Summary
توضح هذه الدراسة تشخيص أنفلونزا الطيور في الطيور البرية المحمولة باستخدام RRT - PCR النظام. الأسلوب يستفيد من تجميد المجفف الكواشف لفحص الطيور البرية في وضع غير مختبر ، نموذجية من سيناريو الفاشية. استخدام الأدوات الجزيئية يوفر بدائل دقيقة وحساسة للتشخيص السريع.
Abstract
وقد تسببت الطيور البرية في انتشار أنفلونزا الطيور عالية الإمراض (HPAI) من سلالة H5N1 ، مما دفع المراقبة على طول مسارات طيران المهاجرة. غالبا ما يجري أخذ عينات من الطيور البرية لفيروس انفلونزا الطيور (AIV) في المناطق النائية ، ولكن النتائج غالبا ما تتأخر بسبب الحاجة لنقل العينات الى مختبر مجهز لاختبار الجزيئية. في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة العكسية الناسخ (RRT - PCR) هي تقنية الجزيئية التي يقدم واحدة من الأساليب الأكثر دقة وحساسية لتشخيص AIV. هي الآن بروتوكولات صارمة من قبل المختبر اللازمة لRRT - PCR يجري تكييفها للحقل. وأدى تطوير كواشف تجميد المجفف (مجفف بالتجميد) التي لا تتطلب سلسلة التبريد ، مع حساسية على مستوى الكواشف الرطب على موقع الاختبار بعيد إلى هدف عملي.
هنا نقدم طريقة للتشخيص السريع للAIV في الطيور البرية باستخدام وحدة RRT - PCR (جهاز صدمات القوية المتقدمة تحديد مسببات الأمراض أو السريع ، وايداهو تكنولوجيز ، سولت لايك سيتي ، UT) التي توظف الكواشف مجفف بالتجميد (الأنفلونزا من الهدف 1 Taqman ؛ الاساي ASY - 0109 - ، ايداهو تكنولوجيز). الكواشف تحتوي على كافة المكونات الضرورية لاختبار بتركيزات مناسبة في أنبوب واحد : الاشعال ، وتحقيقات ، والإنزيمات ، ومخازن والضوابط الإيجابية الداخلية ، والقضاء على الأخطاء المرتبطة التخزين غير لائق أو التعامل مع الكواشف الرطب. وحدة محمولة ينفذ الشاشة لمكافحة الأنفلونزا من خلال استهداف الجينات مصفوفة وتعطي نتائج في غضون 2-3 ساعات. التصنيف الفرعي الوراثية من الممكن أيضا مع التمهيدي H5 و H7 مجموعات التي تستهدف الجين راصة دموية.
هذا النظام هو مناسب للاستخدام على عينات جمعت المذرقية والفم والبلعوم من الطيور البرية ، كما يتضح هنا على الأنواع المهاجرة shorebird ، والطيطوي الغربية (Calidrus ماوري) اعتقل في ولاية كاليفورنيا الشمالية. ثم التعامل مع الحيوانات البروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان واستخدام الولايات المتحدة للمسح الجيولوجي الغربية مركز البحوث البيئية وتصاريح من الهيئة الامريكية للمسح الجيولوجي الطيور مختبر التطويق. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو تسريع التشخيص من الطيور البرية ، وزيادة فرص احتواء تفشي هذا المرض في مكان بعيد. وعلى موقع التشخيص يكون مفيدا أيضا لتحديد ودراسة الأشخاص المصابين في الأنواع البرية. سيكون فرصة لجمع المعلومات عن الأحياء المضيف (الاستجابة المناعية والفسيولوجية للإصابة) ، والبيئة المكانية (أداء المهاجرة من الطيور المصابة) توفير نظرة ثاقبة على مدى الطيور البرية يمكن أن تكون بمثابة موجهات لAIV لمسافات طويلة.
Protocol
1. الطيور البرية التقاط باستخدام الشباك الضباب
- لالتقاط shorebird ، وإنشاء شبكات في ضباب موقعا نشطا العلف مثل المستنقعات ، الشاطئ ، أو الطين المسطحة.
- المثلثة الشريحة من خط حلقات واحدة من نهاية صافي الضباب حول القطب والقطب إدراج عموديا في الوحل.
- تمتد الصافية ، القطب الثاني من خلال إدراج حلقات المثلثة في الطرف الآخر من صافي الضباب وإدراج عموديا قطب في الوحل ، والتأكد من أن يتم تدريسها للخطوط المثلثة.
- حالما يتم القبض على الطيور ، واستخراج الطيور من الشبكة والعودة الى المحطة النطاقات.
2. المسحة المذرقية أخذ العينات
- جمع مسحات المذرقية مباشرة بعد التقاط
- تحديد موقع مجرور واستخدام الأصابع لابعاد المحيطة الريش
- بسط a الداكرون أو بوليستر معقمة ذات الرؤوس المسحة ، الجذعية نهاية الأول ، ويبلل طرف العقيمة مع وسائل الاعلام عن نقل الفيروس بسهولة أكبر في ينظف. بعد تبليل ، يتم إدراج برفق الرأس كله من المسحة في مجرور. محيط مسحة من داخل مجرور بواسطة التدوير ببطء وإزالة المسحة مسحة من مجرور.
- إدراج غيض مسحة مباشرة في قارورة نقل عينة فيروسية وسائل الإعلام ؛ تدوير رمح المسحة بين الإبهام والسبابة بينما المسحة في وسائل الإعلام. لديك مساعد إكمال الإجراء عن طريق سحب غيض من الظهر مسحة من الجزء السفلي من القارورة ~ 1 سم وقطع رمح المسحة مع زوج من مقص ذلك غيض المسحة يبقى في قارورة ورمح لا تتداخل مع إغلاق الغطاء. غطاء القنينة بإحكام. تطهير المقص مع الكحول بين عدة قطاعات في مهاوي المسحة.
- ضع قارورة في الثلاجة مربع تحتوي اما الثلج الجاف أو كمادات الثلج.
3. البلعوم مسحة أخذ العينات
- فتح منقار الطائر بلطف بحيث الشق منعري مرئيا
- بسط مسحة نظيفة من الحزمة ، الجذعية نهاية الأول ، ويبلل طرف مع وسائل الاعلام عن نقل الفيروس بسهولة أكبر في ينظف
- دون لمس أي تلميح إلى السطوح الأخرى ، وأدخله في الفم والمسحة افتتاح منعري على سقف الفم ويستمر مرة أخرى نحو منطقة البلعوم أو الحنجرة
- مكان غيض مسحة مباشرة في قارورة نقل وسائل الاعلام الفيروسية. تدوير رمح المسحة بين الإبهام والسبابة بينما المسحة في وسائل الإعلام. كما ذكر أعلاه ، لديك مساعد سحب غيض من الظهر مسحة من الجزء السفلي من القارورة ~ 1 سم وقطع رمح المسحة مع زوج من مقص ذلك غيض المسحة يبقى في قارورة ورمح لا تتداخل مع غطاء الإغلاق. غطاء القنينة بإحكام. تطهير المقص مع الكحول بين عدة قطاعات في مهاوي المسحة.
- ضع قارورة في الثلاجة مربع تحتوي على جليد جاف أو كمادات الثلج.
4. تداول الطيور والإفراج
- عودة الطيور الى موقع اعتقال والافراج عنه في الوقت المناسب (<20mins). وينبغي أن يكون على بينة من معالجات لمبادئ الرفق بالحيوان ، ويكون في حالة تأهب لعلامات الطيور معاناة أثناء أخذ العينات (أي سحجات ، والتقاط عضلي وقصور أو ارتفاع الحرارة). وينبغي أن يدرج الإسعافات الأولية الأساسية في قائمة المعدات.
5. مرافق الاختبار
- ويمكن اختبار عينات في أي مكان مغلق مثل البحوث أو مقطورة خيمة ، مع امدادات الطاقة (الجهد التنظيم مولد للطاقة) لتشغيل وحدة PCR وجهاز كمبيوتر مربوط.
6. استخراج الحمض النووي الريبي
- أجري استخراج الحمض النووي الريبي مع طقم ميني RNeasy مع تعديلات طفيفة لتعليمات الشركة الصانعة التالية Spackman آخرون 1
- دوامة المتوسط مسحة لمدة 3-5 ق ونقل 350 ميكرولتر لأنبوب microcentrifuge 2 مل. ملاحظة : حافظ على ما تبقى العينة على الجليد في حالة PCR إيجابية العينات تحتاج إلى rescreened H5 أو اختبار يحتاج إلى تشغيل.
- إضافة 350 ميكرولتر من RLT العازلة (مع لي ، β) ودوامة لمدة 5 ثانية.
- إضافة 350 ميكرولتر من الايثانول الصف RNA 70 ٪.
- الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 5 دقائق.
- إضافة 600 ميكرولتر من طاف على عمود الدوران وضعت في أنبوب جمع 2 مل. تحتفظ العينة المتبقية في رفوف أنبوب اختبار.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 ثانية في XG 10000 والمرتجع من خلال تدفق.
- كرر الخطوات من 17-18 حتى يتم تمرير كافة العينة من خلال عمود الدوران.
- العمود تدور في مكان نظيف 2 أنبوب جمع مل.
- إضافة 700 ميكرولتر من RW1 العازلة إلى العمود وتدور أجهزة الطرد المركزي في 25 ق ز س 10000 تجاهل التدفق من خلال.
- إضافة 500 العازلة RPE ميكرولتر إلى العمود وتدور أجهزة الطرد المركزي لمدة 25 ثانية في ز س 10000 تجاهل التدفق من خلال.
- كرر الخطوة 22 لمجموعه اثنين من يغسل مع العازلة RPE.
- الطرد المركزي عمود الدوران لدقائق إضافية في 2 ز س 14000 تجاهل أنبوب جمع.
- مكان العمود تدور في أنبوب 1.5 مل نظيف وإضافة microcentrifuge 50μl nuclease خالية من المياه. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 ثانية.
- أزل الحمض النووي الريبي من خلال الدوران لمدة 60 ثانية في xgf 10000 أو 60 ثانية. مكان تنقية العينة على الجليد.
7. إعداد الضوابط السلبية
- وقد تم إعداد الكواشف مجفد لاستخدامها في فحص PCR وفقا لتعليمات من ايداهو تكنولوجيز تجميد المجفف الكاشف أدوات الكشف عن أنفلونزا مجسات TaqMan والهدف 1 (الاساي - ASY - 0109).
- الطرد المركزي السلبية فيال كاشف التحكم (أحمر) لمدة 3 ليالي لضمان الكريات هي في القاع.
- إزالة الغطاء ، وجعل بصريا تأكد من الكريات في القاع.
- إضافة 20 ميكرولتر العازلة إعادة إعماره من 2 س و 20 ميكرولتر الصف الكاشف المياه.
- خلاصة ودوامة لمدة 5 ليالي في أقصى سرعة.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 ليالي لجلب السائل إلى قاع القارورة.
- فحص البصر وممهى بيليه ، إن لم يكن كرر الخطوات من 31-32.
- 19 ميكرولتر ماصة للخليط رطب في أنبوب Lightcycler الشعرية ، كرر الخطوة ماصة في شعري الثاني الحصول على نسخة مكررة.
8. إعداد عينات الاختبار
- الطرد المركزي القارورة كاشف معروف (الأزرق) لمدة 3 ثوانى لضمان الكريات هي في القاع.
- إزالة الغطاء ، وجعل بصريا تأكد من الكريات في القاع.
- إضافة 40 ميكرولتر تنقيته من الحمض النووي الريبي.
- خلاصة ودوامة لمدة 5 ليالي في أقصى سرعة.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 ليالي لجلب السائل إلى قاع القارورة.
- فحص البصر وممهى بيليه ، إن لم يكن كرر الخطوات من 38-39.
- 19 ماصة ميكرولتر من خليط رطب في أنبوب Lightcycler الشعرية ، كرر الخطوة ماصة في شعري الثاني الحصول على نسخة مكررة.
9. إعداد الضوابط الإيجابية
- الطرد المركزي الكاشف مراقبة إيجابية فيال (الخضراء) لمدة 3 ليالي لضمان الكريات هي في القاع.
- إزالة الغطاء ، وجعل بصريا تأكد من الكريات في القاع.
- إضافة 20 ميكرولتر العازلة إعادة إعماره من 2 س و 20 ميكرولتر الصف الكاشف المياه.
- خلاصة ودوامة لمدة 5 ليالي في أقصى سرعة.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 ليالي لجلب السائل إلى قاع القارورة.
- فحص البصر وممهى بيليه ، إن لم يكن كرر الخطوات من 45-46.
- 19 ميكرولتر ماصة للخليط رطب في أنبوب Lightcycler الشعرية ، كرر الخطوة ماصة في شعري الثاني الحصول على نسخة مكررة.
10. أنابيب الطرد المركزي الشعرية
- مرة واحدة وقد أعدت كل من الأنابيب الشعرية للدفعة تحميلها على جهاز الطرد المركزي صغيرة مزودة محولات الشعرية.
- الطرد المركزي عند أدنى الإعداد بواسطة الضغط على زر أسفل النبض لمدة 1 ثانية. هذه التحويلات السائل إلى أسفل في التحضير للاختبار.
11. التشغيل السريع
- إنشاء ملف جديد. تحكم تسمية إيجابية ، ومراقبة سلبية ، وعينات (بواسطة رقم الهوية الخاصة بهم).
- البرنامج 1 : إعداد نموذج عقد RNA
- دورات = 1
- تحليل الوضع = بلا
- درجة الحرارة = 40 هدفا
- فترة حضانة = 30 دقيقة
- معدل درجة الحرارة الانتقالية = 20 درجة مئوية / ثانية (الافتراضي)
- الهدف الثانوي درجة الحرارة = 0 (الافتراضي)
- الخطوة الحجم = 0 (الافتراضي)
- تأخير خطوة = 0 (الافتراضي)
- اكتساب وضع = بلا (الافتراضي)
- البرنامج 2 : رنا تمسخ
- دورات = 1
- تحليل الوضع = بلا
- درجة الحرارة = 94 هدفا
- فترة حضانة = 120s
- معدل درجة الحرارة الانتقالية = 20 درجة مئوية / ثانية (الافتراضي)
- الهدف الثانوي درجة الحرارة = 0 (الافتراضي)
- الخطوة الحجم = 0 (الافتراضي)
- تأخير خطوة = 0 (الافتراضي)
- اكتساب وضع = بلا (الافتراضي)
- البرنامج 3 : رنا التضخيم
- دورات = 45
- تحليل الوضع تحليل = السيارات
- درجة الحرارة المستهدفة ، الجزء 1 = 94 ؛ الجزء 2 = 60
- فترة حضانة ، الجزء 1 = 0 ثانية ، الجزء 2 = 20 ق
- معدل انتقال الحرارة ، SEG 1 & 2 = 20 درجة مئوية / ثانية (الافتراضي)
- الهدف الثانوي درجة الحرارة ، SEG 1 & 2 = 0 (الافتراضي)
- الحجم الخطوة ، SEG 1 & 2 = 0 (الافتراضي)
- تأخير الخطوة ، SEG 1 & 2 = 0 (الافتراضي)
- وضع الاستحواذ ، الجزء 1 = لا شيء ؛ الجزء 2 = واحد
- مضان معلمات
- طريقة العرض : قناة مضان 2 (CH2 / 1)
المكاسب :- الفصل 1 (F1) = 1
- الفصل 2 (F2) = 8
- CH 3 (F3) = 1
- لعرض البيانات في الوقت الحقيقي ومضان لكل عينة ، حدد عينة من الفائدة وانقر على زر 'الرسم البياني عرض" في الجزء السفلي من الشاشة
- طريقة العرض : قناة مضان 2 (CH2 / 1)
- لكل الشعرية ، وتتضمن النتائج التالية :
- # -- يحدد موقف دائري من دائري
- اسم العينة -- يقدم اسم العينة
- السيطرة -- indentifies نوع العينة لكل عينة
- نتائج -- يحسب باستخدام العلاقة بين مضان العينة ومستوى مضان الخلفية في العينة
- النتيجة -- يعرض على النتيجة الاجمالية للعينة
12. ممثل النتائج :
> النتائج المحتملة تشمل ما يلي :
الحاضر : أحمر 'الحاضر' دعوة لاختبار / عينة مجهولة تشير إلى أنه تم تحديد الهدف في تلك العينة والضوابط كانت ناجحة.
لم يتم الكشف عن : A الخضراء "لم يتم الكشف عن" دعوة لاختبار / عينة مجهولة لا تشير إلى أنه تم تحديد الهدف في تلك العينة واختبار الضوابط كانت ناجحة.
يرجى أكرر : A 'الرجاء تكرار" يشير إلى أن السيطرة إيجابية أو سلبية فاشلة.
ويرد مثال لتحليل الناجحة التي قام بها في 7200 RAPID في الشكل 4. يتم تضخيمه لسيطرة الإيجابية ويولد مضان كشفها (المحور الصادي) في حوالي 25 دورة (محور س). عتبة دورة (CT)> 35 هو وقف انتاج المواد الانشطارية وافقت على معظم المختبرات المرجعية AIV. لذلك ، أنتجت الضوابط الإيجابية لهذا الأسلوب إشارة الفلورسنت ضمن عدد من الدورات قبلت (0-35) للكشف عن AIV. في المقابل ، فإن السيطرة السلبية لا تولد إشارة الفلورسنت حتى بعد 45 دورات. وبالمثل ، فإن العينات التي تم جمعها من twelve الطيطوي الغربية لم تولد إشارة الفلورسنت مشيرا الى ان الطيور كانت سلبية للAIV. ومما يشجع متابعة اختبار جميع العينات الايجابية في المختبر التقليدية لضمان أن يتم إنتاج أي خطأ ايجابيات كاذبة.
التقاط Shorebird الرقم 1. استخدام شبكات الضباب.
الشكل 2. المذرقية جمع العينات والفم والبلعوم من أقل الطيطوي.
الشكل 3. برمجة 7200 RAPID لتضخيم الحمض النووي الريبي.
الشكل 4. Fluorogram التي تم إنشاؤها بواسطة RAPID 7200 المحمولة RRT - PCR تبين كيف الضوابط الإيجابية والسلبية يجب أن تظهر في الفحص بنجاح. انقر هنا لعرض صورة كاملة الحجم
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة التشخيص السريع المطروحة هنا يسهل اختبار الزمن كفاءة ودقة من عينات الطيور البرية لمراقبة AIV. تخزين العينات أقل صرامة بكثير من متطلبات المحمولة RRT - PCR هي مناسبة للحالات النائية حيث الحفاظ على سلسلة التبريد قد يكون غير عملي إذا الشاحنين النتروجين السائل أو الثلج الجاف غير متوفر. بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا أن تحليل عينة مع تجميد المجفف الكواشف واضحة بما فيه الكفاية لتكون حقل البيولوجيا التي يؤديها مع الحد الأدنى من المعرفة من مختبر التحليل القائم على الجزيئي. كان الوقت تقنية ذات كفاءة وفعالية من حيث التكلفة أيضا. مع مشغل واحد ، وكان من الممكن لتشغيل ثلاث دفعات ، مما أسفر عن العروض في 42 AIV كل يوم في محيط الميدان. قمنا بتقييم أنه يمكن تقديم جميع المواد اللازمة لتشغيل هذا النظام إلى أي مكان ، ويمكن أن يدرس منهجية لعامل على مدار يوم واحد. العامل المحدد في الأوضاع الميدانية البعيد هو تزويد الطاقة المطلوبة لتشغيل المحمول RRT - PCR وحدة والكمبيوتر المرفق ، ولكن يمكن التخفيف من هذا عن طريق استخدام الجهد التنظيم المحمولة مولد للطاقة الكهربائية. بالإضافة إلى ذلك ، تسلسل الحمض النووي الريبي أو استخراج العينة الأصلية غير ممكنة إلا في الحالات التي يمكن فيها الحفاظ على سلسلة التبريد مؤقتا لحين تسليمها للمختبر.
وأشار تحليلنا السابق ان المحمولة RRT - PCR وحدة وخصوصية مماثلة (100 ٪) وحساسية مماثلة (98 ٪) لعزل الفيروس تؤدى في setting2 المختبر. وقد أثبتت دراسات سابقة أن التحقق من صحة السلبيات كاذبة هي الخطأ الأكثر شيوعا مع RRT - PCR بسبب احتمال كبير لوجود عينة غير لائق ، وإعداد مثبطات PCR في المواد البرازية أو تدهور كاشف مجفد حبة 1،3-4. وثمة عيب آخر لهذا الأسلوب هو حساسية الكواشف مجفد في ضوء التوترات الناشئة حديثا AIV. الفيروس هو في حالة مستمرة من خلط الجينومية أينما يستضيف التداخل ، وهي الفرضية التي تدعمها العديد من دراسات النشوء والتطور 5-8. وبالتالي الاشعال وتحقيقات أصدرت للاستخدام مع المحمولة RRT - PCR ثابتة تتطلب إعادة التحقق من الصحة. على سبيل المثال ، ينصح الآن الكواشف محددة لأنساب الأمريكية والأوروبية الآسيوية H5 و H7 فرعية بسبب الاختلاف في الفيروس وفقا للمنطقة الجغرافية البيولوجية 9. وينبغي كما هو الحال مع جميع التجارب الميدانية الأخرى ، يشتبه في نقلها ايجابيات HPAIV إلى منشأة لاختبار تأكيد الموافقة النهائية مع السادس لخصوصية وحساسية أعلى 10.
في الختام ، أظهرت هذه الدراسة أن المحمول RRT - PCR هو مناسب لغرض فحص عينات من الطيور البرية المذرقية لAIV في غير مختبر الإعدادات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو تسريع التشخيص من الطيور البرية ، وزيادة فرص احتواء تفشي المرض في مكان بعيد مع وقت استجابة أسرع. محمول RRT - PCR كما يمثل اختراقا للباحثين التي تسعى لكشف دور الطيور البرية في انتشار AIV. القدرة على تشخيص حالة المضيف في وقت أخذ العينات ، يجعل من الممكن لجمع المعلومات البيولوجية لمعالجة المسائل الأساسية حول الاستجابات المناعية والفسيولوجية 11 للعدوى ، أو الخصائص الجينية المرتبطة المقاومة الطبيعية في الطيور البرية 12. وعلاوة على ذلك ، فإن نشر مرسلات الأقمار الصناعية مكلفة على المضيفين وأكد لتعقب تحركاتهم لا تقدر بثمن لتحديد الأنواع التي تكون بمثابة لمسافات طويلة حاملين AIV فضلا عن تقييم أدائهم المهاجرة ، والأفضليات الموائل ومستويات التفاعل مع الدواجن. سيكون اختبار التشغيل في المستقبل في المجالات ذات الاهتمام الدولي من أجل HPAIV ، مثل وسط وجنوب آسيا 13 ، وتحديد قاطع مدى سرعة RRT - PCR وحدات تنفيذ إطار سيناريوهات اندلاع عند تشخيص عدد كبير من العينات إيجابية الوقت الحرج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر M. R. كريسب Scullion وتكنولوجيات ايداهو للحصول على الدعم التقني والأبحاث البيئية الغربية مركز المسح الجيولوجي الأميركية للحصول على تمويل (S. Schwarzbach) والمساعدة (K. Spragens ، T. غراهام). وقد أجريت هذه الدراسة تحت رعاية مركز للتكنولوجيا المبتكرة -- معهد الدفاع والأمن الداخلي (www.idhs.org) ، وبدعم من وزارة الدفاع والطيران مختبر أبحاث سلاح. ثم التعامل مع الحيوانات البروتوكولات التي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان واستخدام الولايات المتحدة للمسح الجيولوجي الغربية مركز البحوث البيئية وتصاريح من الهيئة الامريكية للمسح الجيولوجي الطيور مختبر التطويق. أي استخدام الأسماء التجارية ، والمنتج ، أو شركة في هذا المنشور هو لأغراض وصفية فقط ولا تعبر عن تأييد من قبل الحكومة الامريكية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy mini spin column | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Collection tubes (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| RNase-free water | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| 14.3 M β-mercapt–thanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml capillary tubes | Roche Group | 04929292001 | |
| Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Pentium-based laptop with Windows XP Professional | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Lightcycler Data Analysis software | Idaho Technologies | Included in RAPID kit |
References
- Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
- Takekawa, J. Y. Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents. J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).
- Das, A., Spackman, E., Senne, D., Pedersen, J., Suarez, D. L. Development of an internal positive control for rapid diagnosis of avian influenza virus infections by real-time reverse transcription-PCR with lyophilized reagents. J Clin Microbiol. 44, 3065-3073 (2006).
- Spackman, E., Suarez, D. L. Avian influenza virus RNA extraction from tissue and swab material. Methods Mol Biol. 436, 13-18 (2008).
- Chen, R., Holmes, E. C. Frequent inter-species transmission and geographic subdivision in avian influenza viruses from wild birds. Virology. , 383-3156 (2009).
- Macken, C. A., Webby, R. J., Bruno, W. J. Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus. J Gen Virol. 87, 2803-2815 (2006).
- Dugan, V. G. The evolutionary genetics and emergence of avian influenza viruses in wild birds. PLoS Pathog.. 4, e1000076-e1000076 (2008).
- Spackman, E. Phylogenetic analyses of type A influenza genes in natural reservoir species in North America reveals genetic variation. Virus Res. 114, 89-100 (2005).
- Pasick, J. Advances in the molecular based techniques for the diagnosis and characterization of avian influenza virus infections. Transbound Emerg Dis. 55, 329-338 (2008).
- OIE Manual of diagnostics tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). 1, 258-269 (2004).
- Weber, T. P., Stilianakis, N. I. Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds. Emerg. Infect. Dis. 13, 1139-1143 (2007).
- Kim, J. -K., Negovetich, N. J., Forrest, H. L., Webster, R. G. Ducks: the "Trojan Horses" of H5N1 influenza. Influenza and Other Respiratory Viruses. , 121-128 (2009).
- Gilbert, M. Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl. Ecohealth. , (2010).
