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方法文章

野鸟中禽流感病毒的快速诊断：野外便携式实时逆转录聚合酶链式反应与冻干试剂的应用

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DOI：

10.3791/2829

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2011年8月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1USGS Western Ecological Research Center, 2Wildlife Health Center, University of California, Davis, 3Department of Population Health and Reproduction, University of California, Davis, 4Department of Veterinary and Biomedical Sciences, University of Minnesota , 5Science Applications International Corporation

本文内容

摘要

本研究描述了使用便携式实时逆转录聚合酶链式反应（rRT-PCR）系统对野生鸟类中的禽流感进行诊断。该方法利用冻干试剂，可在非实验室环境下对野生鸟类进行筛查，适用于疫情暴发时的典型现场情况。分子检测工具可为快速诊断提供准确且灵敏的替代方案。

摘要

野生鸟类被认为与H5N1亚型高致病性禽流感（HPAI）的传播有关，因此需在候鸟迁徙路线上开展监测。对野生鸟类进行禽流感病毒（AIV）采样通常在偏远地区进行，但由于需要将样本运送至具备分子检测条件的实验室，检测结果往往存在延迟。实时反转录聚合酶链式反应（rRT-PCR）是一种分子技术，可提供最为准确和敏感的AIV诊断方法之一。过去严格依赖实验室环境的rRT-PCR操作流程，目前正逐步适应野外现场应用。冻干（lyophilized）试剂的开发实现了无需冷链运输且灵敏度与液态试剂相当，使在偏远现场开展检测成为切实可行的目标。

本文介绍一种利用便携式实时逆转录聚合酶链式反应仪（Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device 或 RAPID，Idaho Technologies，美国犹他州盐湖城）结合冻干试剂（Influenza A Target 1 Taqman；ASAY-ASY-0109，Idaho Technologies）对野生鸟类中的禽流感病毒（AIV）进行快速诊断的方法。该试剂预混了单管中检测所需的所有组分，包括引物、探针、酶、缓冲液及内参阳性对照，且浓度适当，避免了液态试剂因储存或操作不当而引起的误差。该便携设备通过靶向基质基因对A型流感病毒进行筛查，可在2至3小时内获得结果。此外，利用靶向血凝素基因的H5和H7引物组，还可实现病毒的基因亚型鉴定。

该系统适用于检测从野生鸟类采集的泄殖腔和咽部样本，本文以在美国加利福尼亚州北部捕获的迁徙性滨鸟——西部沙锥（Calidris mauri）为例进行了演示。动物操作遵循美国地质调查局西部生态研究中心动物护理与使用委员会批准的方案，并获得美国地质调查局鸟类环志实验室的许可。该技术的主要优势在于能够加快对野生鸟类的诊断速度，从而提高在偏远地区控制疫情暴发的可能性。现场诊断还有助于识别和研究野生种群中的感染个体。获取有关宿主生物学（宿主对感染的免疫和生理反应）和空间生态学（感染鸟类的迁徙表现）的信息，将有助于深入了解野生鸟类在长距离传播禽流感病毒（AIV）方面所能发挥的媒介作用。

方案

1. 使用雾网捕捉野生鸟类

  1. 在涉禽捕获过程中，应在活跃的觅食地点（如沼泽、海岸线或泥滩）设置雾网。
  2. 将雾网一端的缠绕线环套入杆子，并将杆子垂直插入泥中。
  3. 拉直网体，将第二根杆子穿过雾网另一端的缠绕线环，并将其垂直插入泥中，确保缠绕线拉紧。
  4. 一旦鸟类被捕获，应从网中取出鸟类并返回环志工作站。

2. 泄殖腔拭子采样

  1. 捕获后立即采集泄殖腔拭子
  2. 找到泄殖腔，并用手指轻轻拨开周围的羽毛
  3. 从柄端打开无菌的 dacron 或聚酯纤维头拭子，用无菌病毒运送培养基润湿拭子头部，以便更顺利地进行采样。润湿后，将拭子头部轻轻插入泄殖腔内，缓慢旋转拭子以擦拭泄殖腔内壁，然后将拭子取出
  4. 将拭子头部直接插入病毒运送培养基样本管中，在培养基内用拇指和食指旋转拭子杆。请助手协助，将拭子头部从管底向上拉出约 1 cm，用剪刀剪断拭子杆，使拭子头部保留在管内，而杆部不会妨碍盖紧管盖。盖紧管盖。每次剪断拭子杆后，均需用酒精对剪刀进行消毒
  5. 将样本管放入含有干冰或冰袋的冷冻盒中

3. 口咽拭子采样

  1. 轻轻打开鸟喙，使腭裂可见
  2. 从包装中取出一支洁净的采样拭子，先取出杆部一端，并用病毒转运培养基润湿拭子尖端，以便更顺利地进行采样
  3. 避免拭子尖端接触其他任何表面，将其插入鸟嘴内，擦拭口腔顶部的腭裂开口，并继续向后咽部或咽喉区域移动擦拭
  4. 将拭子尖端直接放入病毒转运培养基小管中。在拭子置于培养基内时，用拇指和食指旋转拭子杆部。如前所述，请助手将拭子尖端从管底向上拉出约 1 cm，用剪刀剪断拭子杆部，使拭子尖端保留在管内，而杆部不会妨碍管盖密闭。 tightly 盖紧管盖。每次剪断拭子杆部之间，须用酒精对剪刀进行消毒。
  5. 将小管放入装有干冰或冰袋的冷冻盒中。

4. 鸟类处理与放归

  1. 将鸟类及时（<20分钟）送回捕获地点并放归。操作人员应了解动物福利的基本原则，并在采样过程中密切关注鸟类是否出现痛苦迹象（如擦伤、捕获性肌病以及低体温或高体温）。设备清单中应包含基本的急救包。

5. 测试设施

  1. 样本可在任何封闭空间（如科研拖车或帐篷）中进行检测，只需配备电源（稳压发电机）以运行PCR仪及连接的计算机。

6. RNA 提取

  1. 使用RNeasy Mini试剂盒进行RNA提取，参照Spackman的方法对生产商说明书进行了微小修改 等. 1
  2. 涡旋混匀拭子保存液3-5秒，然后转移 350 μl 加入一个2 ml的微量离心管中。注意：将剩余样品置于冰上，以防需要对PCR阳性样品重新筛查或进行H5检测。
  3. 添加 350 μl 加入RLT缓冲液（含β-巯基乙醇），涡旋振荡5秒。
  4. 添加 350 μl RNA 级 70% 乙醇
  5. 5,000 × g 离心 5 分钟
  6. 添加 600 μl 将上清液转移至置于2 ml收集管中的离心柱中。将剩余样品保留在试管架中。
  7. 在10,000 x g下离心20秒，弃去穿流液。
  8. 重复步骤17-18，直至所有样品均通过离心柱。
  9. 将离心柱放入干净的2 ml收集管中。
  10. 添加 700 μl 向离心柱中加入 RW1 缓冲液，10,000 × g 离心 25 秒。弃去穿流液。
  11. 添加 500 μl 将RPE缓冲液加入离心柱中，于10,000 × g离心25秒。弃去穿流液。
  12. 重复步骤22，使用RPE缓冲液总共洗涤两次。
  13. 在14,000 × g离心力下额外离心自旋柱2分钟。弃去收集管。
  14. 将离心柱放入一个洁净的1.5 ml微量离心管中，然后加入 50μl 加入无核酸酶水，室温孵育60秒。
  15. 以10,000 × g离心60秒，洗脱RNA。将纯化后的样品置于冰上。

7. 准备阴性对照

  1. 根据 Idaho Technologies 公司提供的 TaqMan 探针流感病毒 A 靶标 1 冻干试剂检测试剂盒（货号：ASAY-ASY-0109）说明书，准备用于 PCR 检测的冻干试剂。
  2. 将阴性对照试剂瓶（红色）离心 3 秒，确保冻干颗粒沉降至瓶底。
  3. 打开瓶盖，目视确认冻干颗粒位于瓶底。
  4. 加入 20 μl 的 2× 重悬缓冲液和 20 μl 试剂级水。
  5. 盖上瓶盖，涡旋振荡 5 秒（最大速度）。
  6. 离心 3 秒，使液体完全沉降至管底。
  7. 目视检查冻干颗粒是否已完全溶解；若未完全溶解，则重复步骤 31–32。
  8. 用移液器吸取 19 μl 已溶解的混合液加入 LightCycler 毛细管中，重复移液操作至第二根毛细管以获得重复样本。

8. 准备测试样品

  1. 将未知试剂管（蓝色）离心 3 秒，确保沉淀物位于管底。
  2. 打开管盖，目视确认沉淀物已位于管底。
  3. 加入 40 μl 纯化的 RNA。
  4. 盖上管盖，涡旋振荡 5 秒，速度调至最高。
  5. 离心 3 秒，使液体沉降至管底。
  6. 目视检查沉淀物是否已充分重悬，若未完全重悬，则重复步骤 38–39。
  7. 用移液器吸取 19 μl 重悬后的混合液至 Lightcycler 毛细管中，并对第二根毛细管重复该移液步骤，以获得重复样本。

9. 准备阳性对照

  1. 将阳性对照试剂管（绿色）离心 3 秒，确保沉淀物位于管底。
  2. 取下管盖，目视确认沉淀物已位于管底。
  3. 加入 20 μl 的 2 X 重悬缓冲液和 20 μl 试剂级水。
  4. 重新盖上管盖，并以最大速度涡旋振荡 5 秒。
  5. 离心 3 秒，使液体沉降至管底。
  6. 目视检查沉淀物是否已充分重悬，若未完全重悬，则重复步骤 45–46。
  7. 用移液器吸取 19 μl 重悬后的混合液至 Lightcycler 毛细管中，重复移液操作至第二根毛细管中以获得重复样本。

10. 离心毛细管

  1. 将本批次所需的所有毛细管准备好后，将其装入配备毛细管适配器的迷你离心机中。
  2. 按下脉冲按钮并保持1秒，以最低转速离心。此步骤将液体转移至管底，以备检测使用。

11. 操作 RAPID

  1. 创建一个新文件。标记阳性对照、阴性对照和样品（按其编号）。
  2. 程序 1：RNA 样品制备保温
    1. 循环次数 = 1
    2. 分析模式 = 无
    3. 目标温度 = 40
    4. 孵育时间 = 30 分钟
    5. 温度升速率 = 20°C/s（默认）
    6. 次级温度目标 = 0（默认）
    7. 步长 = 0（默认）
    8. 步延迟 = 0（默认）
    9. 采集模式 = 无（默认）
  3. 程序 2：RNA 变性
    1. 循环次数 = 1
    2. 分析模式 = 无
    3. 目标温度 = 94
    4. 孵育时间 = 120 秒
    5. 温度升速率 = 20°C/s（默认）
    6. 次级温度目标 = 0（默认）
    7. 步长 = 0（默认）
    8. 步延迟 = 0（默认）
    9. 采集模式 = 无（默认）
  4. 程序 3：RNA 扩增
    1. 循环次数 = 45
    2. 分析模式 = 自动分析
    3. 目标温度，第 1 段 = 94；第 2 段 = 60
    4. 孵育时间，第 1 段 = 0 秒，第 2 段 = 20 秒
    5. 温度升速率，第 1 和第 2 段 = 20°C/s（默认）
    6. 次级温度目标，第 1 和第 2 段 = 0（默认）
    7. 步长，第 1 和第 2 段 = 0（默认）
    8. 步延迟，第 1 和第 2 段 = 0（默认）
    9. 采集模式，第 1 段 = 无；第 2 段 = 单次
  5. 荧光参数
    1. 显示模式：荧光通道 2（Ch2/1）
      增益：
      1. 通道 1 (F1) = 1
      2. 通道 2 (F2) = 8
      3. 通道 3 (F3) = 1
    2. 要显示每个样品的实时荧光数据，请选择感兴趣的样品，然后点击屏幕底部的“显示图表”按钮
  6. 对于每根毛细管，结果包括以下内容：
    • # —— 标识样品在转盘中的位置
    • 样品名称 —— 提供样品的名称
    • 对照 —— 标识每个样品的样品类型
    • 评分 —— 根据样品荧光强度与背景荧光水平之间的关系计算得出
    • 结果 —— 显示样品的总体结果

12. 典型结果：

可能的结果包括以下情况：
检出：测试/未知样本显示红色“检出”结果，表示在该样本中检测到目标物，且对照实验成功。
未检出：测试/未知样本显示绿色“未检出”结果，表示在该样本中未检测到目标物，且检测对照实验成功。
请重做：“请重做”提示表示阳性或阴性对照实验失败。

图4展示了使用RAPID 7200成功分析的一个示例。阳性对照在约25个循环（x轴）时被扩增，并产生可检测的荧光信号（y轴）。对于大多数禽流感病毒（AIV）参考实验室而言，循环阈值（CT）> 35 被公认为判定阴性的 cutoff 值。因此，本方法的阳性对照在AIV检测可接受的循环数范围（0–35）内产生了荧光信号。相比之下，阴性对照即使在45个循环后也未产生荧光信号。同样，从西部沙锥采集的12个样本均未产生荧光信号，表明这些鸟类AIV检测呈阴性。建议对所有阳性样本在传统实验室中进行后续检测，以确保不会出现假阳性结果。

鸟类环志过程；研究人员在湿地生境研究中使用网具捕捉涉禽。
图1. 使用雾网捕捉涉禽。

鸟类环志研究过程；科研人员戴手套在野外实验中固定鸟类以进行标记。
图 2. 从最小沙锥鸟采集泄殖腔和口咽样本。

用于DNA扩增的PCR工作站界面；包含温度循环和实时图表。
图3. 对 RAPID 7200 进行RNA扩增程序设置。

显示荧光值与循环数关系的qPCR分析图，DNA扩增结果。
图4. RAPID 7200便携式rRT-PCR生成的荧光扩增曲线，展示在成功检测中阳性与阴性对照应呈现的结果。点击此处查看完整尺寸图像

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讨论

本文介绍的快速诊断方法可实现对野生鸟类样本的高效、准确检测，适用于禽流感病毒（AIV）监测。 便携式实时逆转录聚合酶链式反应（rRT-PCR）对样本储存条件的要求大大降低，适用于偏远地区，在无法获得液氮运输罐或干冰而难以维持冷链的情况下尤为适用。此外，我们发现使用冻干试剂进行样本分析操作简便，即使缺乏实验室分子检测经验的野外生物学家也能完成。该技术不仅高效省时，而且成本效益高。在单人操作下，每天在野外环境中可完成三批次检测，共计42个AIV样本筛查。我们认为，运行该系统所需的所有材料均可携带至任何地点，并可在一天内完成对操作人员的技术培训。在偏远野外环境中，主要限制因素是便携式rRT-PCR仪及配套计算机所需的电源供应；然而，使用稳压便携式发电机可缓解这一问题。此外，提取RNA或原始样本的测序仅在能够暂时维持冷链直至样本送抵实验室的情况下才可行。

我们先前的分析表明，便携式rRT-PCR设备在特异性（100%）方面与实验室环境下的病毒分离法完全一致，敏感性（98%）也相当2。既往的验证研究显示，rRT-PCR最常见的错误是假阴性结果，其主要原因包括样本制备不当、粪便样本中存在P...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

我们感谢爱达荷技术公司的 M. Scullion 和 R. Crisp 提供的技术支持，以及美国地质调查局西部生态研究中心提供的资金（S. Schwarzbach）和协助（K. Spragens、T. Graham）。本研究在美国创新技术中心—国防与国土安全研究所（www.idhs.org）的主持下进行，旨在支持美国国防部和空军研究实验室。动物操作遵循美国地质调查局西部生态研究中心动物护理与使用委员会批准的方案，以及美国地质调查局鸟类环志实验室的许可。本出版物中提及的任何贸易、产品或公司名称仅用于描述性目的，并不意味着美国政府对此表示认可。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RNeasy mini 离心柱Qiagen74106RNeasy Mini Kit 包含组分
收集管（1.5 &和 2 mL）Qiagen74106RNeasy Mini Kit 包含组分
Buffer RLTQiagen74106RNeasy Mini Kit 中包含
Buffer RW1Qiagen74106RNeasy Mini Kit 包含组分
缓冲液 RPEQiagen74106RNeasy Mini Kit 包含组分
无RNase水Qiagen74106RNeasy Mini 试剂盒包含组分
14.3 M β-巯基–乙醇溶液Fisher ScientificBP176100
100% 乙醇Fisher ScientificNC9602322
Vortex Genie 2，120VScientific Industries Inc.SI-0236
Taqman 流感病毒 A 型靶标 1（水解探针）爱达荷科技ASAY-ASY-0109
Lightcycler 20 ml 封口毛细管罗氏集团04929292001
配备2 ml离心管转子的微型离心机 爱达荷科技包含在 RAPID 试剂盒中
坚固型高级病原体识别装置（RAPID）7200爱达荷科技包含在 RAPID 试剂盒中
基于 Pentium 的笔记本电脑，配备 Windows XP Professional爱达荷科技包含在 RAPID 试剂盒中
Lightcycler 数据分析软件爱达荷科技公司包含在 RAPID 试剂盒中

参考文献

  1. Spackman, E. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).
  2. Takekawa, J. Y. Field detection of avian influenza virus in wild birds: evaluation of a portable rRT-PCR system and freeze-dried reagents. J Virol Methods. 166, 92-97 (2010).
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  13. Gilbert, M. Flying over an infected landscape: distribution of highly pathogenic avian influenza H5N1 risk in South Asia and satellite tracking of wild waterfowl. Ecohealth. , (2010).

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