Summary
Vi presenterar en icke-invasiv provtagning sätt att effektivt samla hår prover från gäckande små däggdjur, som visas för den amerikanska pika. Vi visar nyttan av denna metod genom att extrahera DNA från provtagning hår och förstärka flera typer av molekylära markörer används ofta i studier av vilda djur ekologi och bevarande.
Abstract
Noninvasiv genetisk provtagning angreppssätt blir allt viktigare att studera djurliv. Ett antal studier har rapporterat att använda icke-invasiv provtagningsteknik för att undersöka populationsgenetik och demografi vilda populationer 1. Detta tillvägagångssätt har visat sig vara särskilt användbart när man hanterar sällsynta eller svårfångade arter 2. Även ett antal av dessa metoder har utvecklats för att prova hår, avföring och annat biologiskt material från rovdjur och medelstora däggdjur, de har i stort sett oprövat i svårfångade små däggdjur. I denna video presenterar vi en ny, billig och icke-invasiv hår snara som riktar sig till en gäckande små däggdjur, den amerikanska Pika (Ochotona princeps). Vi beskriver den allmänna uppbyggnaden av håret snara, som består av remsor av förpackningstejpen arrangerade i en web-liknande mode och placeras längs reser rutter i Pikas livsmiljö. Vi illustrerar effektiviteten i snara att samla en stor mängd hår som sedan kan samlas in och föras tillbaka till labbet. Vi visar då användningen av DNA-IQ-system (Promega) isolera DNA och visa nyttan av denna metod för att förstärka vanliga molekylära markörer inklusive kärnvapen mikrosatelliter, förstärkta fragmentet polymorfismer längd (AFLPs), mitokondriella sekvenser (800bp) samt en molekylär könsbestämning markör. Sammantaget visar vi nyttan av denna nya icke-invasiv hår snara som provtagningsteknik för biologer djurlivet befolkning. Vi räknar med att detta tillvägagångssätt kommer att tillämpas på en mängd små däggdjur, öppna områden av undersökning inom naturliga populationer, och samtidigt minimera påverkan för att studera organismer.
Protocol
1. Hår snara
Före inrättandet av en snara, har ett perfekt läge skall bestämmas inom pika livsmiljö eller talus sluttning. Detta inkluderar hö högar, som är vegetationen cachar att djuren samlas i slutet av sommaren samt färsk scats finns på latrin platser. Remsor av förpackningstejpen (10-50cm i längd) rullas upp för att ge en 360 ° klibbiga yta och är ordnade i en webb-liknande sätt kuvert ingången till pika s hö högen (Fig. 1) eller latrin plats. Beroende på konfigurationen av stenarna, får en bit lina användas för att stödja strukturen i håret snara, men detta är ofta inte nödvändigt när ingångar är ganska små (<30 cm i diameter), en fullständig beskrivning av användningen av linan kan hittas i Henry och Russello (2010) 3. Hår snaror kontrolleras så ofta som möjligt, och hår prov deponeras på bandet (Fig. 2) samlas upp och märkt. När transporteras tillbaka till labbet, är hår bort från tejpen med hjälp av steril pincett och överföras till kryogena rör och förvaras vid -20 ° C tills vidare manipulation. Hår prover grupperade tillsammans längs en hår snara anses tillhöra en enda person, medan prover klustrade självständigt antas tillhöra olika individer. I det senare fallet, är håret placeras sedan i olika rör. Dessa antaganden kan sedan testas med hjälp av DNA-fingeravtryck och beräkningar av sannolikheten för identitet som bygger på mikrosatellit genotypiska data.
2. DNA-extraktion
Eftersom pika hår är mycket tunn och innehåller en liten rot glödlampa, har vi visat tidigare att minst 25 hårstrån som krävs för att erhålla tillräcklig mängd DNA för god kvalitet nedströms PCR-amplifiering 3. Vi använde DNA-IQ-system (Promega, Madison, WI, USA) och en något modifierad version av tillverkarens anvisningar för isolering av DNA från hår prover. För det första är hårprov snurrade ner i en mikro-centrifug för att undvika förlust av hår medan öppna röret. Då inkubationen bereds genom att blanda 80 ìl av inkubation lösning med 10μl av DTT (1M) och 10μl av proteinas K (18ng/ml) resultera i en slutlig koncentration av 0,1 M DTT och 1.8ng/ml av proteinas K. Inkubering Lösningen (100 l) tillsätts till provet och inkuberas vid 56 ° C i 1 timme. Under tiden är den lyseringslösning förberett genom att tillsätta 1 ìl DTT (1M) för varje 100 l av lyseringsbuffert, vilket ger en slutlig DTT koncentration av 0.01M. Förberedd lyseringslösning (200 l) läggs sedan till provet, tillsammans med 7 l DNA-IQ harts, vortexed i 3 sekunder vid hög hastighet och inkuberas i rumstemperatur i 5 minuter. Provet är då vortexed i 2 sekunder och införas i den magnetiska monter, där separering av magnetiska kulor från lösningen inträffar. Den återstående lösningen sedan sugs och kasseras, var försiktig att inte störa pelleten av magnetiska harts. Provet behandlas sedan med 100 l av det beredda lyseringslösning, vortexed och återvände till den magnetiska stå där separation inträffar igen. Den lyseringsbuffert sugs och kasseras, och det här steget upprepas tre gånger med en tvättbuffert (100 l). Provet därefter lämnas att torka i den magnetiska stå i 15 minuter. När torr, 100 ìl av eluering buffert tillsätts provet och inkuberas vid 65 ° C i 5 minuter. Provet vortexed och infogas i den magnetiska monter. Den lösning som nu innehåller eluerat DNA överförs därefter till ett 1,5 ml Eppendorf-rör och förvaras vid -20 ° C tills vidare manipulationer. DNA från lever prover var också extraherat använda systemet DNA IQ och används som positiv kontroll för PCR förstärkningar.
3. PCR-amplifiering
De DNA från våra icke-invasiv hår snara och prover levern används sedan för att förstärka en svit av vanliga molekylära markörer (mikrosatellit, AFLP, mitokondriellt cytokrom-B och ZFX / ZFY könsbestämning markör). PCR utfördes med hjälp av en Veriti värmecykeln (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) i en 25 mikroliter volym innehåller: 10 - 20 ng DNA, 0,5 mikroM av varje primer, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mm KCl, 1,5 mM MgCl 2, 200 mikroM dNTPs, 10 μ bovint serumalbumin (BSA; New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) och 0,5 U AmpliTaq Gold DNA-polymeras (Applied Biosystems). Cykling parametrar för mikrosatellit loci har optimerats med hjälp av ett program landningsögonblick cykling (10 min vid 95 ° C, 35 cykler vid 95 ° C i 30 s, 30 s glödgning, och 45 s vid 72 ° C, följt av ett sista steg vid 72 ° C i 10 min). Den glödgning Temperaturen sjönk med 1 ° C per cykel från 60 till 55 ° C tills att nå den sjätte cykeln, varvid de 29 återstående cyklerna fortsatte vid 55 ° C. Cykling parametrar för mitokondriella fragment som beskrivits ovan, men bestod av 35 cykler med en glödgningtemperatur på 50 ° C. Amplified Fragment Length Polymorphism gjordes efter protokollet för ryggradsdjur kartläggningen beskrivs av Bonin 4. Slutligen var molekylär könsbestämning genomförts med hjälp av PCR-RFLP av ZFX / ZFY loci med HinfI restriktionsenzymanalys matsmältningen 5. PCR-produkter från mikrosatellit, AFLPs och cytokrom B-sekvenser kördes på ett ABI-3130XL genetisk analysator (Applied Biosystems), medan smält ZFX / ZFX fragment kördes längs en 100 bp stege (New England Biolabs) på en 3% agarosgel innehållande 2,5% SYBR Säker DNA-gel bets (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) och visualiseras med en röd personlig systemet gel imaging (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA). Mikrosatellit och AFLPs var visualiseras med Genemapper v3.7 (Applied Biosystems) och mitokondrie-DNA kromatogrammet var visualiseras med Sequencher v4.7 (Gene kod Corporation, Ann Harbour, MI, USA).
4. Representativa resultat
Den DNA extraherat från hår prover erhålls med våra icke-invasiv snara användes för att PCR förstärka olika typer av molekylära markörer. Som underlag för jämförelse, extraherade DNA med levern prover förstärktes tillsammans med våra hår prover. Kärn mikrosatellit loci framgångsrikt förstärks för både hår och prover lever (Fig. 3). Även om graden av signalen var större när man använder levern prover, gjorde detta har inte en negativ effekt på genotyp poäng (bild 3). Liknande resultat uppnåddes när du använder AFLPs (bild 4), mitokondriellt DNA-sekvenser (bild 5), och ZFX / ZFY molekylär könsbestämning markör (bild 6).
Figur 1. Ett exempel på en icke-invasiv hår snara ställa upp på en hö högen. Remsor av rullas upp tydliga förpackningstejpen är ordnade i en webb-liknande sätt att bifoga ingången till hö högen. En bit fiskelina används här för att ge ytterligare stöd för håret snara.
Figur 2. En framgångsrik hår snara som innehåller ett stort antal hår fastnat på förpackningstejpen.
Figur 3. En representant nukleära mikrosatelliten kromatogram (Ocp6) 8 visas som i Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Den översta kromatogram erhölls genom att förstärka DNA från levervävnad, och är heterozygot (354/358) vid detta locus. Botten kromatogram representerar en annan individ uppvisar en heterozygot genotyp (358/362) baserat på DNA extraherat från hår. Medan signalen kromatogram från håret provet har en lägre intensitet än levern provet genotyp scoring inte påverkas negativt av denna skillnad i signal.
Figur 4. En representant AFLP kromatogram (E31T32) som visas i Genemapper v3.7 (Applied Biosystems). Den översta kromatogram erhölls genom att förstärka DNA från levervävnad representerar botten kromatogrammet DNA extraherat från hår.
Figur 5. En representant mitokondrie-DNA-sekvens kromatogram (cytokrom B) som visas i Sequencher v4.7 (Gene kod Corporation). Den översta kromatogram erhölls genom att förstärka DNA från levervävnad representerar botten kromatogrammet DNA extraherat från hår.
Figur 6. En representant molekylär könsbestämning markör (ZFX / ZFY) förstärks för både lever och prover hår. Detta synsätt bygger på iakttagelsen att Y-kromosomen har en HinfI begränsning plats i denna region att X-kromosomen saknar. Således honor producera två co-migrering fragment av 432 bp medan män producerar fragment av 432 bp, 261 bp och 171 bp.
Discussion
Noninvasiv genetisk provtagning har blivit ett attraktivt alternativ till traditionella leva fångstmetoder av flera skäl. Först genom att diskret samla in biologiskt material (t.ex. avföring, hår, fjädrar, saliv och slem) från vilda populationer, kan forskarna studera dessa arter utan att störa, hantering, eller ens observerar dem, vilket minskar riskerna för både djur och forskare. För det andra kan icke-invasiv genetisk provtagning biologer för att studera populationer av svårfångade och sällsynta arter, en uppgift som kan vara svårt med mer traditionella levande fånga metoder 6. Och för det tredje kan NGS öka potentiellt urvalsstorlekar genom att minska störningar för djur, insatser provtagning och kostnader, vilket bidrar till att minska fördomar i uppskattningar av befolkningen parametrar 7. Det sistnämnda kan visa sig avgörande när det handlar om hotade arter, eftersom partisk uppskattningar av befolkningen parametrar kan resultera i olämpliga förvaltningsbeslut.
I det aktuella videon artikeln beskriver vi en enkel, nya, billiga och icke-invasiv metod för att prov gäckande små däggdjur, med hjälp av amerikanska Pika som ett exempel. Vi visar att DNA extraherat från hår presterar på samma sätt som DNA extraherat från levern prover med avseende på mikrosatellit, AFLP, mitokondrie och markörer könsbestämning, vilket gör denna icke-invasiv provtagning ett attraktivt alternativ att bo fångst eller dödande provtagning. Sammantaget räknar vi med att denna metod kommer att vara användbart i insamlingen skede av befolkningen genetiska och beteendevetenskapliga studier av sällsynta eller gäckande små däggdjursarter, och samtidigt minimera påverkan på de organismer som studeras.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka L. Evans, B. Granger, D. Rissling, Z. Sim, A. Goodwin, K. Hayhurst och D. Kuch för hjälp i fält. K. Galbreath förutsatt vänligt pika lever prover från Bella Coola dalen. Tack till A. Gonçalves da Silva och K. Larsen för intressanta diskussioner som bidragit till utformningen av denna icke-invasiv genetisk provtagning. Detta arbete har finansierats av naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada Discovery, och UBC Okanagan Individuella stipendier forskning till mars En schweizisk National Science Foundation doc PBSKP3_128523 stöds PH. Denna studie har genomförts efter djurvård protokoll från University of British Columbia (Certificate Number: A07-0126).
Materials
Hair snare:
DNA extraction:
|
References
- Kendall, K. C. Demography and Genetic Structure of a Recovering Grizzly Bear Population. J Wildlife Manage. 73, 3-3 (2009).
- Rudnick, J. A., Katzner, T. E., Bragin, E. A., DeWoody, J. A. A non-invasive genetic evaluation of population size, natal philopatry, and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles (Aquila heliaca) in central Asia. Conserv. Genet. 9, 667-667 (2008).
- Henry, P. In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger. Mol Ecol. 18, 3173-3173 (2009).
- Henry, P., Russello, M. A. Obtaining high quality DNA from elusive small mammals using low-tech hair snares. Eur J Wildlife Res. , (2010).
- Bonin, A., Pompanon, F., Taberlet, P. Use of amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers in surveys of vertebrate diversity. Method Enzymol 395. , 145-145 (2005).
- Fontanesi, L. Sexing European rabbits (Oryctolagus cuniculus), European brown hares (Lepus europaeus) and mountain hares (Lepus timidus) with ZFX and ZFY loci. Mol Ecol Resour. 8, 1294-1294 (2008).
- Piggott, M. P., Taylor, A. C. Remote collection of animal DNA and its applications in conservation management and understanding the population biology of rare and cryptic species. Wildl. Res. 30, 1-1 (2003).
- Banks, S. C. Demographic monitoring of an entire species (the northern hairy-nosed wombat, Lasiorhinus krefftii) by genetic analysis of non-invasively collected material. Anim. Conserv. 6, 101-101 (2003).
- Litvaitis, J. A. A range-wide survey to determine the current distribution of New England cottontails. Wildlife Soc B. 34, 1190-1190 (2006).
- Peacock, M. M., Kirchoff, V. S., Merideth, S. J. Identification and characterization of nine polymorphic microsatellite loci in the North American pika, Ochotona princeps. Mol Ecol Notes. 2, 360-360 (2002).
