, Inc. | C06 | modified Dulbecco's phosphate buffered saline |
| BioLifeBSA Fraction V | Agtech, Inc. | B09 | lyophilized bovine serum albumin, fraction V |
| BioLifeantibiotic-antimycotic | Agtech, Inc. | B01 | amphotericin-B, penicillin G, streptomycin sulfate |
| BioLifetrypsin kit | Agtech, Inc. | C22A | 25 g lyophilized trypsin, sterile water, sterile D-PBS |
| Biol-Cool controlled rate freezer | FTS Systems | BC-IV -40 | Methanol bath freezer |
| Freeze Control controlled rate freezer | Cryologic | CL2200 | Liquid nitrogen freezer |
References
- Lindner, G. M., Wright, R. W. Bovine embryo morphology and evaluation. Theriogenology. 20, 407-416 (1983).
- Stringfellow, D. A., Givens, M. D. Recommendations for the sanitary handling of in vivo derived embryos. Manual of the International Embryo Transfer Society. , 4th ed, International Embryo Transfer Society. Champaign, Illinois, USA. 65-68 (2010).
- Youngs, C. R., Leibo, S. P., Godke, R. A. Embryo cryopreservation in domestic mammalian livestock species. CAB Reviews: Perspectives in Agriculture, Veterinary Science, Nutrition and Natural Resources. , (2010).
- Rall, W. F., Meyer, T. K. Zona fracture damage and its avoidance during the cryopreservation of mammalian embryos. Theriogenology. 31, 683-692 (1989).
- Spell, A. R., Beal, W. E., Corah, L. R., Lamb, G. C. Evaluating recipient and embryo factors that affect pregnancy rates of embryo transfer in beef cattle. Theriogenology. 56, 287-297 (2001).
- Hasler, J. F. The current status of oocyte recovery, in vitro embryo production, and embryo transfer in domestic animals, with an emphasis on the bovine. J. Anim. Sci. 76, Suppl 3. 52-74 (1998).
- Hasler, J. F. Factors affecting frozen and fresh embryo transfer pregnancy rates in cattle. Theriogenology. 56, 1401-1415 (2001).
- Heyman, Y., Vincent, C., Garnier, V., Cognie, Y.
- McGinnis, L. K., Duplantis, S. C., Youngs, C. R. Cryopreservation of sheep embryos using ethylene glycol. Anim. Reprod. Sci. 30, 273-280 (1993).
- Shelton, J. N. Factors affecting viability of fresh and frozen-thawed sheep demi-embryos. Theriogenology. 37, 713-721 (1992).
- Bettencourt, E. M., Bettencourt, C. M., Silva, J. C. E., Ferreira, P., Matos, C. P., Ramão, R. J., Rocha, A. Fertility rates following the transfer of ovine embryos cryopreserved using three protocols. Small Ruminant Research. 82, 112-116 (2009).
- Chemineau, P., Procureur, R., Cognié, Y., Lefèvre, P. C., Locatelli, A., Chupin, D. Production, freezing and transfer of embryos from a bluetongue-infected goat herd without bluetongue transmission. Theriogenology. 26, 279-290 (1986).
- Baril, B., Casamitjana, P., Perrin, J., Vallet, J. C. Embryo production freezing and transfer in Angora, Alpine and Saanen goats. Zuchthyg. 24, 101-115 (1989).
- Guignot, F., Bouttier, A., Baril, G., Salvetti, P., Pignon, P., Beckers, J. F., Touzé, J. L., Cognié, J., Traldi, A. S., Cognié, Y., Mermillod, P. Improved vitrification method allowing direct transfer of goat embryos. Theriogenology. 66, 1004-1011 (2006).
- Nowshari, M. A., Holtz, W. In vitro culture of goat morulae to blastocysts before freezing. Theriogenology. 44, 983-988 (1995).
- Machatkova, M., Hulinska, P., Reckova, Z., Hanzalova, K., Spanihelova, J., Pospisil, R. In vitro production of embryos from high performance cows and the development of frozen-thawed embryos after transfer: a field study. Veterinarni Medicina. 53, 358-364 (2008).
- Martínez, A. G., Valcárcel, A., Furnus, C. C., de Matos, D. G., Iorio, G., de las Heras, M. A.
- Han, Y., Meintjes, M., Graff, K., Denniston, R., Zhang, L., Ziomek, C., Godke, R. Caprine offspring born from fresh and frozen-thawed in vitro-produced embryos. Veterinary Record. 149, 714-716 (2001).
- Leibo, S. P. A one-step method for direct nonsurgical transfer of frozen-thawed bovine embryos. Theriogenology. 21, 767-790 (1984).
- Voelkel, S. A., Hu, Y. X. Use of ethylene glycol as a cryoprotectant for bovine embryos allowing direct transfer of frozen-thawed embryos to recipient females. Theriogenology. 37, 687-697 (1992).
- Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
- Notter, D. R. The importance of genetic diversity in livestock populations of the future. J. Anim. Sci. 77, 61-69 (1999).
- Thibier, M. Data retrieval committee statistics of embryo transfer- year 2008. The worldwide statistics of embryo transfers in farm animals. Embryo Transfer Newsletter. 27, 13-19 (2009).
