Summary
Мы представляем неинвазивный подход выборки, чтобы эффективно собирать образцы волос от неуловимого мелких млекопитающих, как показано на американских пищуха. Мы продемонстрировать полезность этого метода извлечения ДНК из проб волос и усиления несколько типов молекулярных маркеров, широко используется в исследованиях по экологии сохранение дикой природы.
Abstract
Неинвазивная генетических методов отбора проб становятся все более важными для изучения популяций диких животных. Ряд исследований сообщили об использовании неинвазивных методов отбора проб для исследования популяционной генетики и демографии популяций диких 1. Этот подход оказался особенно полезным при работе с редкими или неуловимый видов 2. Хотя некоторые из этих методов были разработаны образцы волос, кала и другого биологического материала от хищников и средних млекопитающих, они в основном остались непроверенными в неуловимого мелких млекопитающих. В этом видео мы представляем новый, недорогой и неинвазивной волос ловушку, направленных на неуловимого зверька, американская пищуха (Ochotona принцепса). Опишем общую настройку волос ловушку, которая состоит из полос упаковочной ленты, расположенных в веб-как мода и расположенных вдоль маршрутов путешествий в среде обитания пищух. Проиллюстрируем эффективность ловушки на сбор большого количества волос, которые затем могут быть собраны и возвращены в лабораторию. Затем мы продемонстрировать использование ДНК IQ системы (Promega), чтобы изолировать ДНК и демонстрации полезности этого метода для усиления обычно используются молекулярные маркеры в том числе ядерного микроспутников, усиливаются длины фрагмента полиморфизмов (AFLPs), митохондриальной последовательности (800bp), а также молекулярный маркер определения пола. В целом, мы продемонстрировать полезность этого романа неинвазивной ловушку волос выборки техника для биологов дикой природы населения. Мы ожидаем, что этот подход будет применяться к целому ряду мелких млекопитающих, открывая области исследования в природных популяциях, при сведении к минимуму воздействия на изучение организмов.
Protocol
1. Волосы ловушки
До создания малого барабана, идеальное место должно быть определено в пределах среды обитания пищуха или осыпи склона. Это включает в себя сеном сваи, которые растительности кэши, животных собирают в конце лета, а также свежие scats найти на сайтах уборную. Полоски упаковочной ленты (10-50см в длину) катят для предоставления 360 ° липкой поверхности и расположены в веб-образной манере, чтобы конверт вход в куче сена пищуха (рис. 1) или уборной сайта. В зависимости от конфигурации скалы, кусок лески могут быть использованы для поддержки структуры волос ловушку, но этого делать не нужно, когда вход достаточно малы (<30 см в диаметре), полное описание использования лески можно найти в Генри и Russello (2010) 3. Волосы ловушки проверяются так часто, как это возможно, и образцы волос, нанесенных на ленту (рис. 2), затем собраны и помечены. После транспортироваться обратно в лабораторию, волоски удаляются из липкой ленты использованием стерильного пинцета и переданы в криогенных труб и хранить при температуре от -20 ° C до дальнейших манипуляций. Волосы образцы группируются вдоль волос ловушку, как считается, принадлежат одному человеку, в то время образцов кластерных независимо друг от друга, как предполагается, принадлежат к разным лицам. В последнем случае волосы помещают в разные пробирки. Эти предположения в дальнейшем могут быть проверены путем ДНК-отпечатков пальцев и расчеты вероятности идентификации на основе микросателлитных генотипических данных.
2. Выделения ДНК
С пищуха волосы очень тонкие и содержит крошечные лампы корень, мы уже показали, что не менее 25 волосков, должны получить достаточное количество ДНК для хорошего качества ниже по течению ПЦР-амплификации 3. Мы использовали ДНК IQ системы (Promega, Мэдисон, Висконсин, США) и слегка измененная версия инструкции производителя для выделения ДНК из образцов шерсти. Во-первых, волосы образец остановлен в микро-центрифуга для того, чтобы избежать потери волос при открытии трубки. Затем инкубационный раствор готовят путем смешивания 80 мкл инкубационного раствора с 10 мкл из DTT (1M) и 10 мкл протеиназы К (18ng/ml), приведет к конечной концентрации 0,1 М ДТТ и 1.8ng/ml инкубации протеиназы К. Решение (100 мкл) добавляется к образцу и инкубировали при 56 ° С в течение 1 часа. В то же время лизиса раствор готовится путем добавления 1 мкл DTT (1M) на каждые 100 мкл лизирующего буфера, в результате чего конечная концентрация DTT 0,01 М. Приготовленный раствор лизис (200 мкл) добавляется к образцу, а также 7 мкл смолы ДНК IQ, перемешивали в течение 3 секунд на высокой скорости и выдерживают при комнатной температуре в течение 5 минут. Образец затем перемешивают в течение 2 секунд и вставляется в магнитном стенд, где разделение магнитных гранул из раствора. Остальные раствор затем атмосферный и отбрасываются, стараясь не мешать магнитных гранул смолы. Затем образец обрабатывали 100 мкл приготовленного раствора лизис, встряхивали и вернулся в магнитных стенд, где происходит разделение снова. Лизис буфера атмосферный и отбрасываются, и этот шаг повторяется три раза использованием промывочного буфера (100 мкл). Образец впоследствии высохнуть в магнитном стенде в течение 15 минут. После высыхания, 100 мкл элюирующего буфера добавляется в образец и инкубировали при 65 ° С в течение 5 минут. Образец перемешивали и вставляется в магнитный стенд. Решение теперь содержащие элюируют ДНК затем переведен в 1,5 мл трубки Эппендорфа и хранить при температуре от -20 ° C до дальнейших манипуляций. ДНК из образцов печени также извлекали с помощью системы IQ ДНК и использовать в качестве положительного контроля для амплификации ПЦР.
3. ПЦР-амплификации
ДНК, полученной от наших неинвазивной ловушку волос и печеночных проб были затем использованы для усиления набор часто используемых молекулярных маркеров (микроспутник, AFLP, митохондриального цитохрома В и ZFX / ZFY определения пола маркер). ПЦР проводили с использованием Veriti термоциклер (Applied Biosystems, Foster City, Калифорния, США) в 25 мкл тома, содержащего: 10 - 20 нг ДНК, 0,5 мкМ каждого праймера, 10 мМ Трис-HCl (рН 8,3), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl 2, 200 мкМ дНТФ, 10 μ бычьего сывороточного альбумина (БСА; Новой Англии Биолабс, Ипсвич, Массачусетс, США) и 0,5 U AmpliTaq Золотой ДНК-полимеразы (Applied Biosystems). Велоспорт параметры микросателлитных локусов были оптимизированы с помощью программы приземления езда на велосипеде (10 мин при 95 ° C, 35 циклов при 95 ° С в течение 30 с, 30 с отжигом, и 45 с при 72 ° С, после чего последний шаг при 72 ° С в течение 10 мин). Температуры отжига уменьшается на 1 ° C за один цикл от 60 до 55 ° С до достижения шестой цикл, после чего оставшиеся 29 циклов продолжали при 55 ° C. Велоспорт параметры митохондриальной фрагменты, как описано выше, но состояла из 35 циклов с отжигомтемпературе 50 ° C. Усиленный полиморфизма длины фрагмента был проведен следующий протокол для позвоночных геномов описывается Бонин 4. Наконец, молекулярные определения пола проводился с помощью ПЦР-ПДРФ из ZFX / ZFY локусов с HinfI рестрикции пищеварения 5. ПЦР-продукты из микроспутников, AFLPs и цитохром B последовательности проводились на ABI 3130XL генетического анализатора (Applied Biosystems), в то время переваривается ZFX / ZFX фрагменты были бежать рядом с 100 б.п. лестницы (New England Biolabs) на 3% агарозном геле, содержащем 2,5% SYBR безопасного геля ДНК пятна (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) и визуализируется использованием RED персональная система визуализации геля (Альфа Иннотек, Сан-Леандро, штат Калифорния, США). Микроспутник и AFLPs были визуализированы использованием Genemapper v3.7 (Applied Biosystems) и митохондриальной ДНК хроматограмме визуализированы использованием Sequencher v4.7 (Gene кодекс корпорации, Энн Харбор, Мичиган, США).
4. Представитель результаты
ДНК, извлеченной из волос образцов, полученных с помощью нашего неинвазивной ловушки были использованы для ПЦР усиления различных типов молекулярных маркеров. В качестве основы для сравнения, ДНК извлекали с помощью печеночных проб усиливался вместе с нашими образцами волос. Ядерная локусов микроспутник были успешно усиливаются для волос и печеночных проб (рис. 3). Хотя интенсивность сигнала была выше при использовании образцов печени, это не имело негативного влияния на генотип скоринга (рис. 3). Аналогичные результаты были получены при использовании AFLPs (рис. 4), митохондриальная ДНК (рис. 5) и ZFX / ZFY молекулярный маркер определения пола (рис. 6).
Рисунок 1. Пример неинвазивной ловушку волос создана на сене кучу. Полоски засучив ясно упаковочной ленты расположены в веб-подобным же образом вложить вход в сено кучу. Кусок лески используется здесь, чтобы предоставить дополнительную помощь для волос ловушку.
Рисунок 2. Успешных ловушку волос, содержащие большое количество волос прилипли к упаковочной ленты.
Рисунок 3. Представителем ядерной хроматограмме микроспутника (Ocp6) 8, как показано на Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Топ хроматограмма была получена путем усиления ДНК из ткани печени, и является гетерозиготной (354/358) в этом локусе. Нижней хроматограмме представляет различные индивидуальные выставки гетерозиготных генотипов (358/362) на основе ДНК, извлеченной из волос. В то время как сигнал хроматограмме от волос образца меньшей интенсивностью, чем печень образца, генотип забил не пострадали от этой разницы в сигнале.
Рисунок 4. Представителем хроматограмме AFLP (E31T32), как показано на Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Топ хроматограмма была получена путем усиления ДНК из тканей печени, нижней хроматограмме представляет ДНК, извлеченной из волос.
Рисунок 5. Представителем митохондриальной ДНК хроматограмме (цитохром B), как показано на Sequencher v4.7 (Gene кодекса Corporation). Топ хроматограмма была получена путем усиления ДНК из тканей печени, нижней хроматограмме представляет ДНК, извлеченной из волос.
Рисунок 6. Представителем молекулярный маркер определения пола (ZFX / ZFY) усиливаются и для печени и образцы волос. Этот подход основан на наблюдении, что хромосома Y обладает сайта HinfI ограничение в этом регионе, что Х-хромосомы не хватает. Таким образом, самки производят два сопредседателя, мигрирующие фрагментов 432 б.п., а мужчины производят фрагментов 432 б.п., 261 б.п. и 171 б.п..
Discussion
Неинвазивная генетического отбора проб стали привлекательной альтернативой традиционным методам захвата жить по нескольким причинам. Во-первых, ненавязчиво сбора биологического материала (например, фекалии, волосы, перья, слюна и слизь) из диких популяций, исследователи могут изучать эти виды, не нарушая, обработку, или даже наблюдение за ними, тем самым снижая риски для животных, так и исследователей. Во-вторых, неинвазивный генетического отбора проб позволяет биологам для изучения популяций неуловимого и редких видов, задача, которая может оказаться трудным с более традиционными жить захвата подходов 6. И в-третьих, NGS может потенциально увеличить размер выборки за счет уменьшения беспокойства животных, отбор проб усилия и затраты, помогая тем самым минимизировать погрешности в оценках населения параметров 7. Этот последний пункт может сыграть решающую роль при работе с угрозой исчезновения, так как смещенные оценки населения параметров может привести к неуместным управления.
В настоящей статье мы описываем видео простым, роман, недорогой и неинвазивный метод для выборки неуловимого мелких млекопитающих, используя американский Пика в качестве примера. Показано, что ДНК, извлеченной из волос выполняется по аналогии с ДНК, выделенной из образцов печени по отношению к микроспутник, AFLP, митохондриальных и определения пола маркеров, что делает это неинвазивный метод отбора проб привлекательной альтернативой жить захвата или смертельного отбора проб. В целом, мы ожидаем, что этот метод будет полезен на этапе сбора данных населения генетические и поведенческие исследования редких или неуловимый видов мелких млекопитающих, при сведении к минимуму воздействия на организмы в стадии изучения.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Л. Эванс, Б. Грейнджер, Д. Rissling, З. Сим, А. Гудвин, К. и Д. Хейхерст Куч за помощь в этой области. К. Галбрет любезно предоставленные образцы пищуха печень от Белла Кула долине. Благодаря А. Гонсалвес да Силва и К. Ларсен за интересные обсуждения, которые способствовали дизайн этого неинвазивного метода генетического отбора. Эта работа финансировалась по естественным наукам и инженерным исследованиям Совета Канады Discovery, и UBC Оканаган Индивидуальные гранты для исследований марта Швейцарский национальный научный фонд Докторантура стипендий PBSKP3_128523 поддерживается PH. Это исследование было проведено следующее протокол по уходу за животными из Университета Британской Колумбии (Свидетельство номер: A07-0126).
Materials
Hair snare:
DNA extraction:
|
References
- Kendall, K. C. Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population. J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).
- Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia. Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).
- Henry, P. In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger. Mol Ecol. 18, 3173-3173 (2009).
- Henry, P., Russello, M. A. Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares. Eur J Wildlife Res. , (2010).
- Bonin, A., Pompanon, F., Taberlet, P. Use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers in surveys of vertebrate diversity. Method Enzymol 395. , 145-145 (2005).
- Fontanesi, L. Sexing European rabbits (Oryctolagus cuniculus), European brown hares (Lepus europaeus) and mountain hares (Lepus timidus) with ZFX and ZFY loci. Mol Ecol Resour. 8, 1294-1294 (2008).
- Piggott, M. P., Taylor, A. C. Remote collection of animal DNA and its applications in conservation management and understanding the population biology of rare and cryptic species. Wildl. Res. 30, 1-1 (2003).
- Banks, S. C. Demographic monitoring of an entire species (the northern hairy-nosed wombat, Lasiorhinus krefftii) by genetic analysis of non-invasively collected material. Anim. Conserv. 6, 101-101 (2003).
- Litvaitis, J. A. A range-wide survey to determine the current distribution of New England cottontails. Wildlife Soc B. 34, 1190-1190 (2006).
- Peacock, M. M., Kirchoff, V. S., Merideth, S. J. Identification and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the North American pika, Ochotona princeps. Mol Ecol Notes. 2, 360-360 (2002).
