Summary
אנו מציגים גישה דגימה פולשנית ביעילות לאסוף דגימות שיער של יונקים קטנים חמקמק, כפי שמוצג על pika האמריקאי. אנו מדגימים את השירות של שיטה זו על ידי מיצוי דנ"א של השיער שנדגמו הגברה מספר סוגים של סמנים מולקולריים נפוץ לימודי האקולוגיה ושימור חיות בר.
Abstract
פולשנית גישות דגימה גנטית הם הופכים חשובים יותר ויותר ללמוד אוכלוסיות חיות הבר. מספר מחקרים דיווחו על שימוש בטכניקות דגימה פולשנית לחקור אוכלוסייה ודמוגרפיה גנטיקה של אוכלוסיות הבר 1. גישה זו הוכיחה להיות שימושי במיוחד כאשר התמודדות עם מינים נדירים או חמקמק 2. בעוד מספר שיטות אלה פותחו שיער מדגם, צואה חומר ביולוגי אחר טורפים ובינוניות יונקים, הם נשארו בעיקר נבדק אצל יונקים קטנים חמקמק. בסרטון הזה, אנו מציגים רומן, מוקש שיער זול פולשנית מכוון יונק קטן וחמקמק, pika האמריקאית (Ochotona princeps). אנו מתארים את כללי הגדרת מוקש של השיער, אשר מורכב רצועות אריזה קלטת מסודרים אופנה אינטרנט כמו והניח לאורך נתיבי נסיעה בבית הגידול של pikas. אנו מדגימים את היעילות של המלכודת על איסוף כמות גדולה של שיער כי אז יכול להיות אסף והביא למעבדה. לאחר מכן, אנו מדגימים את השימוש במערכת ה-DNA IQ (Promega) כדי לבודד דנ"א להציג את התועלת של שיטה זו כדי להגביר סמנים מולקולריים נפוץ כולל מיקרו גרעיני, הגברה אורך קטע פולימורפיזמים (AFLPs), רצפים של המיטוכונדריה (800bp) וכן sexing סמן מולקולרי. בסך הכל, אנחנו מדגימים את השירות של מוקש שיער הרומן הזה לא פולשנית כטכניקה הדגימה ביולוגים אוכלוסיית חיות הבר. אנו צופים כי גישה זו תהיה ישימה מגוון רחב של יונקים קטנים, פתיחת אזורי החקירה בתוך אוכלוסיות טבעיים, תוך צמצום ההשפעה על אורגניזמים המחקר.
Protocol
1. שיער מוקש
לפני הקמת מוקש, מיקום אידיאלי צריך להיות נחוש בתוך הגידול pika או מדרון שפיע. זה כולל ערימות חציר, שהם מצבורי צמחייה החיות לאסוף בסוף הקיץ, כמו גם scats טרי שנמצאו באתרים השירותים. רצועות של נייר אריזה (10-50 ס"מ אורך) הם מגולגלת כדי לספק משטח 360 מעלות דביק מסודרים בצורה אינטרנט כמו על המעטפה הכניסה ערימת השחת של pika (איור 1) או השירותים באתר. בהתאם לתצורת הסלעים, חתיכת חוט דיג ניתן להשתמש כדי לתמוך את המבנה של מוקש את השיער, אבל זה בדרך כלל לא נחוץ כאשר הכניסות הם די קטנים (<30 ס"מ קוטר), תיאור מלא של השימוש חוט דיג ניתן למצוא הנרי Russello (2010) 3. מלכודות שיער נבדקים לעתים קרובות ככל האפשר, דגימות שיער שהופקדו על הקלטת (איור 2) נאספים אז שכותרתו. לאחר מועבר בחזרה למעבדה, שערות יוסרו מן הקלטת דביק באמצעות מלקחיים סטריליות והועברו לתוך צינורות קירור ומאוחסנים ב -20 ° C עד מניפולציה נוספת. דגימות שיער מקובצים יחד לאורך מוקש שיער נחשבים שייכים לאדם אחד, בעוד דוגמאות התקבצו באופן עצמאי הם הניחו להשתייך אנשים שונים. במקרה האחרון, שיער ממוקם אז צינורות שונים. הנחות אלה יכול להיות מאוחר יותר נבדק בדרך של טביעות אצבעות DNA וחישובים של הסתברות של זהות המבוססת על נתונים genotypic microsatellite.
2. מיצוי DNA
מאז pika שיער דק מאוד ומכיל נורת שורש זעיר, אנו הראו בעבר כי לפחות 25 שערות נדרשים להשיג כמויות מספיקות של DNA לטוב הגברה במורד איכות PCR 3. השתמשנו במערכת ה-DNA IQ (Promega, במדיסון, וויסקונסין, ארה"ב) גרסה שונה מעט של הוראות היצרן לבידוד דנ"א דגימות שיער. ראשית, המדגם השיער הוא סובב את בצנטריפוגה מיקרו על מנת למנוע אובדן של השיער תוך פתיחת הצינור. אז הפתרון הדגירה הוא מוכן על ידי ערבוב 80 μl של פתרון הדגירה עם 10μl של DTT (1M) ו 10μl של proteinase K (18ng/ml) לתוצאות בריכוז סופי של 0.1 M ו - DTT 1.8ng/ml של דגירה ק proteinase הפתרון (100 μl) מתווסף המדגם מודגרות על 56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. בינתיים, הפתרון תמוגה מוכן ידי הוספת 1 μl של DTT (1M) עבור כל 100 μl של חיץ תמוגה, וכתוצאה מכך ריכוז DTT הסופי של 0.01M. פתרון תמוגה הוכן (200 μl) הוא הוסיף אז המדגם, יחד עם 7 μl של שרף IQ DNA, vortexed למשך 3 שניות במהירות גבוהה מודגרות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. המדגם vortexed ואז למשך 2 שניות הוכנס לעמוד המגנטי, שם ההפרדה של חרוזים מגנטיים מפתרון מתרחשת. הפתרון שנותר הוא aspirated ואז מושלך, נזהר לא להפריע גלולה של שרף מגנטי. המדגם הוא טיפל אז עם 100 μl של הפתרון תמוגה מוכן, vortexed וחזר לעמוד המגנטי שבו ההפרדה מתרחשת שוב. המאגר תמוגה הוא aspirated וזנוח, וזה צעד חוזרת שלוש פעמים באמצעות חיץ לשטוף (100 μl). המדגם הוא עזב לאחר מכן לייבוש לעמוד המגנטי במשך 15 דקות. לאחר יבש, 100 μl של חיץ elution מתווסף המדגם מודגרות על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. המדגם vortexed ונוסף לעמוד המגנטי. הפתרון עכשיו המכיל את ה-DNA eluted הוא הועבר לאחר מכן צינור 1.5 Eppendorf מ"ל ו המאוחסן -20 ° C עד מניפולציות נוספות. דגימות דנ"א כבד הופק גם באמצעות מערכת IQ דנ"א המשמש כביקורת חיובית amplifications PCR.
3. PCR הגברה
הדנ"א המתקבל מוקש שיער פולשנית שלנו דגימות כבד שימשו אז להגביר חבילה של סמנים מולקולריים נפוץ (microsatellite, AFLP, המיטוכונדריאלי ציטוכרום B ו ZFX / ZFY סמן sexing). PCRs בוצעו באמצעות תרמית Veriti Cycler (Applied Biosystems, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב) בנפח 25 μL המכיל: 10-20 ng DNA, 0.5 מיקרומטר של כל פריימר, 10 mM טריס-HCl (pH 8.3), 50 מ"מ KCl, 1.5 mM MgCl 2, 200 מיקרומטר dNTPs, 10 μ שור בסרום אלבומין (BSA, ניו אינגלנד Biolabs, Ipswich, מסצ'וסטס, ארה"ב) ו 0.5 U AmpliTaq זהב פולימראז ה-DNA (Applied Biosystems). פרמטרים רכיבה על לוקוסים microsatellite היו אופטימיזציה באמצעות רכיבה על אופניים הנגיעה התוכנית (10 דק 'ב 95 ° C, 35 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 30 של חישול, ו 45 שניות ב 72 מעלות צלזיוס, ואחריו צעד סופי ב 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות). הטמפרטורה חישול ירידה של 1 ° C לכל מחזור 60-55 ° C עד שהגיע במחזור השישי, ובשלב 29 המחזורים הנותרים המשיכו ב 55 ° C. פרמטרים רכיבה על שברי המיטוכונדריה תוארו לעיל, אלא כללה 35 מחזורים עם חישולטמפרטורה של 50 ° C. Amplified אורך קטע פולימורפיזם נערך בעקבות פרוטוקול עבור הגנום חוליות שתואר על ידי בונין 4. לבסוף, sexing מולקולרית בוצע באמצעות PCR-RFLP של ZFX / ZFY לוקוסים עם העיכול הגבלה HinfI האנזים 5. המוצרים PCR מן, AFLPs microsatellite ו ציטוכרום רצפים B נוהלו על נתח ABI 3130XL גנטי (Applied Biosystems), בעוד מתעכל ZFX / ZFX שברי נוהלו לצד סולם נ"ב 100 (ניו אינגלנד Biolabs) על 3% agarose ג'ל המכיל 2.5% ג'ל בטוח SYBR DNA כתם (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה, ארה"ב) ו דמיינו באמצעות הדמיה אדום אישי ג'ל המערכת (אלפא Innotech, סן ליאנדרו, קליפורניה, ארה"ב). Microsatellite ו AFLPs היו דמיינו באמצעות Genemapper v3.7 (Applied Biosystems) ואת chromatogram הדנ"א המיטוכונדרי היה דמיינו באמצעות Sequencher v4.7 (ג'ין קוד Corporation, אן הרבור, מישיגן, ארה"ב).
4. נציג תוצאות
הדנ"א שנלקחו דגימות שיער שהושגו באמצעות מוקש פולשנית שלנו שימשו PCR להגביר סוג שונים של סמנים מולקולריים. כבסיס להשוואה, חילוץ באמצעות דגימות DNA הכבד היה מוגבר לצד דגימות שיער שלנו. גרעיני לוקוסים microsatellite היו מוגבר בהצלחה לשיער והן דגימות כבד (איור 3). למרות עוצמת האות היה גדול יותר בעת השימוש דגימות כבד, זה לא להשפיע לרעה על הניקוד גנוטיפ (איור 3). תוצאות דומות הושגו כאשר באמצעות AFLPs (איור 4), רצפי DNA המיטוכונדרי (איור 5), ואת סמן ZFX / ZFY sexing מולקולרית (איור 6).
באיור 1. דוגמה מוקש שיער פולשנית שהוקמה על ערימת חציר. רצועות של נייר מגולגל אריזה ברור מסודרים אופנה אינטרנט כמו לסגור את הכניסה ערימת השחת. חתיכה של חוט דיג משמש כאן כדי לספק תמיכה נוספת עבור מוקש השיער.
איור 2. מוקש שיער מוצלח המכיל מספר רב של שיער תקוע לקלטת האריזה.
איור 3. Chromatogram נציג microsatellite גרעיני (Ocp6) 8 מוצג כפי Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Chromatogram העליון התקבל על ידי ה-DNA הגברה של רקמת הכבד, והוא הטרוזיגוטיים (354/358) בשעה מוקד זה. Chromatogram התחתון מייצג אדם אחר מציג גנוטיפ הטרוזיגוטי (358/362) המבוסס על ה-DNA המופק שיער. בעוד האות של chromatogram מן המדגם שיער יש עוצמה נמוכה יותר מאשר במדגם הכבד, הבקיע גנוטיפ אינו מושפע לרעה הבדל זה האות.
איור 4. Chromatogram AFLP נציג (E31T32) מוצג כפי Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Chromatogram העליון התקבל על ידי ה-DNA הגברה של רקמת הכבד, chromatogram התחתון מייצג את ה-DNA המופק שיער.
איור 5. רצף ה-DNA המיטוכונדרי נציג chromatogram (ציטוכרום B) מוצג כפי Sequencher v4.7 (ג'ין קוד Corporation). Chromatogram העליון התקבל על ידי ה-DNA הגברה של רקמת הכבד, chromatogram התחתון מייצג את ה-DNA המופק שיער.
איור 6. Sexing נציג סמן מולקולרי (ZFX / ZFY) מוגבר של הכבד והן דגימות שיער. גישה זו נשענת על תצפית כי כרומוזום Y בעל אתר הגבלה HinfI באזור זה כי חסר כרומוזום X. לכן, נשים לייצר שני שיתוף נודדות שברים של 432 נ"ב תוך הזכרים לייצר שברי 432 נ"ב, 261 נ"ב ו - 171 נ"ב.
Discussion
דגימה גנטית פולשנית הפכה חלופה אטרקטיבית כדי המסורתית שיטות לכידה לחיות מכמה סיבות. ראשית, על ידי בחשאי לאסוף חומר ביולוגי (למשל, צואה, שערות, נוצות, רוק וריר) מאוכלוסיות הבר, החוקרים יכולים ללמוד מינים אלה מבלי להפריע, טיפול, או אפילו לצפות אותם, ובכך מקטין את הסיכונים הן חיות החוקרים. שנית, דגימה גנטית פולשנית מאפשרת לביולוגים לחקור אוכלוסיות של מינים חמקמקה ונדירה, משימה יכול להוכיח קשה לחיות עם השמנה הגישות המסורתיות יותר 6. ושלישית, NGS עלולה להגדיל את גודל המדגם על ידי צמצום הפרעה לבעלי חיים, מאמצים הדגימה, עלויות, ובכך מסייעת לצמצם הטיות אומדנים של פרמטרים באוכלוסייה 7. זו הנקודה האחרונה עשויה להוכיח מכריע בהתמודדות עם מינים מאוימים, שכן ההערכות מוטה של פרמטרים האוכלוסייה עלול לגרום וניהול הולם.
במאמר הנוכחי אנו מתארים וידאו שיטה פשוטה, חדשנית, זולה פולשנית מדגם יונקים קטנים חמקמק, באמצעות Pika האמריקאית כדוגמה. אנו מראים כי ה-DNA המופק שיער מבצע דומה ל-DNA שנלקחו דגימות כבד ביחס microsatellite, AFLP, המיטוכונדריה וסמנים sexing, מה שהופך את שיטת הדגימה פולשנית חלופה אטרקטיבית כדי לחיות דגימה או לכידה קטלנית. באופן כללי, אנו צופים כי שיטה זו תהיה שימושית בשלב איסוף הנתונים של מחקרים גנטיים התנהגותיים האוכלוסייה קטנה של מיני יונקים נדירים או חמקמק, תוך צמצום ההשפעה על אורגניזמים תחת מחקר.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו רוצים להודות ל אוונס, ב גריינג'ר, ד Rissling, צ'סים, א גודווין, Hayhurst ק וד Kuch לסיוע בתחום. ק חביב Galbreath סיפקו דגימות pika כבד מן Coola בלה העמק. תודה א Gonçalves דה סילבה ו - ק לארסן לדיונים המעניינים שתרמו לעיצוב של שיטת הדגימה פולשני זה גנטי. עבודה זו מומנה על ידי למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה דיסקברי, ו UBC מחקר Okanagan הפרט מענקים מרס השוויצרית הלאומית למדע מלגת קרן דוקטורט PBSKP3_128523 נתמך PH. מחקר זה נערך בעקבות פרוטוקול טיפול בבעלי חיים מאוניברסיטת קולומביה הבריטית (מספר תעודה: A07-0126).
Materials
Hair snare:
DNA extraction:
|
References
- Kendall, K. C. Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population. J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).
- Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia. Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).
- Henry, P. In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger. Mol Ecol. 18, 3173-3173 (2009).
- Henry, P., Russello, M. A. Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares. Eur J Wildlife Res. , (2010).
- Bonin, A., Pompanon, F., Taberlet, P. Use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers in surveys of vertebrate diversity. Method Enzymol 395. , 145-145 (2005).
- Fontanesi, L. Sexing European rabbits (Oryctolagus cuniculus), European brown hares (Lepus europaeus) and mountain hares (Lepus timidus) with ZFX and ZFY loci. Mol Ecol Resour. 8, 1294-1294 (2008).
- Piggott, M. P., Taylor, A. C. Remote collection of animal DNA and its applications in conservation management and understanding the population biology of rare and cryptic species. Wildl. Res. 30, 1-1 (2003).
- Banks, S. C. Demographic monitoring of an entire species (the northern hairy-nosed wombat, Lasiorhinus krefftii) by genetic analysis of non-invasively collected material. Anim. Conserv. 6, 101-101 (2003).
- Litvaitis, J. A. A range-wide survey to determine the current distribution of New England cottontails. Wildlife Soc B. 34, 1190-1190 (2006).
- Peacock, M. M., Kirchoff, V. S., Merideth, S. J. Identification and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the North American pika, Ochotona princeps. Mol Ecol Notes. 2, 360-360 (2002).
