Summary
מחקר זה מתאר את האבחנה של שפעת העופות בעופות בר באמצעות מערכת ניידת rRT-PCR. השיטה מנצלת מיובשים בהקפאה ריאגנטים למסך ציפורי בר בסביבה הלא במעבדה, תרחיש טיפוסי של התפרצות. שימוש בכלים מולקולריים מספק חלופות מדויק ורגיש לאבחון מהיר.
Abstract
ציפורי בר היו מעורבים התפשטות שפעת העופות מאוד פתוגניים (HPAI) של תת סוג H5N1, שגרם מעקב לאורך flyways נודדות. דגימה של ציפורי בר וירוס שפעת העופות (AIV) מתנהל לעתים קרובות באזורים נידחים, אבל התוצאות הן לעתים קרובות מתעכב בשל הצורך להעביר דגימות למעבדה מצויד לבדיקה מולקולרית. בזמן אמת transcriptase הפוכה polymerase תגובת שרשרת (rRT-PCR) היא טכניקה מולקולרית המציע אחת השיטות המדויקות ביותר ורגישה לאבחון של AIV. פרוטוקולים המעבדה קפדנית בעבר הדרושים rRT-PCR כיום להיות מותאמים עבור השדה. פיתוח של חומרים כימיים מיובשים בהקפאה (lyophilized) שאינם דורשים שרשרת קר, עם רגישות ברמה של ריאגנטים רטוב הביא באתר בדיקות מרחוק מטרה מעשית.
כאן אנו מציגים שיטה לאבחון מהיר של AIV בעופות בר באמצעות יחידת rRT-PCR (מכשיר מתקדם Ruggedized זיהוי הפתוגן או RAPID, איידהו טכנולוגיות, סולט לייק סיטי, יוטה) המעסיקה ריאגנטים lyophilized (1 שפעת יעד TaqMan; ASAY -ASY-0109, איידהו טכנולוגיות). ריאגנטים להכיל את כל המרכיבים הדרושים לצורך בדיקות בריכוזים המתאימים שפופרת אחת: primers, בדיקות, אנזימים, מאגרים בקרות פנימיות חיוביות, ביטול שגיאות הקשורות אחסון לא נכון או טיפול של ריאגנטים רטוב. יחידה ניידת מבצע מסך לשפעת על ידי מיקוד הגן מטריצה והתשואות תוצאות 2-3 שעות. Subtyping גנטית אפשר גם עם פריימר H5 ו - H7 קובע כי היעד של הגן hemagglutinin.
המערכת הוא מתאים לשימוש על דגימות ביוב ו הלוע התחתון שנאספו ציפורי בר, כפי שהודגם כאן על מינים נודדים shorebird, ביצנית המערבי (Calidrus mauri) כבשו בצפון קליפורניה. טיפול בבעלי חיים בעקבות הפרוטוקולים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש הגיאולוגי בארה"ב סקר המערבי מרכז מחקר אקולוגי והיתרים של בירד בארה"ב סקר גיאולוגי banding מעבדה. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא לזרז את האבחון של ציפורי בר, להגדיל את הסיכויים של המכיל התפרצות במיקום מרוחק. באתר אבחנה גם להיות שימושי עבור זיהוי לומדים אנשים נגועים באוכלוסיות הבר. ההזדמנות לאסוף מידע על הביולוגיה מארח (בתגובה החיסונית לזיהום פיזיולוגיים) ואקולוגיה מרחבית (ביצועים הנדידה של עופות נגועים) יספק תובנות המידה שבה ציפורי בר יכולים לשמש וקטורים עבור AIV על פני מרחקים ארוכים.
Protocol
1. ציפור ללכוד Wild באמצעות רשתות ערפל
- עבור ללכוד shorebird, להקים רשתות ערפל באתר ליקוט פעיל כגון ביצה, קו החוף, או בוץ שטוח.
- קו שקופיות מכמורת לולאות בקצה אחד של הרשת ערפל סביב הקוטב והכנס מוט אנכית לתוך הבוץ.
- למתוח את הרשת, להוסיף מוט השנייה ועד מכמורת לולאות בסוף אחרים נטו ערפל אנכית להכניס מוט לתוך הבוץ, מוודא כי קווי מכמורת לומדים.
- לאחר ציפור בשבי, לחלץ את הציפור נטו ולחזור לתחנת banding.
2. ביוב הדגימה ספוגית
- איסוף דגימות ביוב מיד לאחר לכידת
- אתר את הביב ולהשתמש בקצות האצבעות להדוף הנוצות שמסביב
- לגולל דקרון או סטריליים פוליאסטר שקצהו ספוגית, גזע סוף הראשון, להרטיב את קצה עם סטרילי התקשורת התחבורה ויראלי להקל יותר בניקוי. לאחר הרטבה, הראש כולו ספוגית מוכנס בעדינות לתוך הביב. ספוגית היקף הפנימי של הביב ידי לאט מסובב את ספוגית ולהסיר את ספוגית מן הביב.
- החדרת קצה ספוגית ישירות את הבקבוקון ויראלי תחבורה התקשורת מדגם: לסובב את פיר ספוגית בין האגודל לאצבע בזמן ספוגית היא בתקשורת. האם עוזר להשלים את ההליך על ידי משיכת קצה האחורי ספוגית מהחלק התחתון של המכל ~ 1 ס"מ וחותכים את הפיר של ספוגית עם זוג מספריים כך קצה ספוגית נשאר בקבוקון ואת הפיר לא להפריע כובע הסגר. שווי בקבוקון בחוזקה. לחטא את המספריים עם אלכוהול חיתוך בין פירים ספוגית.
- מניחים את צלוחיות במקפיא בקופסה המכילה או קרח יבש או שקיות קרח.
3. דגימה הלוע התחתון ספוגית
- בעדינות לפתוח במקורה של הציפור כך חריץ choanal גלוי
- לגולל ספוגית נקייה מהחבילה, גזע סוף הראשון, להרטיב את קצה עם התקשורת התחבורה ויראלי להקל יותר בניקוי
- מבלי לגעת טיפ לכל משטחים אחרים, להכניס אותו לתוך הפה ספוגית הפתיחה choanal על גג הפה וממשיכים לעבר האזור הלוע התחתון או בגרון
- הניחו את קצה ספוגית ישירות את הבקבוקון תחבורה התקשורת ויראלי. סובב את מוט ספוגית בין האגודל לאצבע בזמן ספוגית היא בתקשורת. לעיל, יש עוזר למשוך את קצה הגב ספוגית מהחלק התחתון של המכל ~ 1 ס"מ וחותכים את הפיר של ספוגית עם זוג מספריים כך קצה ספוגית נשאר בקבוקון ואת הפיר אינו מתערב עם כובע הסגר. שווי בקבוקון בחוזקה. לחטא את המספריים עם אלכוהול חיתוך בין פירים ספוגית.
- מניחים את צלוחיות במקפיא בקופסה המכילה קרח יבש או שקיות קרח.
4. ציפור טיפול ושחרור
- חזור ציפור לאתר של ללכוד לשחרר במועד (<20mins). המפעילים צריכים להיות מודעים לעקרונות של רווחת בעלי החיים ולהיות ערניים לסימנים של ציפור סבל במהלך הדגימה (שריטות כלומר, ללכוד מיופתיה ו תת או היפרתרמיה). ערכת עזרה ראשונה בסיסית צריך להיות כלול ברשימת הציוד.
5. בדיקת מתקני
- דוגמאות ניתן לבדוק בשטח כל סגורים כגון הקרוואן מחקר או באוהל, עם ספק כוח (מתח, מוסדר מחולל חשמל) כדי להפעיל את יחידת ה-PCR ואת המחשב המחובר.
6. RNA מיצוי
- מיצוי RNA בוצעה עם ערכת מיני RNeasy עם שינויים קלים הוראות היצרן הבאים Spackman ואח' 1.
- וורטקס ספוגית בינוני של 3-5 ולהעביר 350 μl לצינור microcentrifuge 2 מ"ל. הערה: שמור על מדגם יתר על הקרח במקרה PCR חיובי דגימות צריך להיות rescreened או מבחן H5 צריך לרוץ.
- הוסף 350 μl של חיץ RLT (עם β-לי) ו מערבולת של 5 s.
- הוסף 350 μl של אתנול RNA 70% בכיתה.
- צנטריפוגה XG ב 5000 עבור 5 דקות.
- הוסף 600 μl של supernatant לעמודה ספין להציב צינור אוסף 2 מ"ל. לשמור על מדגם שנותרו מתלה מבחנה.
- צנטריפוגה עבור s 20 ב XG 10,000 וזורקים זרימה דרך.
- חזור על שלבים 17-18 עד שכל מדגם כבר עבר עמודה ספין.
- מקום בעמודה ספין צינור נקי אוסף 2 מ"ל.
- הוסף 700 μl של חיץ RW1 לעמודה ספין צנטריפוגה 25 s ב x 10,000 g. מחק את הזרימה דרך.
- הוסף 500 μl חיץ הרשתית לעמודה ספין צנטריפוגות עבור s 25 ב 10,000 x ז מחק את הזרימה דרך.
- חזור על שלב 22 עבור סכום כולל של שני שוטף עם חיץ הרשתית.
- צנטריפוגה העמודה ספין עבור 2 דקות נוספות על 14,000 x ז בטל צינור איסוף.
- מניחים את הטור ספין צינור microcentrifuge נקי 1.5 מ"ל ולהוסיף מים 50μl nuclease חינם. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 60 s.
- Elute RNA על ידי ספינינג עבור s 60 ב xgf 10,000 או 60 s. המקום מטוהרים מדגם על הקרח.
7. הכנת שולטת שלילי
- ריאגנטים Lyophilized היו מוכנים לשימוש assay PCR בהתאם להוראות של ערכת טכנולוגיות איידהו מיובשים בהקפאה איתור מגיב לשפעת בדיקות TaqMan יעד 1 (ASAY-ASY-0109).
- צנטריפוגה שליטה שלילי מגיב בקבוקון (אדום) עבור ר 3 כדי להבטיח כדורי נמצאים בתחתית.
- הסרת כובע, ויזואלית לעשות כדורי בטוח נמצאים בתחתית.
- הוסף 20 μl של הצפת X 2 ו - 20 הכינון מים μl כיתה מגיב.
- Recap ו מערבולת במשך 5 שניות במהירות המרבית.
- צנטריפוגה עבור 3 s להביא נוזל לתחתית של הבקבוקון.
- ראייה לבדוק גלולה יש rehydrated, אם לא חזור על שלבים 31-32.
- פיפטה 19 μl של התייבשות התערובת לתוך צינור Lightcycler נימי, חזור על שלב פיפטה לתוך נימי השני לקבל כפולים.
8. בדיקת דגימות הכנת
- צנטריפוגה את הבקבוקון מגיב לא ידוע (כחול) במשך 3 שניות על מנת להבטיח כדורי נמצאים בתחתית.
- הסרת כובע, ויזואלית לעשות כדורי בטוח נמצאים בתחתית.
- הוסף 40 μl של מטוהרים RNA.
- Recap ו מערבולת במשך 5 שניות במהירות המרבית.
- צנטריפוגה עבור 3 s להביא נוזל לתחתית של הבקבוקון.
- ראייה לבדוק גלולה יש rehydrated, אם לא חזור על שלבים 38-39.
- פיפטה 19 μl של התייבשות התערובת לתוך צינור Lightcycler נימי, חזור על שלב פיפטה לתוך נימי השני לקבל כפולים.
9. הכנת שולטת חיובית
- צנטריפוגה הביקורת החיובית מגיב בקבוקון (ירוק) עבור ר 3 כדי להבטיח כדורי נמצאים בתחתית.
- הסרת כובע, ויזואלית לעשות כדורי בטוח נמצאים בתחתית.
- הוסף 20 μl של הצפת X 2 ו - 20 הכינון מים μl כיתה מגיב.
- Recap ו מערבולת במשך 5 שניות במהירות המרבית.
- צנטריפוגה עבור 3 s להביא נוזל לתחתית של הבקבוקון.
- ראייה לבדוק גלולה יש rehydrated, אם לא חזור על שלבים 45-46.
- פיפטה 19 μl של התייבשות התערובת לתוך צינור Lightcycler נימי, חזור על שלב פיפטה לתוך נימי השני לקבל כפולים.
10. Centrifuging צינורות נימי
- לאחר שכל הצינורות נימי עבור אצווה הוכנו לטעון אותם לתוך צנטריפוגה במיני מצויד במתאמי נימי.
- צנטריפוגה בהגדרה הנמוכה ביותר על ידי לחיצה על כפתור הדופק למטה 1 s. זה העברות נוזל לתחתית לקראת הבדיקה.
11. הפעלה מהירה
- ליצור קובץ חדש. לייבל בקרה חיובית, שליטה שלילי, דוגמאות (על ידי מספר תעודת הזהות שלהם).
- תוכנית 1: הכנת RNA החזק לדוגמא
- מחזורי = 1
- מצב = ניתוח אף
- טמפרטורה Target = 40
- זמן דגירה = 30 דקות
- מעבר טמפרטורה שיעור = 20 ° C / s (ברירת המחדל)
- מטרה משנית טמפרטורה = 0 (ברירת המחדל)
- גודל שלב = 0 (ברירת המחדל)
- עיכוב שלב = 0 (ברירת המחדל)
- מצב רכישת = אין (ברירת המחדל)
- תוכנית 2: RNA denaturation
- מחזורי = 1
- מצב = ניתוח אף
- טמפרטורה Target = 94
- זמן דגירה = 120s
- מעבר טמפרטורה שיעור = 20 ° C / s (ברירת המחדל)
- מטרה משנית טמפרטורה = 0 (ברירת המחדל)
- גודל שלב = 0 (ברירת המחדל)
- עיכוב שלב = 0 (ברירת המחדל)
- מצב רכישת = אין (ברירת המחדל)
- תוכנית 3: הגברה RNA
- מחזורי = 45
- מצב ניתוח = ניתוח אוטומטי
- טמפרטורת היעד, במגזר 1 = 94; קטע 2 = 60
- זמן דגירה, קטע 1 = 0 s, קטע 2 = 20 s
- מעבר דרג טמפרטורה, Seg 1 & 2 = 20 ° C / s (ברירת המחדל)
- טמפרטורת היעד המשני, Seg 1 & 2 = 0 (ברירת המחדל)
- גודל שלב, Seg 1 & 2 = 0 (ברירת המחדל)
- עיכוב שלב, Seg 1 & 2 = 0 (ברירת המחדל)
- מצב רכישה, קטע 1 = none; קטע 2 = אחד
- Fluorescence פרמטרים
- מצב תצוגה: ערוץ פלואורסצנציה 2 (CH2 / 1)
רווחים:- פרק 1 (F1) = 1
- פרק 2 (F2) = 8
- פרק 3 (F3) = 1
- כדי להציג את נתונים בזמן אמת הקרינה עבור כל דגימה, בחר מדגם של עניין ללחוץ על הלחצן 'הצג גרף "בחלק התחתון של המסך
- מצב תצוגה: ערוץ פלואורסצנציה 2 (CH2 / 1)
- עבור כל נימי, התוצאות כוללות את הפעולות הבאות:
- # - מזהה את המיקום של הקרוסלה הקרוסלה
- שם לדוגמה - מספק את השם של המדגם
- הבקרה - indentifies סוג המדגם עבור כל דגימה
- ציון - מחושב באמצעות הקשר בין הקרינה של מדגם את רמת הקרינה רקע במדגם
- התוצאה - מציג את התוצאה הכוללת למדגם
12. נציג התוצאות:
> תוצאות אפשריות כוללות:
היום: לקרוא "מתנה" אדום לבדיקה / מדגם לא ידוע מציין כי היעד זוהה לדוגמה ושולטת היו מוצלחים.
לא מזוהה: "לא זוהה" ירוק קוראים לבדיקה / מדגם לא ידוע מציין כי היעד לא זוהה לדוגמה ואת שולטת הבדיקה היו מוצלחים.
בבקשה חוזר: "אנא חזור" עולה כי השליטה חיובי או שלילי נכשל.
דוגמה של ניתוח מוצלח על ידי RAPID 7200 מוצג באיור 4. השליטה חיובי מוגבר ויוצר הקרינה לזיהוי (ציר y) על כ 25 מחזורים (ציר x). סף מחזור (CT)> 35 הוא חתך הסכימו רוב המעבדות AIV התייחסות. לכן, שולטת חיובית עבור שיטה זו הפיקה אות ניאון בתוך מספר המקובל של מחזורים (0-35) לגילוי AIV. לעומת זאת, הביקורת השלילית אינה מייצרת אות ניאון גם אחרי 45 מחזורים. בדומה לכך, עשר דגימות שנאספו לביצניות המערב לא ליצור אות ניאון המציין כי העופות היו שליליות עבור AIV. מעקב ובדיקה של כל הדגימות החיוביות במעבדה המסורתית מומלץ לוודא כי אין תוצאות חיוביות שגויות מיוצרים בטעות.
1. איור Shorebird ללכוד באמצעות רשתות ערפל.
איור 2. איסוף דגימות ביוב ו הלוע התחתון של לפחות לביצניות.
איור 3. תכנות 7200 RAPID עבור הגברה RNA.
איור 4. Fluorogram שנוצר על ידי RAPID 7200 נייד rRT-PCR מראה איך בקרות חיוביות ושליליות אמור להופיע assay מוצלח. לחץ כאן כדי להציג את התמונה בגודל מלא
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת אבחון מהיר המוצג כאן מאפשר בדיקה זמן יעיל ומדויק של דגימות צפור פראית למעקב של AIV. אחסון הרבה פחות מחמירים הדגימה דרישות ניידים rRT-PCR מתאים למצבים מרוחקים שבהם תחזוקה של רשת קר עשוי להיות מעשי אם משלחים חנקן נוזלי או קרח יבש אינו זמין. בנוסף, מצאנו כי ניתוח דגימה עם מיובשים בהקפאה ריאגנטים היה פשוט מספיק כדי להיות מבוצע על ידי ביולוגים בתחום עם ידע מינימלי של ניתוח מעבדה מבוססי מולקולרית. הטכניקה זמן יעיל גם חסכונית. עם מפעיל אחד, זה היה אפשרי רצה חמישה קבוצות, וכתוצאה מכך 42 הקרנות AIV עבור כל יום בסביבה השדה. החוקרים העריכו כי כל החומרים הדרושים כדי להפעיל את המערכת יכול להיות הביאו לכל מקום ואת המתודולוגיה אפשר ללמד מפעיל במהלך היום. הגורם המגביל במצבים בשדה המרוחק אספקת החשמל הנדרש כדי להפעיל את יחידת נייד rRT-PCR ואת המחשב המחובר, אך זה עשוי להיות מיתנה באמצעות גנרטור כוח נייד מתח חשמלי מוסדר. בנוסף, רצף של RNA חילוץ או המדגם המקורי אפשרית רק במקרים בהם שרשרת קר יכול להישמר זמנית עד הלידה למעבדה.
בניתוח הקודם שלנו ציינו כי יחידה ניידת rRT-PCR היה סגוליות זהה (100%) רגישות דומה (98%) לבידוד הנגיף הופיע setting2 מעבדה. מחקרים אימות קודמים הראו כי נגטיבים שווא הם השגיאה הנפוצה ביותר עם rRT-PCR בגלל הפוטנציאל הגדול להכנת פסולים נוכחות, מדגם של מעכבי ה-PCR בחומר השפלה או צואה של מגיב lyophilized חרוז 1,3-4. חסרון נוסף של הטכניקה היא הרגישות של ריאגנטים lyophilized לאור זנים המתהווה של AIV. הנגיף נמצא במצב מתמיד של reshuffling גנומית מקום המארחים חפיפה, השערה נתמכת על ידי מחקרים רבים פילוגנטי 5-8. לפיכך primers ו בדיקות שהונפקו לשימוש עם ניידים rRT-PCR דורשים קבוע מחדש אימות. לדוגמה, ריאגנטים ספציפיים שושלות אמריקאי אירו של H5 ו - H7 תת מומלץ עכשיו עקב סטייה של הנגיף בהתאם לאזור biogeographic 9. כמו עם כל בדיקות שדה אחרים, שנחשדו חיוביות HPAIV צריך להיות מועבר למתקן מאושר עבור בדיקות אישור סופי עם VI עבור סגוליות גבוהה ורגישות 10.
לסיכום, מחקר זה הוכיח כי ניידים rRT-PCR מתאים לצורך ההקרנה דגימות ביוב של ציפורי בר על AIV במעבדה ללא הגדרות. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא לזרז את האבחון של ציפורי בר, להגדיל את הסיכויים של המכיל התפרצות במיקום מרוחק עם זמן תגובה מהיר יותר. Portable rRT-PCR גם מהווה פריצת דרך עבור חוקרים המבקשים לפענח את התפקיד של ציפורי בר בהפצת AIV. היכולת לאבחן מצב לארח בזמן הדגימה מאפשרת לאסוף מידע ביולוגי במטרה לענות על שאלות מפתח על התגובות החיסוניות ופיזיולוגיות 11 לזיהום, או מאפיינים גנטיים הקשורים התנגדות טבעית בעופות בר 12. יתר על כן, פריסת משדרי לוויין יקר על המארחים אישר לעקוב אחר התנועות שלהם יהיה רב ערך עבור זיהוי מינים לשמש למרחקים ארוכים נשאים של AIV כמו גם הערכת ביצועים הנדידה שלהם, העדפות בתי גידול רמות של אינטראקציה עם עופות. בדיקה תפעולית עתידיים בתחומים של דאגה בינלאומית HPAIV, כגון מרכז ודרום אסיה 13, היה חד משמעי לקבוע כיצד מהירה rRT-PCR יחידות לבצע תחת תרחישים פרוץ כאשר האבחנה של מספר גדול של דגימות חיוביות הוא זמן קריטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מבקשים להודות מ משרתים ור קריספ איידהו טכנולוגיות תמיכה טכנית המערבי USGS מרכז אקולוגי מחקר למימון (ס Schwarzbach) וסיוע (ק Spragens, ט 'גרהם). מחקר זה נערך תחת חסותו של המרכז לטכנולוגיה חדשנית - המכון לחקר הביטחון לביטחון פנים (www.idhs.org), תמיכה של משרד ההגנה ואת חיל האוויר במעבדת המחקר. טיפול בבעלי חיים בעקבות הפרוטוקולים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש הגיאולוגי בארה"ב סקר המערבי מרכז מחקר אקולוגי והיתרים של בירד בארה"ב סקר גיאולוגי banding מעבדה. כל שימוש בשמות המסחר, מוצר או חברה בפרסום זה נועד למטרות תיאורי בלבד, אינה מעידה על אישור על ידי ממשלת ארה"ב.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy mini spin column | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Collection tubes (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| RNase-free water | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| 14.3 M β-mercapt–thanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml capillary tubes | Roche Group | 04929292001 | |
| Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Pentium-based laptop with Windows XP Professional | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Lightcycler Data Analysis software | Idaho Technologies | Included in RAPID kit |
References
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y. Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents. J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).
- Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents. J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).
- Spackman, E., Suarez, D. L. Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material. Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).
- Chen, R., Holmes, E. C. Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology. , 383-3156 (2009).
- Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus. J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).
- Dugan, V. G. The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds. PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).
- Spackman, E. Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation. Virus Res. 114, 89-100 (2005).
- Pasick, J. Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections. Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).
- OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). 1, 258-269 (2004).
- Weber, T. P., Stilianakis, N. I. Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).
- Kim, J. -K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. Ducks: the "Trojan Horses" of H5N1 influenza. Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).
- Gilbert, M. Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl. Ecohealth. , (2010).
