Summary
Este estudo descreve o diagnóstico de influenza aviária em aves selvagens usando um sistema rRT-PCR portátil. O método aproveita liofilizadas reagentes para a tela aves selvagens em um ambiente não-laboratorial, típico de um cenário de surto. Uso de ferramentas moleculares oferece alternativas precisas e sensíveis para o diagnóstico rápido.
Abstract
Aves selvagens têm sido implicados na disseminação da Gripe aviária altamente patogénica (GAAP) do subtipo H5N1, o que levou a vigilância ao longo de rotas migratórias. Amostragem de aves selvagens para o vírus da gripe aviária (AIV) é muitas vezes realizado em regiões remotas, mas os resultados são muitas vezes adiada devido à necessidade de transportar amostras para um laboratório equipado para o teste molecular. Em tempo real da transcriptase reversa reação em cadeia da polimerase (PCR rRT-) é uma técnica molecular que oferece um dos métodos mais precisos e sensíveis para o diagnóstico de AIV. Os protocolos de laboratório anteriormente estritamente necessário para rRT-PCR estão sendo adaptados para o campo. Desenvolvimento de reagentes liofilizados (liofilizado) que não exigem cadeia de frio, com sensibilidade ao nível dos reagentes molhada trouxe o teste no local remoto a um objetivo prático.
Aqui apresentamos um método para o diagnóstico rápido de AIV em aves selvagens usando uma unidade rRT-PCR (Dispositivo de Identificação Ruggedized avançada de patógenos ou RAPID, Idaho Technologies, Salt Lake City, UT), que emprega reagentes liofilizados (Influenza A Meta 1 Taqman; Asay ASY-0109-, Idaho Technologies). Os reagentes contêm todos os componentes necessários para o teste em concentrações adequadas, em um único tubo: primers, sondas, enzimas, amortecedores e controles positivos internos, eliminando erros associados com o armazenamento inadequado ou manuseio de reagentes molhado. A unidade portátil executa uma tela para Influenza A, visando o gene matriz e produz resultados em 2-3 horas. Subtipagem genética também é possível com primer H5 e H7 conjuntos que visam o gene hemaglutinina.
O sistema é adequado para uso coletadas de aves selvagens, como demonstrado aqui sobre as espécies migratórias shorebird, o maçarico ocidental (Calidrus mauri) capturado no norte da Califórnia. Em amostras de cloaca e orofaringe Manuseio dos animais seguiu protocolos aprovados pelo Comitê Animal Care e Uso do Geological Survey Research Centro Oeste dos EUA e permite Ecológica do Pássaro Serviço Geológico dos EUA Banding Laboratory. A principal vantagem desta técnica é para agilizar o diagnóstico das aves selvagens, aumentando as chances de conter um surto em um local remoto. No local, o diagnóstico também ser útil para identificar e estudar os indivíduos infectados em populações selvagens. A oportunidade para coletar informações sobre a biologia do hospedeiro (resposta imunológica à infecção e fisiológicas) e ecologia espacial (performance migratória de aves infectadas) fornecerá insights sobre a medida em que as aves selvagens podem atuar como vetores para AIV a longas distâncias.
Protocol
1. Captura de aves selvagens usando redes de neblina
- Para a captura de shorebird, configurar redes de neblina em um sítio ativo de forrageamento como um pântano, costa, ou lama plana.
- Deslize linha de tresmalho loops de uma extremidade da rede de neblina em torno do pólo e inserir pole verticalmente em lama.
- Estende a net, insira segundo pólo através de loops de tresmalho na outra extremidade da rede de neblina e verticalmente inserir pole em lama, certificando-se que as linhas de tresmalho são ensinados.
- Uma vez que um pássaro é capturado, extrair o pássaro da rede e voltar para a estação de bandas.
2. Cloacal técnica swab
- Coletar swabs cloacais imediatamente após a captura
- Localize a cloaca e use os dedos para empurrar para trás as penas ao redor
- Desembalar um Dacron ou estéril com ponta de poliéster algodão, caule primeira extremidade, e umedecer a ponta com estéril meios de transporte viral para maior facilidade na raspagem. Depois de umedecimento, a cabeça inteira do swab é gentilmente inserido na cloaca. Swab circunferência no interior da cloaca, lentamente girando o cotonete e retire o swab de cloaca.
- Inserindo a ponta swab diretamente no frasco da amostra viral meios de transporte; girar o eixo do swab entre o polegar eo indicador, enquanto a mecha é na mídia. Ter um assistente concluir o procedimento puxando a ponta do cotonete de volta do fundo do frasco ~ 1 cm e corte o eixo da haste com um par de tesouras para a ponta swab permanece no frasco e no eixo não interfere com fechamento da tampa. Frasco tampa. Desinfectar a tesoura com álcool entre os eixos de corte cotonete.
- Coloque os frascos em uma caixa contendo um ou outro freezer gelo seco ou bolsas de gelo.
3. A técnica swab de orofaringe
- Abra cuidadosamente o bico do pássaro para que a fenda coanal é visível
- Desembrulhar um cotonete limpo do pacote, caule primeira extremidade, e umedecer a ponta com meios de transporte viral para maior facilidade na swabbing
- Sem tocar na ponta de quaisquer outras superfícies, insira-o na boca e swab da abertura coanal no céu da boca e continuar em direção a região da orofaringe ou da garganta
- Coloque a ponta da cotonete diretamente no frasco de meio de transporte viral. Girar o eixo do swab entre o polegar eo indicador, enquanto a mecha é na mídia. Como acima, ter um assistente puxar a ponta da haste de volta do fundo do frasco ~ 1 cm e corte o eixo da haste com um par de tesouras para a ponta swab permanece no frasco e no eixo não interfere com tampa encerramento. Frasco tampa. Desinfectar a tesoura com álcool entre os eixos de corte cotonete.
- Coloque os frascos em uma caixa freezer contendo gelo seco ou bolsas de gelo.
4. Manuseio de aves e de liberação
- Retorno das aves para o local de captura e liberação em tempo hábil (<20 minutos). Manipuladores devem estar cientes dos princípios de bem-estar animal e estar alerta para sinais de sofrimento durante a amostragem de aves (abrasões ou seja, a captura de miopatia e hipo ou hipertermia). Um kit básico de primeiros socorros deve ser incluído na lista de equipamento.
5. Instalações de teste
- Amostras podem ser testadas em qualquer espaço fechado, como um reboque de pesquisa ou tenda, com uma fonte de alimentação (tensão regulada gerador de energia) para executar a unidade de PCR e computador ligado.
6. A extração de RNA
- Extração de RNA foi realizada com o kit RNeasy Mini com pequenas modificações para as instruções do fabricante seguintes Spackman et al 1.
- Médio Vortex o cotonete para 3-5 s e transferência de 350 mL para um tubo de microcentrífuga de 2 ml. Nota: Mantenha amostra restante no gelo em caso PCR amostras positivas precisam ser submetida a novo rastreio ou teste H5 precisa ser executado.
- Adicionar 350 mL de tampão RLT (com β-me) e vortex por 5 s.
- Adicionar 350 uL de RNA de etanol de grau de 70%.
- Centrifugar a 5.000 xg por 5 min.
- Adicionar 600 mL do sobrenadante para uma coluna de spin colocado em um tubo de coleta de 2 ml. Manter a amostra restante em rack tubo de ensaio.
- Centrifugar durante 20 s em 10.000 xg e descarte por escoamento.
- Repita os passos 17-18 até que todas as amostras foi passada através da coluna spin.
- Colocar a coluna girar em um tubo de coleta limpa 2 ml.
- Adicionar 700 mL de tampão RW1 para a coluna de spin e centrifugar 25 s em 10.000 x g. Descartar o escoamento.
- Adicionar 500 mL tampão RPE para a coluna girar e centrifugar por 25 segundos a 10.000 x g. Descartar o escoamento.
- Repita o passo 22 para um total de duas lavagens com tampão RPE.
- Centrifugar a coluna girar por mais 2 minutos a 14.000 x g. Descartar tubo de coleta.
- Coloque a coluna girar em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar 50μl de água livre de nuclease. Incubar a temperatura ambiente por 60 s.
- Eluir RNA girando por 60 s em 10.000 xgfou 60 s. Lugar purificado amostra no gelo.
7. Preparando-se controles negativos
- Reagentes liofilizados foram preparados para serem utilizados no ensaio de PCR de acordo com instruções do Idaho Technologies Kit de Detecção de Freeze-Dried Reagente para TaqMan Sondas Influenza A Meta 1 (Asay-ASY-0109).
- Centrífuga frasco de reagente controle negativo (vermelho) para 3 s para garantir pelotas são na parte inferior.
- Retire a tampa, visualmente fazer pellets certeza estão na parte inferior.
- Adicionar 20 mL de Tampão de Reconstituição 2 X e 20 mL de água grau reagente.
- Recap e vortex por 5 s na velocidade máxima.
- Centrifugar por 3 s para levar líquidos para o fundo do frasco.
- Verificar visualmente o pellet foi reidratado, se não repita os passos 31-32.
- Pipetar 19 mL da mistura hidratada em um tubo capilar LightCycler, repita o passo pipeta capilar em um segundo para obter uma segunda via.
8. Preparação de amostras de teste
- Centrifugar o frasco reagente desconhecido (azul) durante 3 segundos para garantir pelotas são na parte inferior.
- Retire a tampa, visualmente fazer pellets certeza estão na parte inferior.
- Adicionar 40 mL de RNA purificado.
- Recap e vortex por 5 s na velocidade máxima.
- Centrifugar por 3 s para levar líquidos para o fundo do frasco.
- Verificar visualmente o pellet foi reidratado, se não repita os passos 38-39.
- Pipetar 19 mL da mistura hidratada em um tubo capilar LightCycler, repita o passo pipeta capilar em um segundo para obter uma segunda via.
9. Preparar controles positivos
- Centrifugar o frasco de reagente de controlo positivo (verde) para 3 s para garantir pelotas são na parte inferior.
- Retire a tampa, visualmente fazer pellets certeza estão na parte inferior.
- Adicionar 20 mL de Tampão de Reconstituição 2 X e 20 mL de água grau reagente.
- Recap e vortex por 5 s na velocidade máxima.
- Centrifugar por 3 s para levar líquidos para o fundo do frasco.
- Verificar visualmente o pellet foi reidratado, se não repita os passos 45-46.
- Pipetar 19 mL da mistura hidratada em um tubo capilar LightCycler, repita o passo pipeta capilar em um segundo para obter uma segunda via.
10. Centrifugação os tubos capilares
- Depois de todos os tubos capilares para o lote foram preparadas carregá-los no mini-centrífuga equipados com adaptadores capilar.
- Centrífuga na configuração mais baixa, segurando o botão de pulso para baixo por 1 s. Isso transfere líquido para o fundo, em preparação para o teste.
11. Operação do RAPID
- Criar um novo arquivo. Controle de rótulo positivo, controle negativo e amostras (pelo seu número de ID).
- Programa 1: Segure RNA Preparação da Amostra
- Ciclos = 1
- Modo de análise = None
- Temperatura target = 40
- Tempo de incubação = 30 min
- Taxa de transição de temperatura = 20 ° C / s (padrão)
- Alvo de temperatura secundário = 0 (default)
- Tamanho passo = 0 (default)
- Atraso passo = 0 (default)
- Modo de aquisição = Nenhum (padrão)
- Programa 2: RNA Desnaturação
- Ciclos = 1
- Modo de análise = None
- Temperatura target = 94
- Tempo de incubação = 120s
- Taxa de transição de temperatura = 20 ° C / s (padrão)
- Alvo de temperatura secundário = 0 (default)
- Tamanho passo = 0 (default)
- Atraso passo = 0 (default)
- Modo de aquisição = Nenhum (padrão)
- Programa 3: Ampliação RNA
- Ciclos = 45
- Modo de Análise de Análise de Auto =
- Temperatura-alvo, Segmento 1 = 94; Segmento 2 = 60
- Tempo de incubação, Segmento 1 = 0 s, Segmento 2 = 20 s
- Taxa de temperatura de transição, Seg 1 & 2 = 20 ° C / s (padrão)
- Alvo de temperatura secundário, Seg 1 & 2 = 0 (default)
- Tamanho passo, Seg 1 & 2 = 0 (default)
- Atraso passo, Seg 1 & 2 = 0 (default)
- Modo de aquisição, Segmento 1 = None; Segmento 2 = single
- Parâmetros de fluorescência
- Modos de Exibição: canal de fluorescência 2 (Ch2 / 1)
Ganhos:- Ch 1 (F1) = 1
- Ch 2 (F2) = 8
- Ch 3 (F3) = 1
- Para exibir os dados em tempo real de fluorescência para cada amostra, seleção da amostra de interesse e clique no botão 'Gráfico Show' na parte inferior da tela
- Modos de Exibição: canal de fluorescência 2 (Ch2 / 1)
- Para cada capilar, os resultados são os seguintes:
- # - Identifica a posição do carrossel carrossel
- Nome da amostra - fornece o nome da amostra
- Controle - indentifies o tipo de amostra para cada amostra
- Pontuação - calculada utilizando a relação entre a fluorescência da amostra e do nível de fluorescência de fundo na amostra
- Resultado - exibe o resultado global para a amostra
12. Resultados representativos:
Presente: Uma chamada de vermelha "presente" para um teste / amostra desconhecida indica que o alvo foi identificado em que a amostra e os controles foram bem sucedidos.Não detectado: Uma chamada de verde "não foi detectado" por um teste / amostra desconhecida indica que o alvo não foi identificado em que a amostra de teste e os controles foram bem sucedidos.
Por favor, repito: A 'repetir, por favor' indica que o controlo positivo ou negativo falhou.
Um exemplo de uma análise bem sucedida pelo RAPID 7200 é mostrado na Figura 4. O controle positivo é amplificada e gera fluorescência detectável (eixo y) em aproximadamente 25 ciclos (x-eixo). Um limite de ciclo (CT)> 35 é o cut-off acordado para laboratórios de referência mais AIV. Portanto, os controles positivos para este método produziu um sinal fluorescente dentro do número de ciclos aceita (0-35) para a detecção de AIV. Em contraste, o controle negativo não gera um sinal fluorescente, mesmo após 45 ciclos. Da mesma forma, os doze amostras coletadas de maçaricos ocidental não gerar um sinal fluorescente que indica que as aves foram negativos para AIV. Testes de acompanhamento de todas as amostras positivas em um laboratório tradicional é incentivado para garantir que nenhum falso positivo são erroneamente produzido.
Figura 1. Capturar Shorebird usando redes de neblina.
Figura 2. Coleta de amostras de cloaca e orofaringe de pelo maçaricos.
Figura 3. Programação do RAPID 7200 para a amplificação de RNA.
Figura 4. Fluorogram gerado pelo RAPID 7200 portátil rRT-PCR mostrando como controles positivos e negativos devem aparecer em um ensaio bem-sucedido. Clique aqui para ver a imagem de tamanho completo
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Discussion
O método de diagnóstico rápido aqui apresentados facilita os testes de tempo eficiente e preciso de amostras de aves selvagens para a vigilância de AIV. Os requisitos espécime muito menos rigorosas de armazenamento portátil de rRT-PCR são adequadas para situações remotas, onde a manutenção de uma cadeia de frio pode ser impraticável se carregadores de nitrogênio líquido ou gelo seco não está disponível. Além disso, descobrimos que a análise da amostra com os reagentes liofilizados foi suficientemente simples para ser realizada por biólogos de campo com conhecimento mínimo de laboratório baseado em análise molecular. A técnica foi tempo-eficiente e também o custo-benefício. Com um operador, foi possível executar três lotes, resultando em 42 projeções para AIV cada dia em um ambiente de campo. Avaliamos que todos os materiais necessários para executar este sistema poderia ser levado a qualquer lugar ea metodologia pode ser ensinado a um operador, ao longo de um dia. O fator limitante em situações de campo remoto é o fornecimento de energia necessária para executar a unidade rRT-PCR portátil e computador ligado, no entanto, isto pode ser mitigado através do uso de um gerador de energia de tensão regulável portátil elétrica. Além disso, o seqüenciamento do RNA extraído ou da amostra original só é possível nos casos em cadeia de frio pode ser temporariamente mantido até a entrega ao laboratório.
Nossa análise anterior indica que a unidade rRT-PCR portátil teve idêntica especificidade (100%) e sensibilidade comparáveis (98%) para isolamento do vírus realizado em um laboratório setting2. Estudos de validação anteriores demonstraram que os falsos negativos são o erro mais comum com o rRT-PCR por causa do grande potencial de imprópria presença preparação de amostras, de inibidores da PCR em material fecal ou degradação do reagente liofilizado talão 1,3-4. Outra deficiência da técnica é a sensibilidade de reagentes liofilizados em vista de cepas emergentes de AIV. O vírus está em um estado constante de reorganização genômica hosts onde se sobrepõem, uma hipótese apoiada por numerosos estudos filogenéticos 5-8. Daí primers e sondas emitidas para uso com portáteis rRT-PCR requerem constante re-validação. Por exemplo, reagentes específicos para a América e da Eurásia linhagens de subtipos H5 e H7 são agora recomendados devido à divergência do vírus de acordo com a região biogeográfica 9. Como em todos os testes de campo outros, suspeita AI de alta patogenicidade positivos devem ser transportados para uma instalação aprovada para testes de confirmação final com VI para a mais alta sensibilidade e especificidade 10.
Em conclusão, este estudo demonstrou que portáteis rRT-PCR é adequado para o propósito de triagem de amostras de cloaca de aves selvagens para AIV em laboratório não-definições. A principal vantagem desta técnica é para agilizar o diagnóstico das aves selvagens, aumentando as chances de conter um surto em um local remoto com um tempo de resposta mais rápido. Portáteis rRT-PCR também representa um avanço para os pesquisadores que procuram desvendar o papel das aves selvagens na propagação de AIV. A capacidade de diagnosticar o status de host no momento da amostragem torna possível a coleta de informações biológicas para abordar questões-chave sobre as respostas imunológicas e fisiológicas 11 a infecção, ou características genéticas associadas com resistência natural em aves selvagens 12. Além disso, a implantação de transmissores por satélite caro em hosts confirmada para rastrear seus movimentos seria inestimável para a identificação de quais as espécies atuam como operadoras de longa distância de AIV, bem como avaliar o seu desempenho migratórias, preferências de habitat e níveis de interação com aves. Testes operacionais futuros em áreas de interesse internacional para a AI de alta patogenicidade, como Central e Sul da Ásia 13, iria determinar conclusivamente a rapidez rRT-PCR unidades realizam em cenários de surto quando o diagnóstico de um grande número de amostras positivas é de tempo crítico.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Queremos agradecer Scullion M. e R. Crisp de Idaho Technologies para o suporte técnico eo USGS ocidental Centro de Pesquisa Ecológica de financiamento (S. Schwarzbach) e assistência (K. Spragens, T. Graham). Esta pesquisa foi realizada sob os auspícios do Centro para Inovação Tecnológica - Instituto de Defesa e Segurança Interna (www.idhs.org), em apoio ao Departamento de Defesa e Laboratório de Pesquisas da Força Aérea. Manuseio dos animais seguiu protocolos aprovados pelo Comitê Animal Care e Uso do Geological Survey Research Centro Oeste dos EUA e permite Ecológica do Pássaro Serviço Geológico dos EUA Banding Laboratory. Qualquer uso do comércio, produto ou empresa nomes nesta publicação é apenas para fins descritivos e não implica o endosso pelo governo dos EUA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy mini spin column | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Collection tubes (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| RNase-free water | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| 14.3 M β-mercapt–thanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml capillary tubes | Roche Group | 04929292001 | |
| Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Pentium-based laptop with Windows XP Professional | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Lightcycler Data Analysis software | Idaho Technologies | Included in RAPID kit |
References
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