Summary
我们目前的一种无创性的抽样方法，有效地收集从难以捉摸的小型哺乳动物的毛发样本，为美国鼠兔所示。从采样头发中提取的DNA和放大分子标记在野生动物生态学和保护的研究中常用的几种类型，我们证明这种方法的效用。
Abstract
无创性遗传取样方法正变得越来越重要，研究野生动物种群。一些研究报告说，使用非侵入性的抽样技术，调查种群遗传学和人口的1野生种群。这种方法已被证明是与罕见或难以实现的物种2处理时特别有用。虽然这些方法已发展到样品毛发，粪便和其他食肉动物和中型哺乳动物的生物材料，他们大都还停留在难以捉摸的小型哺乳动物未经测试。在这段视频中，我们提出了一个新颖，价格低廉，无创发圈套在一个难以捉摸的小型哺乳动物，美国鼠（兔princeps）针对性。我们描述了一般的头发圈套，包括包装磁带安排在一个类似Web的方式，在鼠兔栖息地的旅游路线沿条设置。我们将举例说明，在收集大量的头发，然后将其收集并带回实验室效率的圈套。然后，我们展示一个使用的DNA IQ系统（Promega公司）提取DNA，并展示了这种方法扩增包括核微卫星，扩增片段长度多态性（AFLPs），线粒体序列（800bp），以及常用的分子标记的实用性分子性别鉴定标记。总的来说，我们表现出的这本小说作为一个野生动物的种群生物学家的采样技术的非侵入性的头发圈套的效用。我们预计，这种方法将适用于各种小型哺乳动物，自然种群内开放地区调查，研究有机体的影响的同时最大限度地减少。
Protocol
1。发圈套
在此之前设立一个圈套，一个理想的位置已确定将在鼠兔栖息地或距骨斜坡。这包括干草桩，这是植被缓存动物在夏末，以及在厕所站点发现的新鲜粪便收集。打包带（长度10 - 50CM）条卷起提供了360 °粘表面，并在信封鼠的干草桩（图1）或厕所网站入口处的一个类似Web的方式安排。根据岩石的配置上，一块鱼线可用于支持头发的圈套结构，但这往往是没有必要时，入口非常小（直径30厘米），使用的完整描述鱼线，可以发现在亨利和罗素（2010）3。发网罗尽可能经常检查和头发样品存放在磁带上（图2），然后收集和标记。一旦运回实验室，毛发从粘用无菌镊子的磁带，并转移到低温管，并储存在-20 ° C，直到进一步的处理。集群沿着头发圈套在一起的头发样本被认为是属于一个单一的个体，而集群独立样本被假定为属于不同的个人。在后一种情况下，头发，然后放置在不同的管。这些假设可以在以后测试微基因型数据为基础的DNA指纹图谱和身份的概率计算方法。
2。 DNA的提取
由于鼠的头发是非常薄的，并包含一个微小的根灯泡，我们先前已经表明，至少25根头发都需要获得足够量的DNA质量好下游PCR 扩增 3 。我们使用DNA IQ系统（Promega公司，麦迪逊，威斯康星州，美国）和一个稍作修改的版本头发样本进行DNA隔离制造商的指示。首先，在一个微型离心机旋转的头发样本，为了避免脱发，同时开放管。然后孵化的解决方案是准备加入10μl的DTT（1M）和蛋白酶K（18ng/ml）加入10μl混合80μl孵育液的结果在终浓度为0.1米DTT和蛋白酶K孵化1.8ng/ml溶液（100微升）加入样品，并在56 ° C下孵育1小时。在此期间，裂解液准备为每100μL裂解液加入1μL的数码地面电视（1M），导致在最后一个0.01M的DTT浓度。准备裂解液（200μL），然后向样品中加入，7μL的DNA IQ树脂，3秒高速振荡，室温下孵育5分钟。该样本是2秒，然后振荡在磁场的立场，从溶液中分离磁珠时插入。余下的解决方案，然后吸气和丢弃，小心不要去打扰磁性树脂颗粒。样本，然后用100μL的准备裂解液，振荡并返回到磁隔离再次发生的立场。裂解液吸气和丢弃，这一步是使用洗涤缓冲液（100μL）重复三次。样本随后离开干在15分钟的磁场立场。干燥后，100μL洗脱缓冲液加入样品，并在65℃5分钟孵育。该样本是振荡并插入磁立场。该解决方案现在包含洗脱DNA，然后转移到1.5 mL Eppendorf管，在-20 ° C保存，直到进一步的操作。肝脏样本中的DNA提取DNA IQ系统和使用作为阳性对照PCR扩增。
3。 PCR扩增
从我们的非侵入性的头发圈套和肝脏样本中获得的DNA，然后用放大了一套常用的分子标记（微卫星，AFLP，线粒体细胞色素b和ZFX / ZFY绝育标记）。 PCR产物均用一个Veriti热循环仪（美国应用生物系统公司，福斯特城，加利福尼亚，美国）在25μL的体积，内含：10 - 20纳克的DNA，引物各0.5微米，10毫米的Tris - HCl（pH值8.3），50毫米1.5毫米氯化钾，氯化镁2，200μMdNTPs，10μ牛血清白蛋白（BSA的; NEB公司，伊普斯维奇，马萨诸塞州，美国）和0.5 U AmpliTaq黄金DNA聚合酶（Applied Biosystems公司）。骑自行车的微卫星位点的参数进行了优化，使用触地循环程序（10分钟95℃，35周期在95 ° C，30秒30秒退火，和45小号72 ° C，在72的最后一步° C下10分钟）。退火温度降低1 ° C，每个周期从60到55℃直至达到第六个周期，在这一点其余的29个周期持续在55 ° C。线粒体片段的循环参数如上所述，但包括35个循环与退火温度50 ° C。扩增片段长度多态性进行了以下的小笠原4所描述的脊椎动物基因组的协议。最后，分子进行性别鉴定是使用HinfI酶切5 ZFX / ZFY位点的PCR - RFLP 。从微，AFLPs和细胞色素b基因序列的PCR产物到ABI 3130xl基因分析仪（美国应用生物系统公司），而消化ZFX / ZFX片段100 bp的阶梯上含有3％的琼脂糖凝胶（New England Biolabs公司）一起运行2.5％的SYBR安全DNA凝胶染色（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，美国加利福尼亚州）和可视化，使用的是Red的个人凝胶成像系统（阿尔法INNOTECH公司，美国加利福尼亚州圣莱昂纳多）。微和AFLPs可视化使用GeneMapper v3.7（Applied Biosystems公司）和线粒体DNA色谱使用Sequencher V4.7（基因代码公司，安港，心肌梗死，美国）的可视化。
4。代表性的成果
从获得使用我们的非侵入性的圈套的头发样本中提取的DNA用于PCR扩增不同类型的分子标记。作为比较的基础上，DNA提取使用，与我们的头发样本扩增肝脏样本。核微卫星位点，成功地扩增头发和肝脏样本（图3）。虽然信号强度更大的肝脏样本时，这没有一个基因型得分的不利影响（图3）。使用AFLPs（图4），线粒体DNA序列（图5），ZFX / ZFY的分子绝育标记（图6）时，取得了类似的结果。
图1：成立一个非侵入性的头发圈套的例子在干草堆里。卷起的透明包装胶带条被安排在一个类似Web的时尚括干草堆里的入口。这里使用的是一块鱼线，为头发圈套提供更多的支持。
图2：一个成功的头发含有大量的包装胶带粘到头发的圈套。
图3显示一个有代表性的核微色谱（Ocp6）8 Genemapper v3.7（美国应用生物系统公司）。顶部色谱放大DNA从肝组织，是杂合子（358分之354）在该位点。底部色谱代表不同的个体表现出杂合基因型（362分之358）从头发中提取的DNA为基础。虽然从头发样本的色谱信号肝脏样品的比强度较低，基因型得分没有这种信号的差异造成不利影响。
图4。Genemapper v3.7（美国应用生物系统公司）显示一个代表性的AFLP色谱（E31T32）。顶部色谱放大DNA从肝组织中，底部色谱代表从头发中提取的DNA。
图5。一个有代表性的线粒体DNA序列图（细胞色素b）Sequencher V4.7（基因代码公司）显示。顶部色谱放大DNA从肝组织中，底部色谱代表从头发中提取的DNA。
图6。代表的分子绝育标记（ZFX / ZFY），肝脏和头发样本扩增。这种方法依赖于观察，Y染色体拥有在该地区的HinfI酶切位点，位于X染色体上缺乏。因此，雌性产生的432 bp的两个合作迁移的片段，而男性产生432基点，261 bp和171 bp的片段。
Discussion
无创性遗传取样，已成为一个有吸引力的替代传统的生活诱捕方法有以下几个原因。首先，悄悄地收集野生种群的生物材料（如粪便，毛发，羽毛，唾液和粘液），研究人员可以研究这些物种，互不干扰，处理，甚至观察他们，从而降低风险，这两种动物和研究人员。二，非侵入性的遗传采样使生物学家研究难以捉摸和珍稀物种的种群数量，任务可以证明难以与传统现场捕获方法6。第三，NGS可以潜在地增加样本量，减少干扰动物，抽样努力和成本，从而有助于最大限度地减少对人口参数 7的估计偏差。这后一点可能证明是至关重要的处理与受威胁的物种时，由于人口参数的估计偏差可能会导致不适当的管理。
在目前的视频文章中，我们描述了一个简单，新颖，价廉，无创的方法，以样本难以捉摸小型哺乳动物，使用美国皮卡为例。我们从头发中提取的DNA进行同样从肝脏样本中提取DNA微卫星，AFLP，线粒体和绝育标记，使这一非侵入性的抽样方法有吸引力的替代生活诱捕或致命的采样。总体而言，我们预计在罕见或难以实现的小型哺乳动物物种种群的遗传和行为研究的数据收集阶段，这种方法是有用的，同时尽量减少对研究生物的影响。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们想感谢L.埃文斯，B.格兰杰，四Rissling，Z SIM，A.古德温，光Hayhurst和Kuch D.在该领域的援助。光Galbreath慷慨地提供从贝拉Coola谷鼠肝脏样本。答：贡萨尔维斯席尔瓦和K.拉森有趣的讨论，这种无创性遗传取样方法的设计作出了贡献。这项工作是由自然科学和工程研究理事会，加拿大发现，和UBC那根个人研究补助金至3月。一位瑞士国家科学基金会博士后研究PBSKP3_128523支持的PH值。进行这项研究是从加拿大不列颠哥伦比亚大学（证书号：A07 - 0126）动物保健协议。
Materials
Hair snare:
DNA extraction:
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