Summary
这项研究描述了在使用一台便携式的RRT - PCR系统的野生鸟类禽流感的诊断。该方法采用冻干试剂的屏幕野生鸟类在非实验室环境中，典型的爆发情况下的优势。利用分子工具提供了快速诊断的准确和灵敏的替代品。
Abstract
野生鸟类有牵连的H5N1亚型高致病性禽流感（HPAI）的蔓延，促使监控候鸟迁徙的飞行路线。野生鸟类禽流感病毒（AIV）的采样往往是在偏远地区进行，但结果往往是因为需要运输的样本，以分子检测实验室配备的延误。实时逆转录聚合酶链反应（RRT - PCR）是一种分子的技术，提供了最准确和最敏感的禽流感病毒的诊断方法之一。 RRT - PCR所需的协议以前严格的实验室目前正在适应的领域。冷冻干燥（冻干）的试剂，不需要冷链，湿试剂水平的灵敏度的发展带来了现场的远程测试，以一个实际的目标。
在这里，我们目前在使用单位RRT - PCR（加固高级病原鉴定设备或快速，爱达荷州技术，盐湖城，UT），采用冻干试剂（A型流感的目标1的TaqMan的野生鸟类禽流感病毒快速诊断方法; Asay的ASY - 0109，爱达荷州技术）。该试剂含有适当浓度的单管所有必要的组件进行测试：引物，探针，酶，缓冲液和内部阳性对照，消除与保管不当或处理湿试剂相关的错误。便携式装置执行针对矩阵基因产生的结果，并在2-3小时的屏幕为A型流感。遗传亚型H5和H7型引物也可能设置为目标的血凝素基因。
该系统是适合收集的野生鸟类，迁徙滨鸟种在这里展示了使用泄殖腔和口咽的样品，在北加州拍摄西部鹬（Calidrus马利） 。动物处理动物护理和使用委员会的美国地质调查局西部生态研究中心和美国地质调查局捆扎实验室鸟儿许可证批准的协议。这项技术的主要优势是加快野生鸟类的诊断，增加包含在偏远地区爆发的机会。现场诊断也将证明有用的鉴定和研究野生种群的感染者。收集主机生物学（免疫和生理反应，感染）和空间生态（受感染的鸟类的迁徙表现）信息的机会将提供野生鸟类在何种程度上可以作为禽流感病毒的载体，在长距离的见解。
Protocol
1。野生鸟类捕捉，使用水雾网
- 滨鸟捕获，设立一个活跃的，如沼泽，海岸线，滩涂觅食网站的薄雾网。
- 幻灯片特拉梅尔线循环极周围的雾网的一端垂直插入泥极。
- 伸出净，特拉梅尔循环通过插入第二个极点雾网的另一端，垂直插入泥杆，确保特拉梅尔线教。
- 一旦鸟被捕获，提取净的鸟类和返回绑扎站。
2。泄殖腔拭子采样
- 在拍摄后立即收集泄殖腔拭子
- 找到泄殖腔，用指尖推回周围羽毛
- 解开一个无菌涤纶或聚酯倾斜棉签，果蒂第一，和滋润更易于在擦拭用无菌病毒运输媒体的一角。润燥后，整个头部的棉签轻轻插入泄殖腔。拭泄殖腔内缓慢捻转的拭子和删除泄殖腔拭子的周长。
- 直接插入到病毒的传输介质样品瓶拭子末端，旋转棉签轴之间的拇指和食指，棉签是在媒体。有一个助手完成拉〜1厘米的小瓶底部棉签回尖端的程序和一把剪刀切轴棉签拭子末端仍然在小瓶和轴不干预第封闭。第小瓶紧紧。与酒精切割棉签轴之间消毒的剪刀。
- 放置在冷冻盒，内含干冰或冰袋小瓶。
3。口咽部拭子采样
- 轻轻打开鸟嘴，使鼻孔缝可见
- 解开一个干净的棉签从包，果蒂第一，滋润提示与病毒的传输介质，更易于在擦拭
- 不接触到任何其他表面的提示，插入的嘴和棉签鼻孔开放口的屋顶上，并继续对口咽或咽喉地区
- 将直接进入病毒传输介质的小瓶拭子末端。旋转棉签轴之间的拇指和食指，棉签是在媒体。如上所述，助理拉〜1厘米的小瓶底部的棉签回头和切轴棉签一把剪刀，所以拭子末端仍然在小瓶和轴不干预第关闭。第小瓶紧紧。与酒精切割棉签轴之间消毒的剪刀。
- 放置在冷冻盒含有干冰或冰袋小瓶。
4。禽流处理和发布
- 返回鸟捕捉和及时的释放（<20分钟）的网站。处理程序应该意识到动物福利的原则，为鸟类在取样过程中的痛苦的迹象（如擦伤，捕捉性肌病和低或热疗）警报。一个基本的急救箱应该包括在设备清单。
5。测试设施
- 测试样品可以在任何封闭的空间，如研究拖车或帐篷，与电源（发电机电压调节）运行PCR单位连接的计算机。
6。 RNA的提取
- RNA提取的RNeasy试剂盒稍作修改，以制造商的说明，以下Spackman等。
- 涡街3-5小号棉签中期和350μL转移到2 ml离心管。注：在PCR阳性标本需要rescreened或H5病毒测试需要运行，其余样品置于冰上。
- 添加350μL的RLT缓冲（β- ME）和第5号的旋涡
- 的RNA级70％的乙醇添加350μL。
- 在5000 XG离心5分钟。
- 自旋列放置在一个2 ml收集管中加入600μL上清。保留其余样品在试管架。
- 万XG和丢弃流过离心20秒。
- 重复步骤17-18，直到所有的样品已经通过离心柱通过。
- 离心柱放置在一个干净的2ml收集管。
- RW1缓冲液加入700μL的离心柱和离心25秒10,000 × G.丢弃的流量通过。
- 加入500μl的RPE缓冲区的离心柱和离心25秒10,000 × G.丢弃的流量通过。
- 共有两个视网膜色素上皮缓冲区清洗重复步骤22。
- 离心14000小工的一个额外的2分钟旋转列倒掉收集管中。
- 离心柱放置在一个干净的1.5 ml离心管，加入无核酸酶水50μL。在室温下孵育60秒。
- 洗脱RNA的万XGF 60秒旋转或60秒。将纯化的冰样本。
7。准备阴性对照
- 冻干试剂准备使用PCR检测TaqMan探针A型流感的目标1（Asay的ASY - 0109）从爱达荷州技术冻干试剂检测试剂盒的说明。
- 离心3秒阴性对照试剂瓶（红色），以确保颗粒在底部。
- 删除第视觉确保颗粒在底部。
- 加入20μL2 ×重整缓冲液和20μL试剂级水。
- 重温和旋涡的最大速度为5小号。
- 离心3秒，使液体瓶底。
- 目视检查颗粒水化，如果不重复步骤31-32。
- 成的LightCycler毛细管水合混合物加入19μL，重复到第二个毛细管吸管的步骤，以获得一式两份。
8。准备测试样本
- 离心3秒未知的试剂瓶（蓝色），以确保颗粒在底部。
- 删除第视觉确保颗粒在底部。
- 加入40μL纯化的RNA。
- 重温和旋涡的最大速度为5小号。
- 离心3秒，使液体瓶底。
- 目视检查颗粒水化，如果不重复步骤38-39。
- 水合混合成的LightCycler毛细管加入19μL，重复到第二个毛细管吸管的步骤，以获得一式两份。
9。准备阳性对照
- 离心3秒阳性对照试剂瓶（绿色），以确保颗粒在底部。
- 删除第视觉确保颗粒在底部。
- 加入20μL2 ×重整缓冲液和20μL试剂级水。
- 重温和旋涡的最大速度为5小号。
- 离心3秒，使液体瓶底。
- 目视检查颗粒水化，如果不重复步骤45-46。
- 成的LightCycler毛细管水合混合物加入19μL，重复到第二个毛细管吸管的步骤，以获得一式两份。
10。离心的毛细管
- 一旦所有的批处理毛细管已准备装入装有毛细管适配器的微型离心机。
- 离心机在最低设置按钮1秒的脉冲这转移液体，准备进行测试底部。
11。操作快速
- 创建一个新文件。标签阳性对照，阴性对照和样品（他们的ID号）。
- 计划1：RNA样品制备举行
- 周期= 1
- 分析模式=无
- 目标温度= 40
- 孵化时间为30分钟
- 温度变化率= 20 ° C / S（默认）
- 二级温度目标= 0（默认）
- 步长= 0（默认）
- 步骤延迟= 0（默认）
- 采集模式=无（默认）
- 计划2：RNA的变性
- 周期= 1
- 分析模式=无
- 目标温度= 94
- 孵化时间= 120秒
- 温度变化率= 20 ° C / S（默认）
- 二级温度目标= 0（默认）
- 步长= 0（默认）
- 步骤延迟= 0（默认）
- 采集模式=无（默认）
- 计划3：RNA扩增
- 周期= 45
- 分析模式=自动分析
- 目标温度，段1 = 94;段2 = 60
- 孵化时间段1 = 0秒，段2 = 20秒
- 温度变化率，赛格1＆2 = 20 ° C /秒（默认）
- 二级温度目标，赛格1＆2 = 0（默认）
- 步长，赛格1＆2 = 0（默认）
- 步骤延迟，赛格1＆2 = 0（默认）
- 采集模式，段1 =无;段2 =单
- 荧光参数
- 显示模式：荧光通道2（CH2 / 1）
收益：- CH 1（F1）= 1
- CH 2（F2）= 8
- CH 3（F3）= 1
- 要显示每个样品的实时荧光数据，选择感兴趣的样本，并点击“显示图形”按钮，在屏幕底部
- 显示模式：荧光通道2（CH2 / 1）
- 对于每一个毛细血管，结果包括以下内容：
- ＃ - 标识的传送带传送带的位置
- 样品名称 - 提供样品名称
- 控制 - indentifies每个样品的样品类型
- 分数 - 计算样品中样品的荧光和背景荧光水平之间的关系
- 结果 - 显示样品的总体结果
12。代表性的成果：
现状：一个红色的“本”呼叫测试/未知样品表明的目标是确定在该样本和控制是成功的。未检出：一个绿色“未检出”测试/未知样品的呼吁表示，没有确定的目标是在该样本和测试控制是成功的。
请重复：一个“请重复”的指示，积极或消极的控制失败。
一个成功的快速7200分析的一个例子是如图4所示。阳性对照扩增，并生成检测到的荧光，在约25个周期（X轴）（y轴）。循环阈值（CT）> 35商定的截止大多数禽流感病毒参考实验室。因此，此方法的阳性对照为禽流感病毒的检测范围内接受的周期数（0-35）的荧光信号。相比之下，阴性对照不产生后甚至45个循环的荧光信号。同样，来自西部鹬的十二个采集的样品不产生荧光信号，表明鸟类是禽流感病毒的负面。鼓励在传统实验室的所有阳性标本的后续测试，以确保没有错误产生误报。
图1。涉禽捕获使用薄雾网。
图2。至少鹬泄殖腔和口咽样品的收集。
图3。编程RNA扩增迅速7200。
图4。Fluorogram 7200便携式快速RRT - PCR显示阳性和阴性对照，应该会出现在一个成功的实验产生的。点击这里查看完整大小的影像
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Discussion
这里介绍的快速诊断方法，有利于高效，准确的监测禽流感病毒的野鸟样本进行测试。要少得多严格的便携式RRT - PCR标本的存储需求，适合于远程的情况下，维持冷链可能是不切实际的的，如果不可用液氮货主或干冰。此外，我们发现，随着冻干试剂的样品分析，足够直接与实验室为基础的分子分析的最小的知识领域的生物学家。这项技术是时间效率和成本效益。一个经营者，这是可行的运行三批，造成每天在一个字段设置为禽流感病毒在42场次。我们的评估，可以带到任何地点和方法可以传授给在一天中的运营商来运行此系统所需的所有材料。在远程现场的情况下的限制因素是运行所需的便携式RRT - PCR单位和连接的计算机的电源;然而，这可能是通过使用便携式电力发电机电压调节缓解。此外，提取的RNA或原样品的测序是只在冷链可暂时维持，直至交付给一个实验室的情况下可行的。
我们前面的分析表明，便携式RRT - PCR单位相同的特异性（100％）和可比的灵敏度（98％），在实验室设置2进行病毒分离。前验证的研究表明，虚假的底片是最常见的RRT - PCR的错误，因为不当的样品制备，PCR抑制剂在粪便或退化的冻干试剂珠1,3-4存在很大的潜力。该技术的另一个缺点是新出现的禽流感病毒株的冻干试剂的灵敏度。该病毒在基因重组的一个恒定状态，主机重叠的地方，由众多的系统发育研究5-8支持一种假说。因此，使用便携式RRT - PCR引物和探针发出需要不断的重新验证。例如，针对美国和欧亚谱系的H5和H7亚型的试剂，现在由于病毒的分歧建议根据生物地理区域 9 。与所有其他的现场测试，疑似高致病性禽流感病毒阳性，应运到最高的特异性和灵敏度10六，最后确认测试批准的设施。
总之，本研究表明，便携式RRT - PCR适合泄殖腔样本为禽流感病毒的野生鸟类在非实验室环境中筛选的目的。这项技术的主要优势是加快野生鸟类的诊断，含在一个位置偏远，更快的响应时间爆发的机会增加。便携式RRT - PCR也代表了一种寻求解开野生鸟类的禽流感病毒的传播中的作用的研究人员认为，突破。诊断主机的状态，在采样时间的能力使得它可以收集生物信息有关免疫和生理反应 11感染，或与野生鸟类的自然抗性12相关遗传特性，以解决关键问题。此外，确认主机上部署昂贵的卫星发射器，以跟踪他们的行踪，将确定哪些物种的禽流感病毒的长途电话运营商，以及评估其迁徙的表现，栖息地的喜好和层次的互动与家禽的行为非常宝贵的。为高致病性禽流感病毒引起国际关注的领域，如中亚和南亚13，未来的业务测试，最终确定如何快速RRT - PCR单位下爆发的情况下执行时，诊断的阳性标本的大量时间关键。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们要感谢的技术支持和USGS西部生态研究中心提供资金（S. Schwarzbach）和援助（K. Spragens T.格雷厄姆）M. Scullion爱达荷州技术和R.酥。主持的创新技术中心 - 国防和国土安全部（www.idhs.org），国防部和美国空军研究实验室部支持下进行这项研究。动物处理动物护理和使用委员会的美国地质调查局西部生态研究中心和美国地质调查局捆扎实验室鸟儿许可证批准的协议。任何使用本出版物中的贸易，产品或公司名称仅是描述目的，并不意味着美国政府的认可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy mini spin column | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Collection tubes (1.5 & 2 mL) | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RLT | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RW1 | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| Buffer RPE | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| RNase-free water | Qiagen | 74106 | Included in RNeasy Mini Kit |
| 14.3 M β-mercapt–thanol solution | Fisher Scientific | BP176100 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | NC9602322 | |
| Vortex Genie 2, 120V | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | |
| Taqman Influenza A Target 1 (Hydrolysis Probe) | Idaho Technologies | ASAY-ASY-0109 | |
| Lightcycler 20ml capillary tubes | Roche Group | 04929292001 | |
| Micro-centrifuge with rotator for 2 ml tubes | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (RAPID) 7200 | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Pentium-based laptop with Windows XP Professional | Idaho Technologies | Included in RAPID kit | |
| Lightcycler Data Analysis software | Idaho Technologies | Included in RAPID kit |
References
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