Summary
Cette étude décrit le diagnostic de la grippe aviaire chez les oiseaux sauvages en utilisant un portable RT-PCR système. La méthode tire parti des réactifs lyophilisés à l'écran les oiseaux sauvages dans un cadre non-laboratoire, typique d'un scénario d'épidémie. L'utilisation d'outils moléculaires fournit des solutions de rechange précise et sensible pour le diagnostic rapide.
Abstract
Les oiseaux sauvages ont été impliqués dans la propagation de l'influenza aviaire hautement pathogène (IAHP) de sous-type H5N1, ce qui incite de surveillance le long des voies migratoires. L'échantillonnage des oiseaux sauvages du virus de la grippe aviaire (AIV) est souvent menée dans des régions éloignées, mais les résultats sont souvent retardées en raison de la nécessité de transporter les échantillons à un laboratoire équipé pour des tests moléculaires. En temps réel de la transcriptase inverse de la chaîne par polymérase (RT-PCR) est une technique moléculaire qui offre l'une des méthodes les plus précises et sensibles pour le diagnostic de l'AIV. Les protocoles de laboratoire préalablement strict nécessaire pour la RT-PCR sont maintenant adaptés pour le champ. Développement de réactifs lyophilisés (lyophilisé) qui ne nécessitent pas la chaîne du froid, avec une sensibilité au niveau des réactifs humide a amené les tests sur site distant à un but pratique.
Nous présentons ici une méthode pour le diagnostic rapide de l'AIV chez les oiseaux sauvages en utilisant une unité de RT-PCR (Ruggedized avancée des périphériques d'identification des agents pathogènes ou rapide, des technologies de l'Idaho, de Salt Lake City, UT) qui emploie des réactifs lyophilisés (grippe A Cible 1 Taqman; Asay -ASY-0109, Technologies Idaho). Les réactifs contiennent tous les composants nécessaires pour les tests à des concentrations appropriées dans un seul tube: amorces, des sondes, des enzymes, les tampons et les contrôles internes positifs, éliminant les erreurs liées à un mauvais entreposage ou la manipulation de réactifs humide. L'unité portable effectue un écran pour la grippe A en ciblant le gène de la matrice et donne des résultats en 2-3 heures. Sous-typage génétique est également possible avec un apprêt H5 et H7 jeux qui ciblent le gène hémagglutinine.
Le système est adapté pour une utilisation sur des échantillons cloacaux et oropharyngée prélevés sur des oiseaux sauvages, comme l'a montré ici sur les espèces de limicoles migrateurs, le bécasseau d'Alaska (Calidrus mauri) capturé en Californie du Nord. La manipulation des animaux suivis protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et de l'utilisation de l'US Geological Survey Western Centre de recherche écologique et permet de l'Oiseau US Geological Survey Banding Laboratory. Le principal avantage de cette technique est d'accélérer le diagnostic des oiseaux sauvages, ce qui augmente les chances de contenir une épidémie dans un endroit éloigné. Diagnostic sur site serait également s'avérer utile pour identifier et étudier les individus infectés dans les populations sauvages. La possibilité de collecter des informations sur la biologie hôte (réponse immunologique et physiologique à l'infection) et de l'écologie spatiale (performance migratoires des oiseaux infectés) fourniront un aperçu de la mesure dans laquelle les oiseaux sauvages peuvent agir comme des vecteurs de l'AIV sur de longues distances.
Protocol
1. Capture d'oiseaux sauvages au moyen de filets brouillard
- Pour la capture d'oiseaux de rivage, mis en place des filets de brume à un site actif butinage, comme un marais, le littoral, ou de la boue à plat.
- Glissez trémails ligne de boucles d'un bout du filet autour du pôle et insérez pole verticalement dans la boue.
- Étends net, insérez le deuxième pôle à travers les boucles trémails à l'autre extrémité du filet de brume et verticalement, insérez poteau dans la boue, en s'assurant que les lignes trémails sont enseignées.
- Une fois qu'un oiseau est capturé, extrait de l'oiseau du filet et revenir à la station de baguage.
2. Cloacaux tige d'échantillonnage
- Recueillir des écouvillons cloacaux immédiatement après sa capture
- Localisez le cloaque et l'utilisation des doigts pour repousser plumes entourant
- Déballer une Dacron ou stériles polyester-tige, tige première extrémité, et humidifier le bout avec les milieux stériles de transport viral pour une plus grande aisance dans pistonnage. Après humidification, toute la tête de l'écouvillon est délicatement inséré dans le cloaque. Nettoyer la circonférence intérieure du cloaque par le virevoltant l'écouvillon lentement et enlever la tige du cloaque.
- Insertion de la pointe de tige directement dans le flacon d'échantillon de transport viral médias; tourner la tige de l'écouvillon entre le pouce et l'index tandis que la tige est dans les médias. Vous avez un assistant de terminer la procédure en tirant le bout de l'arrière-tige au fond de la fiole ~ 1 cm et couper la tige de la tige avec une paire de ciseaux pour la pointe tige reste dans le flacon et l'arbre ne pas interférer avec bouchon de fermeture. Flacon bouchon. Désinfecter les ciseaux avec de l'alcool dans les arbres de coupe entre le coton-tige.
- Placer les flacons dans une boîte de congélation contenant soit de la glace sèche ou de la glace.
3. Oropharyngée prélèvement tige
- Ouvrez doucement le bec de l'oiseau de sorte que la fente est visible choanes
- Déballer un écouvillon propre à partir de l'emballage, la tige première extrémité, et humidifier le bout avec les médias de transport viral pour une plus grande aisance dans écouvillonnage
- Sans toucher la pointe d'autres surfaces, l'insérer dans la bouche et nettoyer l'ouverture des choanes sur le toit de la bouche et continuer en direction de la région oropharyngée ou de la gorge
- Placez l'extrémité tige directement dans le transport des médias flacon virale. Tournez la tige de l'écouvillon entre le pouce et l'index tandis que la tige est dans les médias. Comme ci-dessus, un assistant tirez la pointe de l'arrière-tige au fond de la fiole ~ 1 cm et couper la tige de la tige avec une paire de ciseaux pour la pointe tige reste dans le flacon et l'arbre n'interfère pas avec le chapeau fermeture. Flacon bouchon. Désinfecter les ciseaux avec de l'alcool dans les arbres de coupe entre le coton-tige.
- Placer les flacons dans une boîte de congélation contenant de la glace sèche ou de la glace.
4. La manipulation d'oiseaux et la libération
- Retour des oiseaux sur le site de capture et de libération dans les meilleurs délais (<20min). Gestionnaires doivent être conscients des principes de protection des animaux et être attentifs aux signes de la souffrance des oiseaux lors de l'échantillonnage (c.-à-abrasions, la capture et la myopathie hypo-ou hyperthermie). Une trousse de premiers soins devraient être inclus dans la liste des équipements.
5. Installations d'essai
- Les échantillons peuvent être testés dans un espace confiné comme une remorque de recherche ou d'une tente, avec une alimentation électrique (générateur de tension régulée) pour faire fonctionner l'appareil PCR et l'ordinateur relié.
6. Extraction de l'ARN
- L'extraction d'ARN a été réalisée avec le kit RNeasy Mini avec des modifications mineures aux instructions du fabricant suivantes Spackman et al. 1
- Vortex, le support écouvillon pour 3-5 s et de transfert 350 pi à un microtube de 2 ml. Remarque: Conservez l'échantillon restant sur la glace en cas de PCR positive des échantillons doivent être recriblés H5 ou test doit être exécuté.
- Ajouter 350 pi de tampon RLT (avec β-moi) et vortex pendant 5 s.
- Ajouter 350 ul d'ARN 70% d'éthanol de grade.
- Centrifuger à 5000 xg pendant 5 min.
- Ajouter 600 ul du surnageant dans une colonne spin placé dans un tube collecteur de 2 ml. Conserver l'échantillon restant dans le portoir.
- Centrifuger pendant 20 s à 10 000 xg et jetez accréditives.
- Répétez les étapes 17 à 18 jusqu'à ce que tous l'échantillon a été passé à travers la colonne.
- Placer la colonne spin dans un tube collecteur de 2 ml.
- Ajouter 700 ul de tampon RW1 à la colonne et centrifuger 25 s à 10 000 x g. Jeter l'effluent à travers.
- Ajouter 500 ul de tampon RPE à la colonne et centrifuger pendant 25 s à 10 000 x g. Jeter l'effluent à travers.
- Répétez l'étape 22 pour un total de deux lavages avec le tampon RPE.
- Centrifuger la colonne de spin pour un supplément de 2 minutes à 14000 x g. Jeter le tube collecteur.
- Placer la colonne spin dans un endroit propre microtube 1,5 ml et ajouter 50 pl d'eau sans nucléase. Incuber à température ambiante pendant 60 s.
- Eluer ARN en faisant tourner pendant 60 s à 10 000 xGFou 60 s. Placer l'échantillon sur la glace purifiée.
7. Préparation des contrôles négatifs
- Réactifs lyophilisés ont été préparés pour utilisation dans le dosage par PCR selon les instructions de l'Idaho Technologies lyophilisées kit de détection Réactif pour TaqMan Sondes grippe A Objectif 1 (Asay-ASY-0109).
- Centrifugeuse négative flacon de réactif de contrôle (rouge) pendant 3 s pour assurer granulés sont à la base.
- Enlever le capuchon, visuellement faire des boulettes que sont à la base.
- Ajouter 20 ul de tampon de reconstitution 2 X et 20 ul d'eau de qualité réactive.
- Récapitulation et vortex pendant 5 s à vitesse maximale.
- Centrifuger pendant 3 s pour apporter de liquide au fond du flacon.
- Vérifier visuellement le culot a réhydraté, si ce n'est répéter les étapes 31-32.
- Pipeter 19 ul du mélange hydraté dans un tube capillaire Lightcycler, répétez l'étape pipette dans un tube capillaire secondes pour obtenir un duplicata.
8. Échantillons Préparation
- Centrifugeuse flacon de réactif inconnu (bleu) pendant 3 secondes afin d'assurer les granulés sont à la base.
- Enlever le capuchon, visuellement faire des boulettes que sont à la base.
- Ajouter 40 ul d'ARN purifié.
- Récapitulation et vortex pendant 5 s à vitesse maximale.
- Centrifuger pendant 3 s pour apporter de liquide au fond du flacon.
- Vérifier visuellement le culot a réhydraté, si ce n'est répéter les étapes 38-39.
- Pipeter 19 ul de mélange hydraté dans un tube capillaire Lightcycler, répétez l'étape pipette dans un tube capillaire secondes pour obtenir un duplicata.
9. Préparation des contrôles positifs
- Centrifuger le flacon de contrôle positif réactif (vert) pendant 3 s pour assurer les granulés sont à la base.
- Enlever le capuchon, visuellement faire des boulettes que sont à la base.
- Ajouter 20 ul de tampon de reconstitution 2 X et 20 ul d'eau de qualité réactive.
- Récapitulation et vortex pendant 5 s à vitesse maximale.
- Centrifuger pendant 3 s pour apporter de liquide au fond du flacon.
- Vérifier visuellement le culot a réhydraté, si ce n'est répéter les étapes 45-46.
- Pipeter 19 ul du mélange hydraté dans un tube capillaire Lightcycler, répétez l'étape pipette dans un tube capillaire secondes pour obtenir un duplicata.
10. La centrifugation des tubes capillaires
- Une fois que tous les tubes capillaires pour le lot ont été préparés les charger dans le mini-centrifugeuse équipée d'adaptateurs capillaire.
- Centrifuger à réglage le plus bas en maintenant le bouton d'impulsion vers le bas pour 1 s. Ce transfert de liquide vers le bas en préparation pour les tests.
11. Fonctionnement du RAPID
- Créez un nouveau fichier. Contrôle Label positif, témoin négatif, et des échantillons (par leur numéro d'identification).
- Programme 1: Préparation des échantillons d'ARN Tenir
- Cycles = 1
- Mode d'analyse = Aucun
- Température cible = 40
- = Temps d'incubation 30 min
- Taux de transition de température = 20 ° C / s (par défaut)
- Température cible secondaire = 0 (par défaut)
- Taille étape = 0 (par défaut)
- Retard étape = 0 (par défaut)
- Mode d'acquisition = Aucun (par défaut)
- Programme 2: ARN Dénaturation
- Cycles = 1
- Mode d'analyse = Aucun
- Température cible = 94
- = Temps d'incubation 120s
- Taux de transition de température = 20 ° C / s (par défaut)
- Température cible secondaire = 0 (par défaut)
- Taille étape = 0 (par défaut)
- Retard étape = 0 (par défaut)
- Mode d'acquisition = Aucun (par défaut)
- Programme 3: amplification de l'ARN
- Cycles = 45
- Mode d'analyse Analyse automatique =
- Température cible, le segment 1 = 94; Segment 2 = 60
- Temps d'incubation, Segment 1 = 0 s, Segment 2 = 20 s
- Taux de transition de température, Seg 1 & 2 = 20 ° C / s (par défaut)
- Température cible secondaire, Seg 1 & 2 = 0 (par défaut)
- Taille étape, Seg 1 & 2 = 0 (par défaut)
- Retard étape, Seg 1 & 2 = 0 (par défaut)
- Mode d'acquisition, le segment 1 = Aucun; Segment 2 = simple
- Paramètres de fluorescence
- Mode d'affichage: le canal de fluorescence 2 (Ch2 / 1)
Les gains:- Ch. 1 (F1) = 1
- Ch. 2 (F2) = 8
- Ch. 3 (F3) = 1
- Pour afficher les données en temps réel par fluorescence pour chaque échantillon, sélectionner l'échantillon d'intérêt et de cliquer sur le bouton «Afficher le graphique» au bas de l'écran
- Mode d'affichage: le canal de fluorescence 2 (Ch2 / 1)
- Pour chaque capillaire, les résultats sont les suivants:
- # - Identifie la position du carrousel carrousel
- Nom de l'échantillon - fournit le nom de l'échantillon
- Contrôle - identifie également le type d'échantillon pour chaque échantillon
- Score - calculée en utilisant la relation entre la fluorescence de l'échantillon et le niveau de fluorescence de fond dans l'échantillon
- Résultat - affiche le résultat global de l'échantillon
12. Les résultats représentatifs:
Présent: Un rouge «présent» appel à un test / échantillon inconnu indique que la cible a été identifié dans l'échantillon et les contrôles ont été réussies.Non détecté: «non détecté» Un vert appel à un test / échantillon inconnu indique que la cible n'a pas été identifié dans l'échantillon et les contrôles d'essai ont été réussies.
S'il vous plaît répéter: Un «s'il vous plaît répétez 'indique que le contrôle positif ou négatif échoué.
Un exemple d'une analyse réussie par le 7200 RAPID est montré dans la figure 4. Le contrôle positif est amplifié et génère fluorescence détectable (axe Y) à environ 25 cycles (axe x). Un cycle seuil (CT)> 35 est le seuil accepté pour la plupart des laboratoires de référence VIA. Par conséquent, les contrôles positifs à cette méthode produit un signal fluorescent dans le nombre de cycles acceptée (0-35) pour la détection de l'AIV. En revanche, le contrôle négatif ne génère pas un signal fluorescent, même après 45 cycles. De même, les douze échantillons prélevés dans les bécasseaux l'Ouest n'ont pas de générer un signal fluorescent indiquant que les oiseaux ont été négatifs pour l'AIV. Des tests de suivi de tous les échantillons positifs dans un laboratoire traditionnel est encouragé à veiller à ce qu'aucun faux positifs sont produites par erreur.
Figure 1. Capture d'oiseaux de rivage en utilisant filets.
Figure 2. Collecte d'échantillons cloacaux et de l'oropharynx de moins bécasseaux.
Figure 3. Programmation du 7200 RAPIDE pour l'amplification de l'ARN.
Figure 4. Fluorogram générés par le RAPID 7200 portables rRT-PCR montrant comment les contrôles positifs et négatifs devraient apparaître dans un essai réussi. Cliquez ici pour voir l'image pleine grandeur
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Discussion
La méthode de diagnostic rapide facilite les tests présentés ici de temps précis et efficace des échantillons d'oiseaux sauvages pour la surveillance de l'AIV. Les exigences beaucoup moins strictes de stockage portables spécimen de RT-PCR sont adaptés à des situations isolées où le maintien d'une chaîne du froid peut être impraticable si les expéditeurs azote liquide ou de glace sèche n'est pas disponible. De plus, nous avons constaté que l'analyse de l'échantillon avec les réactifs lyophilisés a été assez simples pour être effectuées par des biologistes de terrain avec une connaissance minimale du laboratoire des analyses moléculaires. La technique était temps-efficace et aussi rentable. Avec un seul opérateur, il était possible d'exécuter trois lots, résultant en 42 projections pour AIV chaque jour dans un décor sur le terrain. Nous avons évalué que tous les matériaux nécessaires pour faire fonctionner ce système pourrait être amené à n'importe quel endroit et à la méthodologie pourrait être enseigné à un opérateur au cours d'une journée. Le facteur limitant dans les situations de terrain à distance est l'alimentation nécessaire pour faire fonctionner le portable rRT-PCR unité et l'ordinateur relié, mais cela peut être atténuée par l'utilisation d'une tension régulée génératrice portative électrique. En outre, le séquençage de l'ARN extrait ou de l'échantillon initial n'est possible que dans les cas où la chaîne du froid peut être temporairement maintenues jusqu'à la livraison au laboratoire.
Notre analyse précédente indique que le portable rRT-PCR unité avait une spécificité identique (100%) et une sensibilité comparable (98%) pour l'isolement du virus effectué dans un laboratoire de setting2. Études de validation antérieures ont démontré que les faux négatifs sont l'erreur la plus commune avec RT-PCR en raison du potentiel important pour la préparation des échantillons incorrecte, présence d'inhibiteurs de PCR dans les matières fécales ou de la dégradation du réactif lyophilisé perles 1,3-4. Une autre lacune de la technique est la sensibilité des réactifs lyophilisés en vue de nouvelles souches émergentes de l'AIV. Le virus est dans un état constant de remaniement génomique où les hôtes se chevauchent, une hypothèse soutenue par de nombreuses études phylogénétiques 5-8. Ainsi amorces et des sondes émis pour une utilisation avec portables rRT-PCR nécessitent constante re-validation. Par exemple, des réactifs spécifiques pour les lignées américaines et eurasiennes de l'H5 et H7 sont maintenant recommandés en raison de la divergence du virus selon les régions biogéographiques 9. Comme avec tous les essais sur le terrain d'autres, soupçonnés positifs HPAIV doivent être transportés vers une installation approuvée pour des essais de confirmation finale avec VI pour plus de spécificité et de sensibilité 10.
En conclusion, cette étude a démontré que portables rRT-PCR est adaptée à des fins de dépistage des échantillons cloacaux provenant d'oiseaux sauvages pour AIV en dehors du laboratoire paramètres. Le principal avantage de cette technique est d'accélérer le diagnostic des oiseaux sauvages, ce qui augmente les chances de contenir une épidémie dans un endroit éloigné, avec un temps de réponse plus rapide. Portable rRT-PCR représente également une percée pour les chercheurs qui cherchent à démêler le rôle des oiseaux sauvages dans la propagation de l'AIV. La capacité à diagnostiquer l'état d'accueil au moment de l'échantillonnage permet de recueillir des informations biologiques pour répondre aux questions clés sur les réponses immunologiques et physiologiques 11 à l'infection, ou les caractéristiques génétiques associées à une résistance naturelle chez les oiseaux sauvages 12. Par ailleurs, le déploiement d'émetteurs satellitaires coûteuses sur des hôtes confirmés de suivre leurs mouvements serait inestimable pour identifier les espèces qui agissent comme opérateurs longue distance de l'AIV ainsi que d'évaluer leur performance migrateurs, les préférences d'habitat et les niveaux d'interaction avec les volailles. Future essais opérationnels dans les domaines de préoccupation internationale pour HPAIV, telles que Centrale et l'Asie du Sud 13, serait de déterminer avec certitude combien rapide RT-PCR unités effectuer des scénarios épidémie lorsque le diagnostic d'un grand nombre d'échantillons positifs est temps critique.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier M. Scullion et R. Crisp des Technologies de l'Idaho pour le soutien technique et le Centre de recherche écologique USGS occidentaux pour le financement (S. Schwarzbach) et l'assistance (K. Spragens, T. Graham). Cette recherche a été réalisée sous les auspices du Centre pour la technologie innovatrice - Institut pour la Défense et la Sécurité intérieure (www.idhs.org), à l'appui du ministère de la Défense et Air Force Research Laboratory. La manipulation des animaux suivis protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux et de l'utilisation de l'US Geological Survey Western Centre de recherche écologique et permet de l'Oiseau US Geological Survey Banding Laboratory. Toute utilisation des appellations commerciales, des produits, ou de l'entreprise dans cette publication est à des fins descriptives et n'implique pas l'approbation par le gouvernement américain.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy mini spin column | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Collection tubes (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| RNase-free water | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| 14.3 M β-mercapt–thanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml capillary tubes | Roche Group | 04929292001 | |
| Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Pentium-based laptop with Windows XP Professional | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Lightcycler Data Analysis software | Idaho Technologies | Included in RAPID kit |
References
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