Summary
Embriões pré-implantação pode ser criopreservados após a colocação em uma solução hipertônica crioprotectores para causar desidratação celular. Após atingir o equilíbrio, a formação de cristais de gelo é induzida na solução em torno do embrião. Maior desidratação ocorre quando o embrião é lentamente resfriado a temperaturas abaixo de zero antes de mergulhar em nitrogênio líquido para o armazenamento.
Abstract
Pré-implantação de embriões de bovinos, ovinos e caprinos podem ser criopreservados para armazenamento de curto ou longo prazo. Embriões pré-implantação é predominantemente constituído por água, e evitar a formação intracelular de cristais de gelo durante o processo de criopreservação é de suma importância para manter a viabilidade do embrião. Embriões são colocados em uma solução hipertônica (1,4-1,5 M) de um agente de crioprotetores (CPA), tais como etileno glicol (EG) ou glicerol (Glyc) para criar um gradiente osmótico que facilita a desidratação celular. Após atingir o equilíbrio osmótico de embriões na solução CPA, são individualmente carregados na solução hipertônica CPA em 0,25 ml canudos de plástico para congelar. Embriões são colocados em um freezer taxa controlada a uma temperatura de -6 ° C. Formação de cristais de gelo é induzida na solução CPA em torno do embrião, e cristalização provoca um aumento na concentração de CPA fora do embrião, causando desidratação celular ainda mais. Embriões são resfriados a uma taxa de 0,5 ° C / min, permitindo uma maior desidratação, a uma temperatura de -34 ° C antes de ser mergulhado em nitrogênio líquido (-196 ° C). Embriões criopreservados devem ser descongelados antes da transferência para um destinatário (substituto) do sexo feminino. Palhas contendo os embriões são removidos do nitrogênio líquido dewar, realizado em ar ambiente de temperatura de 3 a 5 seg, e colocados em banho-maria a 37 ° C por 25 a 30 seg. Embriões criopreservados em Glyc são colocados em uma solução de sacarose 1 M por 10 min para a remoção do CPA antes da transferência para um destinatário (substituto) do sexo feminino. Embriões criopreservados em EG, no entanto, podem ser diretamente transferidos para o útero de um destinatário.
Protocol
1. Avaliar a adequação de embriões para criopreservação 1
- Amostras colhidas a partir do trato reprodutivo de fêmeas dadoras indivíduo deve ser colocado em um meio isotônico embrião segurando por 10 minutos antes da avaliação em um estereomicroscópio. Esteja certo de manter os embriões de cada fêmea doadora separados um do outro para permitir a identificação de paternidade de filhos de transferência de embriões.
- Usando baixa ampliação (≤ 10X), as amostras de uma fêmea doadora individual deve ser segregado em grupos separados de óvulos não fertilizados consistindo, embriões degenerados, ou embriões de qualidade transferíveis. Apenas o grau de qualidade 1 ou 2 embriões na mórula compacta através de estágios de blastocisto expandido de desenvolvimento são adequados para a criopreservação, e todos os outros deve ser descartada (a não ser fêmeas receptoras síncronas estão disponíveis para a qualidade de grau 3 embriões e uma taxa de gravidez após a transferência de aproximadamente 25 -30% é considerada aceitável).
- Inspecionar grau de qualidade 1 e 2 mórula compacta através de embriões em estágio de blastocisto expandido, com uma ampliação ≥ 50X para garantir que a zona pelúcida do embrião está intacta e que não há material (por exemplo, células, muco) aderir à zona pelúcida. Qualquer embrião com um rachado ou faltando zona pelúcida ou com uma zona pelúcida ter material aderente devem ser separados dos outros embriões e quer ser descartados ou tratados separadamente.
2. Embriões de lavar para reduzir a probabilidade de transmissão da doença 2
- Mova zona pelúcida intacta embriões em um volume médio mínimo de embrião isotônica segurando no primeiro poço do meio de embrião de lavar roupa (por exemplo, tampão fosfato salino aumentou com antibióticos e soro albumina bovina, soro de vitelo recém-nascido, ou álcool de polivinil). Manter os embriões de cada fêmea doadora separadas, e não tentativa de lavar mais de 10 embriões de uma só vez. Mova embriões em um volume mínimo de meio para cada lavagem sucessivos para atingir uma diluição em série ≥ 1:100, e ter a certeza de usar dicas embrião estéril manipulação que são alterados entre cada lavagem sucessivos.
- Mova embriões a 4 lavagens mais como descrito em 2.1.
- Se a transmissão de doenças virais é de preocupação, lave embriões duas vezes em uma solução de tripsina 0,25%, para um tempo de exposição total combinado de tripsina de não mais de 90 segundos.
- Após as duas lavagens de tripsina, lavar 5 vezes mais embriões em meio de embriões de lavagem como descrito em 2.1.
- Após a lavagem embrião final, embriões lugar em embrião isotônica segurando médio.
3. Desidratação Embriões Antes de Criopreservação 3
- Embriões devem ser transferidos em um volume mínimo de meio isotônico embrião segurando em uma solução hipertônica (1,4-1,5 concentração Molar) de um agente de crioprotetores (CPA), tais como etilenoglicol ou glicerol.
- Permitir que embriões para sentar-se em meio de congelamento (solução hipertônica CPA) até atingirem o equilíbrio osmótico. Porque o etileno glicol permeia células embrionárias mais rapidamente do que o glicerol, os tempos de equilíbrio são tipicamente menos de embriões em etileno glicol (5 min) do que em glicerol (10 min). Parte deste tempo de equilíbrio pode ser alcançado durante e após os embriões são carregados em canudos (descrito na próxima etapa).
4. Embriões de carga em um canudo de plástico 0,25 ml para Criopreservação
- Anexar o fim tampão de algodão de um canudo de plástico 0,25 ml (11,5 cm de comprimento de trabalho) a um dispositivo de carga embrião, e aspirar aproximadamente 1,3 cm de solução hipertônica CPA em um canudo devidamente rotulados. Uma variedade de procedimentos de rotulagem existe, incluindo o uso de etiquetas impressas ligado a qualquer tomada de vedação de um canudo ou a outra palha conectado com um adaptador de palha.
- Remover a palha da solução CPA, e aspirar aproximadamente 0,15 cm de ar para criar uma bolha de ar minúsculas dentro do canudo.
- Aspirar um único embrião em aproximadamente 0,8 centímetros de solução hipertônica CPA na palha.
- Remover a palha da solução CPA e aspirado de aproximadamente 0,15 cm de ar para criar uma bolha de ar segunda minúscula dentro da palha (bolhas de ar servem para isolar fisicamente o embrião dentro da palha).
- Aspirar cerca de 9,1 centímetros de solução CPA para encher completamente a palha, sendo certo para atrair um volume suficiente de solução CPA para umedecer o policloreto de vinila (PVC) em pó que existe dentro da end tampão de algodão da palha. A solução faz com que o CPA pó de PVC para gel e selar essa extremidade da palha.
- Selar o outro lado da palha com PVC em pó, tampões de fecho de plástico de palha, ou um aferidor de calor.
5. Colocação de Embriões em uma máquina de congelação controlada Taxa de Embrião
- Por banho de metanol ou nitrogênio líquido máquinas de congelamento de vapor pode ser programado para criopreservação de embriões pré-implantação.
- Carregar os canudos que contém o Embry OS em uma máquina de congelação cuja temperatura foi resfriado da temperatura ambiente até -6 ° C. Palhas de carga final algodão plug-up (a menos que plugs canudo de plástico de vedação ou placas de palha estão sendo usados, caso em que end tampão de algodão é colocado para baixo).
- Permitir que embriões para sentar-se a esta temperatura durante pelo menos 2 minutos antes de prosseguir.
6. Semeadura
- Uma vez que os embriões têm arrefecido a -6 ° C, use um par de pinças supercooled em nitrogênio líquido (ou uma vara com ponta de algodão mergulhada em nitrogênio líquido) para induzir a formação de cristais de gelo na solução CPA dentro da palha, tocando as tenazes (ou algodão vara com ponta) para a coluna de solução acima ou abaixo do embrião.
- A água na solução CPA irá se cristalizar na região expostos ao nitrogênio líquido e cristais de gelo vai se espalhar para a coluna de solução CPA imediatamente em torno do embrião.
- Manter os embriões em semeadura temperatura por 10 minutos antes de arrefecimento adicional.
7. A desidratação contínua de Embriões
- Embriões frescos a uma taxa de 0,5 ° C / min até uma temperatura de -34 ° C. Esta taxa de resfriamento é importante para garantir a desidratação contínua do embrião.
- Manter os embriões em -34 ° C por 10 minutos antes de mergulhar embriões em nitrogênio líquido (-196 ° C).
- Lugar embriões criopreservados em uma taça devidamente rotulados (preenchido com nitrogênio líquido) anexado a um cana devidamente rotulados, e coloque a cana em uma vasilha de um líquido de nitrogênio dewar para armazenamento de curto ou longo prazo.
8. Descongelar embriões criopreservados
- Puxe a caixinha no pescoço do nitrogênio líquido dewar, garantindo que o recipiente permanece abaixo da linha de geada na dewar.
- Localize a cana que contém o embrião para ser descongeladas, e rapidamente e retire com cuidado a palha do cálice, sendo certo não aquecer demais palhas na taça.
- Segure o canudo no ar por 3-5 segundos (para reduzir a incidência de um rachado zona pelúcida 4), e depois submerge em um banho de água 37 ° C por mais 25-30 segundos.
- Remover a palha do banho de água, limpe a palha (tomando cuidado para não sujar a identificação do embrião na palha), use um dispositivo de corte para a palha cortarei a continuação macho não de algodão da palha (se o calor usando seladas ou PVC em pó ), ou remova cuidadosamente o bujão de plástico, e:
- carregar a palha em um dispositivo de transferência de embriões e transferência o mais rápido possível a um destinatário embrião síncrona (mas só se o embrião foi criopreservado utilizando o etilenoglicol como o CPA), ou
- segurar a extremidade aberta da palha sobre um prato contendo uma concentração de 1,0 Molar de sacarose (um composto não-permeando), e usar uma tesoura para cortar o fim tampão de algodão da palha. Conteúdo da palha deve fluir livremente na solução de sacarose, mas empurrando uma pequena coluna de ar através da palha pode ser necessária se qualquer meio residual existe dentro da palha. Permitir que embriões de permanecer em solução de sacarose por 10 minutos, e depois transferir embriões em embrião isotônica segurando médio por 10 minutos. Avaliar embriões pós-descongelamento, a carga em um canudo novo, e transferência para fêmeas receptor adequado.
9. Resultados representativos:
Uma variedade de fatores pode influenciar a gravidez e viver as taxas de natalidade resultantes da transferência de embriões congelados e descongelados de pré-implantação para fêmeas receptoras síncronas 5. Embriões em estágios de desenvolvimento menos avançados do que mórula compacta ou mais avançada do que blastocisto expandido, muitas vezes não sobrevivem ao processo de criopreservação de embriões, bem como na mórula compacta, blastocisto inicial, blastocisto e blastocisto expandido estágios do desenvolvimento embrionário. Embriões de grau de qualidade 1 e 2 maior rendimento de taxas pós-descongelamento a gravidez do que a qualidade de grau 3 embriões (que normalmente não são criopreservados devido às baixas taxas pós-descongelamento gravidez). Embriões mishandled durante o congelamento de embriões ou embrião descongelamento procedimentos são propensos a apresentar taxas de gravidez reduzida. Embriões transferidos para fêmeas receptoras cujos ciclos estrais não estão sincronizadas com a da fêmea doadora normalmente produzem taxas menores de gravidez. Embriões produzidos in vitro ou manipulados de alguma maneira (por exemplo, biópsia ou dividido) costumam gerar taxas menores de gravidez. Sob condições ótimas, as taxas de gravidez obtidas após a transferência de congelados e descongelados in vivo de embriões derivados é tipicamente 60-70% em bovinos 6,7, 65-75% em ovinos 8,9,10,11, e 60-70% em cabras 12,13,14,15. Da mesma forma, as taxas de gravidez obtidas após a transferência de congelados e descongelados em embriões produzidos in vitro é tipicamente 40-50% em bovinos 6,16, 25-35% em ovinos 17, e 30-40% em cabras 18.
ble 1 "/>Tabela 1. Esperado taxas de gravidez após a transferência de embriões congelados e descongelados de espécies de animais domésticos ruminantes para fêmeas receptoras síncronas.
Discussion
Porque os embriões é predominantemente constituído por água, é crucial que os embriões pré-implantação ser adequadamente desidratadas e lentamente resfriado, de acordo com o protocolo descrito aqui para evitar a formação de cristais de gelo intracelular. Uma vez que o processo de resfriamento começou, é importante para manter a mudança de temperatura e unidirecional para evitar flutuações de temperatura. Início da formação de cristais de gelo ("semeadura") a uma temperatura adequada para a solução CPA específicos é fundamental.
Modificações a este resfriamento lento / Método de descongelamento rápido para criopreservação de embriões pré-implantação incluir o método de uma etapa (onde a última coluna do meio carregado na palha é a sacarose, em vez de solução CPA) 19 eo método de transferência direta (onde os embriões congelados em etileno glicol são descongelados e transferidos diretamente para o útero de uma fêmea destinatário sem antes remover o etileno glicol a partir do embrião) 20. Para reduzir o volume de etileno glicol depositados no útero de uma transferência direta (DT) do sexo feminino destinatário, é aconselhável para preencher a palha de 0,25 ml com 6 cm segurando médio antes de continuar como descrito anteriormente. Note-se que existe um padrão voluntário no setor comercial de transferência de embrião pré-implantação de embriões criopreservados que para DT devem ser congeladas em amarelo cor de palha e armazenados em amarelo cor de taças no nitrogênio líquido dewar. O setor comercial também tem exigências específicas de rotulagem para todos os embriões criopreservados que devem ser seguidas.
Uma alternativa para esse método é vitrificação 21, um método de não equilíbrio de criopreservação onde uma mais concentrada (6-8 M) solução CPA é resfriado ultra-rapidamente causando a solução CPA para mudar do estado líquido para um estado "vidrados" sem gelo cristal formação. Vitrificação é provável mais adequado para a criopreservação de embriões que são menos avançados do que developmentally mórula compacta devido à sua sensibilidade à temperatura aumentada.
Esta técnica tem aplicação para a preservação de germoplasma de recursos exclusivos 22, bem como para a indústria de transferência de embrião comerciais internacionais, onde mais de 55% dos cerca de 500.000 embriões pré-implantação bovina transferidos no ano civil de 2008 foram criopreservados. 23
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Financiamento parcial do projeto de pesquisa USDA multi-estado W-2171 "Células Germinativas e Desenvolvimento e manipulação dos embriões para a Melhoria da Pecuária" é reconhecido agradecimento. Os talentos artísticos de Ryan Callahan, que preparou as ilustrações técnicas para a parte de vídeo do presente artigo, são também reconhecido agradecimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioLife freeze medium | Agtech, Inc. | C18, C18A | 1.5 M ethylene glycol |
| Emcare ethylene glycol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC8, IC10 | 1.5 M ethylene glycol |
| ViGro ethylene glycol freeze plus | Bioniche Animal Health | EVM835 | 1.5 M ethylene glycol |
| Emcare 10% glycerol freeze solution | ICPBio Reproduction | IC12 | 1.34 M glycerol |
| Emcare 1 M sucrose thaw | ICPBio Reproduction | IC16 | 1.0 M sucrose |
| ViGro one-step thaw | Bioniche Animal Health | EVM247, EVM847 | 1.0 M sucrose |
| ViGrothaw 1-2-3 plus | Bioniche Animal Health | EVM248, EVM848 | 5%, 2.5%, 0% glycerol with 0.5, 0.5, 0.6% sucrose |
| Emcare CSU thawing kit | ICPBio Reproduction | IC20 | 6%, 3%, 0% glycerol with 10.3% sucrose |
| BioLife holding and transfer medium | Agtech, Inc. | C15, C15A | modified PBS with 0.4% BSA (bovine serum albumin) |
| Emcare holding solution | ICPBio Reproduction | IC2, IC4, IC6 | 0.4% BSA (bovine serum albumin), MOPS buffer (inert zwitterions) |
| ViGro holding plus | Bioniche Animal Health | EVM024, EVM824 | |
| SYNGROHolding medium | Bioniche Animal Health | ESM024, ESM224, ESM828 | contains hyaluronan; no products of animal origin |
| BioLife modified D- PBS | Agtech, Inc. | C06 | modified Dulbecco's phosphate buffered saline |
| BioLifeBSA Fraction V | Agtech, Inc. | B09 | lyophilized bovine serum albumin, fraction V |
| BioLifeantibiotic-antimycotic | Agtech, Inc. | B01 | amphotericin-B, penicillin G, streptomycin sulfate |
| BioLifetrypsin kit | Agtech, Inc. | C22A | 25 g lyophilized trypsin, sterile water, sterile D-PBS |
| Biol-Cool controlled rate freezer | FTS Systems | BC-IV -40 | Methanol bath freezer |
| Freeze Control controlled rate freezer | Cryologic | CL2200 | Liquid nitrogen freezer |
References
- Lindner, G. M., Wright, R. W. Bovine embryo morphology and evaluation. Theriogenology. 20, 407-416 (1983).
- Stringfellow, D. A., Givens, M. D. Recommendations for the sanitary handling of in vivo derived embryos. Manual of the International Embryo Transfer Society. , 4th ed, International Embryo Transfer Society. Champaign, Illinois, USA. 65-68 (2010).
- Youngs, C. R., Leibo, S. P., Godke, R. A. Embryo cryopreservation in domestic mammalian livestock species. CAB Reviews: Perspectives in Agriculture, Veterinary Science, Nutrition and Natural Resources. , (2010).
- Rall, W. F., Meyer, T. K. Zona fracture damage and its avoidance during the cryopreservation of mammalian embryos. Theriogenology. 31, 683-692 (1989).
- Spell, A. R., Beal, W. E., Corah, L. R., Lamb, G. C. Evaluating recipient and embryo factors that affect pregnancy rates of embryo transfer in beef cattle. Theriogenology. 56, 287-297 (2001).
- Hasler, J. F. The current status of oocyte recovery, in vitro embryo production, and embryo transfer in domestic animals, with an emphasis on the bovine. J. Anim. Sci. 76, Suppl 3. 52-74 (1998).
- Hasler, J. F. Factors affecting frozen and fresh embryo transfer pregnancy rates in cattle. Theriogenology. 56, 1401-1415 (2001).
- Heyman, Y., Vincent, C., Garnier, V., Cognie, Y.
- McGinnis, L. K., Duplantis, S. C., Youngs, C. R. Cryopreservation of sheep embryos using ethylene glycol. Anim. Reprod. Sci. 30, 273-280 (1993).
- Shelton, J. N. Factors affecting viability of fresh and frozen-thawed sheep demi-embryos. Theriogenology. 37, 713-721 (1992).
- Bettencourt, E. M., Bettencourt, C. M., Silva, J. C. E., Ferreira, P., Matos, C. P., Ramão, R. J., Rocha, A. Fertility rates following the transfer of ovine embryos cryopreserved using three protocols. Small Ruminant Research. 82, 112-116 (2009).
- Chemineau, P., Procureur, R., Cognié, Y., Lefèvre, P. C., Locatelli, A., Chupin, D. Production, freezing and transfer of embryos from a bluetongue-infected goat herd without bluetongue transmission. Theriogenology. 26, 279-290 (1986).
- Baril, B., Casamitjana, P., Perrin, J., Vallet, J. C. Embryo production freezing and transfer in Angora, Alpine and Saanen goats. Zuchthyg. 24, 101-115 (1989).
- Guignot, F., Bouttier, A., Baril, G., Salvetti, P., Pignon, P., Beckers, J. F., Touzé, J. L., Cognié, J., Traldi, A. S., Cognié, Y., Mermillod, P. Improved vitrification method allowing direct transfer of goat embryos. Theriogenology. 66, 1004-1011 (2006).
- Nowshari, M. A., Holtz, W. In vitro culture of goat morulae to blastocysts before freezing. Theriogenology. 44, 983-988 (1995).
- Machatkova, M., Hulinska, P., Reckova, Z., Hanzalova, K., Spanihelova, J., Pospisil, R. In vitro production of embryos from high performance cows and the development of frozen-thawed embryos after transfer: a field study. Veterinarni Medicina. 53, 358-364 (2008).
- Martínez, A. G., Valcárcel, A., Furnus, C. C., de Matos, D. G., Iorio, G., de las Heras, M. A.
- Han, Y., Meintjes, M., Graff, K., Denniston, R., Zhang, L., Ziomek, C., Godke, R. Caprine offspring born from fresh and frozen-thawed in vitro-produced embryos. Veterinary Record. 149, 714-716 (2001).
- Leibo, S. P. A one-step method for direct nonsurgical transfer of frozen-thawed bovine embryos. Theriogenology. 21, 767-790 (1984).
- Voelkel, S. A., Hu, Y. X. Use of ethylene glycol as a cryoprotectant for bovine embryos allowing direct transfer of frozen-thawed embryos to recipient females. Theriogenology. 37, 687-697 (1992).
- Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
- Notter, D. R. The importance of genetic diversity in livestock populations of the future. J. Anim. Sci. 77, 61-69 (1999).
- Thibier, M. Data retrieval committee statistics of embryo transfer- year 2008. The worldwide statistics of embryo transfers in farm animals. Embryo Transfer Newsletter. 27, 13-19 (2009).
