Summary
Dimostriamo la metalation, purificazione e caratterizzazione di complessi di lantanidi. I complessi qui descritto può essere coniugato con macromolecole di attivare il rilevamento di queste molecole usando la risonanza magnetica.
Abstract
Polyaminopolycarboxylate a base di leganti sono comunemente utilizzati per chelare ioni lantanidi, ed i complessi risultanti sono utili come agenti di contrasto per risonanza magnetica (MRI). Molti ligandi disponibili in commercio sono particolarmente utili perché contengono gruppi funzionali che consentono veloci, elevata purezza e ad alto rendimento coniugazione a macromolecole e biomolecole attraverso esteri attivati ammina-reattiva e gruppi isotiocianato o tiolo-reattiva maleimides. Mentre metalation di questi ligandi è considerato conoscenza comune nel campo della chimica bioconjugation, sottili differenze nelle procedure metalation devono essere presi in considerazione nella scelta dei materiali metallici di partenza. Inoltre, più opzioni per la purificazione e la caratterizzazione esistono, e la scelta della procedura più efficace dipende in parte dalla selezione delle materie prime. Queste sottili differenze sono spesso trascurati nei protocolli pubblicati. Qui, il nostro obiettivo è quello di dimostrare metodi comuni per metalation, purificazione e caratterizzazione di complessi di lantanidi, che possono essere usati come agenti di contrasto per risonanza magnetica (Figura 1). Ci aspettiamo che questa pubblicazione permetteranno agli scienziati biomedici di incorporare le reazioni di complessazione lantanidi nel loro repertorio di reazioni comunemente usate dai facilitando la selezione delle materie prime e metodi di purificazione.
Protocol
1. Metalation utilizzando LnCl 3 sali
- Sciogliere il ligando in acqua per produrre una soluzione di 30-265 mM. Il ligando 2 - (4-isothiocyanatobenzyl)-dietilentriammina acido pentaacetic (p-SCN-Bn-DTPA) è stato utilizzato in questo video in una concentrazione di 73 mm.
- Regolare il pH della soluzione di ligando compreso tra 5,5 e 7,0 con l'aggiunta di 1 M NH 4 OH. In questo video, 0,2 ml di M 1 soluzione di NH 4 OH è stato utilizzato.
- Sciogliere 1-2 equivalenti di LnCl 3 in acqua per produrre una soluzione con una concentrazione di 5.000-1.000 mM. In questo video, EuCl GdCl 3 e 3 sono stati usati in concentrazioni di 111 mm. Un eccesso di metallo è spesso usato per guidare il metalation di completamento e di conseguenza semplificare purificazione.
- Aggiungere la soluzione di LnCl 3 per la soluzione del ligando mescolando.
- Dopo l'aggiunta di LnCl 3, regolare il pH della miscela di reazione risultante tra 5,5 e 7,0 con l'aggiunta di 0,2 M di NH 4 OH. Un totale di 0,5 ml di 0,2 M soluzione di NH 4 OH è stato utilizzato in questo video. Se il legante contiene gruppi funzionali sensibili agli acidi, regolare il pH più volte durante questa fase. ATTENZIONE - Se la soluzione diventa troppo di base, tutti i gruppi di base sensibili funzionali, come isotiocianato, sarà reso inutilizzabile per coniugazione.
- Monitorare la reazione attraverso misure di pH. La reazione è completa quando il pH rimane costante.
2. PH iter Raising (non incluso in questo video, ma buona per ligandi senza gruppi funzionali di base e minuscole)
- Aggiungi concentrato NH 4 OH alla miscela di reazione per regolare il pH a ≥ 11. Questo passo precipitare qualsiasi metallo uncomplexed come idrossido insolubile.
- Filtrare il surnatante attraverso un filtro 0,2 micron. Se la miscela di reazione intasa il filtro, centrifugazione e decantazione prima di filtraggio è raccomandato.
- Se la dialisi non verrà eseguita, rimuovere il solvente a pressione ridotta (evaporazione rotante o liofilizzazione è consigliato).
- Passi 2,1-2,3 può essere ripetuto se lantanidi libero rimane.
3. Dialisi workup
- Tagliare il tubo dialisi ad una lunghezza appropriata (seguire le linee guida del produttore) per tenere il volume del campione, lasciando lunghezza in più (circa il 10% del volume del campione). In questo video, un 100-500 dalton peso molecolare di cut-off (MWCO) membrana è stata utilizzata, ma più grandi tubi MWCO può essere utilizzato come coniugazione appropriata se viene eseguita prima di metalation. Inoltre, le cassette dialisi può essere utilizzato come alternativa ai tubi di dialisi se lo si desidera.
- Se del caso sulla base di linee guida del produttore, immergere il tubo dialisi taglio in acqua per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Riempire un serbatoio di dialisi (1 bicchiere L è stato utilizzato in questo video) con l'acqua (dialisato). Il volume dialisato dovrebbe essere di circa 100 volte quella del campione.
- Piegare un'estremità del tubo due volte e fissare la parte piegata del tubo con una fascetta di chiusura dialisi. Avvolgere la fine della chiusura con un elastico per garantire che rimanga chiuso durante la dialisi.
- Filtrare la miscela di reazione attraverso un filtro 0,2 micron, e caricare il filtrato nella parte aperta del tubo facendo attenzione a non strappare il tubo. Assicurarsi di lasciare sufficiente spazio testa per chiudere il tubo.
- Piegare l'altra estremità aperta del tubo due volte, sicuro con una chiusura, e avvolgere la chiusura con un elastico come al punto 3.4.
- Collegare un flaconcino di vetro contenente aria al morsetto su una delle estremità del tubo dialisi con un elastico. Fissare un flacone contenente sabbia per l'altro morsetto. Queste fiale in modo che il tubo rimane immerso nel dializzato.
- Posizionare il tubo pieno nel serbatoio che contiene dialisi dialisi.
- Mescolare il dializzato utilizzando una piastra magnetica mescolare a bassa velocità (non vortex) a temperatura ambiente.
- Modificare il dialisato 3x nel corso di una giornata (in questo video, il dialisato è stato cambiato a 2,5, 6,5, e 11,5 ore), e quindi consentire di continuare la dialisi durante la notte (per un totale di 20-28 ore di dialisi).
- Rimuovere il tubo di dialisi dal dialisato e attentamente aprire una chiusura a rimuovere l'esempio. Lavare il circuito di dialisi 3x con acqua e combinare i lavaggi con il campione.
- Rimuovere l'acqua a pressione ridotta. Liofilizzazione è utilizzato in questo video.
4. Valutazione della presenza di metallo libero
- Sciogliere il complesso metallico a tampone (buffer di preparazione: Sciogliere 1,4 ml di acido acetico in 400 mL di acqua, aggiustare il pH a 5,8 con 1 M NH 4 OH, e aggiungere acqua per produrre un volume totale di 500 mL) e aggiungere il xilenolo Indicatore arancione (16 mM in tampone pH 5,8). In questo video, 0,3 mg di complesso è stato sciolto in 0,3 ml di buffer e 3 ml di soluzione d'indicatore è stato aggiunto.
- Rilevare la presenza di metallo libero attraverso l'osservazione di un cambiamento di colore dell'indicatore dal giallo al viola.
- Se lo si desidera, la quantità di metallo libero può essere quantificata mediante la creazione di una curva di calibrazione 1. In alternativa, il colorante arsenazo III può essere usato al posto di xilenolo arancio 2. Se il metallo libero rimane, il campione deve essere ulteriormente purificato tramite dialisi, una colonna di dissalazione, o ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) prima caratterizzazione.
5. Determinazione di acqua coordinamento numero (q)
- Preparare una soluzione del Eu III contenenti complesso (~ 1 mm) in H 2 O e un'altra soluzione della stessa concentrazione in D 2 O. Prima dell'analisi, la soluzione D 2 O devono essere evaporata e sciolto in D 2 O tre volte per rimuovere residui di H 2 O.
- Aggiungere la soluzione di acqua ad una cuvetta pulita, e posizionare la cuvetta in una spettrofluorimetro.
- Eseguire scansioni di eccitazione ed emissione per determinare i massimali previsti per ogni (~ ~ 395 nm e 595 nm, rispettivamente).
- Eseguire una fosforescenza tempo di decadimento esperimento utilizzando i seguenti parametri: lunghezza d'onda di eccitazione e di emissione stabiliti a partire dal punto 5.3, eccitazione e fenditure emissione (5 nm), flash contano (100), ritardo iniziale (0,01 ms), ritardo massimo (13 ms) e incremento di ritardo (0,1 ms). Queste condizioni sono adatte alla maggior parte dei complessi, ma il ritardo massimo e valori di incremento può essere aumentata o diminuita per le specie con tempi di decadimento molto lunghi o molto corti.
- Ripetere il passo 5,4 con la soluzione di D 2 O preparato al punto 5.1.
- Dal luminescenza-decadimento dati ottenuti in 5.4 e 5.5, la trama il logaritmo naturale di intensità in funzione del tempo. La pendenza di queste linee sono i tassi di decadimento (τ -1) (Figura 2). In questo video, Microsoft Excel 2007 è stato utilizzato per generare le trame logaritmo naturale dai dati grezzi. Utilizzare i tassi di decadimento nella equazione sviluppata da Horrocks e collaboratori (eq 1) 3. Se il legante contiene gruppi OH o NH coordinati al metallo, allora l'equazione deve essere modificata prima dell'uso 3.
eq 1: 
6. Relassività misure
- Selezionare la modalità di applicazione desiderata sull'analizzatore tempo di rilassamento: T 1 (tempo di rilassamento longitudinale) o T 2 (tempo di rilassamento trasversale).
- Preparare una serie di campioni che contengono diverse concentrazioni di Gd III contenenti complessi in un solvente acquoso. In questo video, l'acqua è stato utilizzato come solvente e soluzioni di 10.0, 5.00, 2,50, 1,25, 0,625 e 0 mm sono stati preparati. Altri solventi acquosi o buffer potrebbe essere usato, ma è importante utilizzare il solvente come il vuoto. Il volume finale del campione è specifico per lo strumento che viene utilizzato.
- Porre un campione nello strumento e lasciare riposare per 5 minuti per equilibrare la temperatura dello strumento (37 ° C in questo video).
- Determinare il tempo di rilassamento (in unità di s) regolando i parametri del software per ottenere una curva esponenziale per T 1 o T 2 (curve rappresentante per T 1 e T 2 sono mostrati in Figura 3).
- Ripetere i passi 6.3 e 6.4 per tutti i campioni compreso il bianco.
- Calcolare l'inverso della misurato T 1 o T 2 valori in unità di s -1.
- Tracciare la T o T 1 -1 2 -1 valori in funzione della concentrazione Gd III (in unità di mM). A causa della natura igroscopica di Gd III contenenti complessi, confermare la concentrazione di Gd III con spettrofotometria ad assorbimento atomico o spettrometria di massa ad accoppiamento induttivo plasma. Montare la trama con una linea retta. Un diagramma rappresentante è mostrata in Figura 4.
- La pendenza della retta è la relassività (r 1 e r 2 per T 1 e T 2, rispettivamente) ed ha unità di mM -1 s -1.
7. Rappresentante Risultati
Dati rappresentativi per i passaggi di questo protocollo sono stati inseriti nelle tabelle e figure sezione. Oltre all'acqua coordinamento numero e la caratterizzazione relassività descritte nel protocollo, è importante per caratterizzare prodotti finali utilizzando tecniche chimiche standard. L'identità del composto può essere ottenuto utilizzando la spettrometria di massa, spettri di massa e di rappresentanza che mostra i modelli isotopo diagnostici per Gd III - III e Eu contenenti complessi sono mostrati in figura 5. Inoltre, per i non-Gd III
Figura 1 Schema generale per metalation e purificazione:. Schema raffigurante la procedura generale per metalation e le ragioni per la scelta di percorsi diversi purificazione.
Figura 2 luminescenza intensità trama:. Trama Rappresentante del logaritmo naturale di intensità in funzione del tempo dalla sezione 5. Le pendenze delle linee generate da curve simili acquisiti per l'acqua e le soluzioni D 2 O vengono usati con eq 1 a caratterizzare l'acqua coordinamento numero di Eu III contenenti complessi.
Figura 3 curve di rilassamento tempo di decadimento:. Dati Rappresentante per (a sinistra) T 1 e (a destra) T 2 acquisizione. Deviazioni da queste forme curva dovrebbe produrre dati inattendibili.
Figura 4 determinazione relassività:. Un grafico rappresentativo di 1 / T 1 contro la concentrazione di Gd III. La pendenza della retta è relassività e dispone di unità di mM -1 s -1.
Figura 5 spettri di massa:. Spettri di massa rappresentante che mostra i modelli diagnostici per isotopo (a sinistra) Gd III contenenti complessi e (a destra) Eu III contenenti complessi. I picchi neri rappresentano la distribuzione gaussiana teorica isotopo e le linee rosse sono i dati effettivi.
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Discussion
Dato il numero crescente di pubblicazioni che includono lantanidi a base di agenti di contrasto 4-14, è importante che la cura nella preparazione, purificazione e caratterizzazione dei prodotti per garantire risultati riproducibili e comparabili. Questi complessi sono spesso considerati difficili da purificare e caratterizzare rispetto alle molecole organiche a causa della loro natura paramagnetica e la sensibilità di gruppi funzionali che potrebbero essere utilizzati per bioconjugation. Abbiamo descritto i metodi comuni per la sintesi, purificazione e caratterizzazione di complessi di lantanidi. Tuttavia, al momento di scegliere uno di questi metodi è importante considerare il sistema specifico oggetto di studio.
Nelle reazioni di complessazione, una varietà di sali metallici che sono disponibili in commercio possono essere usati, e la selezione di sale dipende dall'obiettivo dello studio. Per esempio, un vantaggio di usare il cloruro (o triflate o nitrato) sali è che le condizioni sono tenuti relativamente mite rispetto alla temperatura. Tuttavia, questi metodi richiedono un attento monitoraggio del pH e producono sali come sottoprodotti. Se il sistema allo studio è particolarmente sensibile alle variazioni di pH, poi un attento monitoraggio e controllo del pH deve essere eseguita. Inoltre, se i sottoprodotti di sale sarebbe dannoso per il sistema allo studio, devono essere rimossi o una sintesi alternativa dovrebbe essere usato. Con l'idrossido di lantanidi (o ossido) materie prime, temperature più elevate deve essere utilizzato a causa della bassa solubilità di queste specie, ma l'unico sottoprodotto di metalation è l'acqua. Questo metodo è ideale per le reazioni che sarebbe difficile desalt, ma non avrebbe funzionato per la temperatura-sensibili sistemi. E 'anche opportuno ricordare che queste reazioni metalation sono estremamente robusto rispetto alle concentrazioni del metallo e legante. La concentrazione intervalli elencati nella prima parte coprono l'intervallo di concentrazioni che abbiamo trovato in letteratura.
Oltre alla selezione da parte di materiale metallico di partenza, è importante sottolineare che sia il metallo e legante probabilmente strettamente associati molecole di acqua e solvente, anche se sembrano essere asciutto. Queste molecole extra sono abbastanza spesso per distorcere notevolmente la stechiometria di una reazione. Di conseguenza, è utile avere ben caratterizzati materiali di partenza (analisi elementare) in modo che la quantità precisa di questi materiali sono usati nella reazione.
In questo articolo, sottolineiamo l'importanza di mantenere il pH della miscela di reazione. Questo controllo del pH è critico a causa dei molteplici aspetti della reazione che può fallire se il pH è permesso di deviare dal vicino neutrale. Per la reazione metalation a verificarsi, gli acidi carbossilici del ligando deve essere deprotonato (vicino a pH neutro o superiore), mentre lo ione lantanidi devono rimanere solubile (vicino a pH neutro o inferiore). Se il pH è troppo alto, complessi di idrossido insolubile dello ione lantanidi si precipitano e fermare la reazione. In alternativa, se il pH è troppo basso, gli acidi carbossilici rimarrà protonata e il ligando non coordinerà al metallo. Inoltre, a valori di pH estremi, gruppi funzionali reattivi si decompongono e rendere il complesso inerte verso bioconjugation reazioni successive. Per complicare ulteriormente le cose, come la reazione metalation si verifica, il pH della miscela di reazione si abbassa come gli acidi carbossilici sono deprotonato. Mentre l'equilibrio del pH del metalation può apparire complessa, può essere facilmente controllato con l'aggiunta attento di base.
Ci sono molte strategie per metalation con sottili differenze. In questo articolo abbiamo scelto di descrivere l'uso del metallo in eccesso. E 'anche accettabile usare ligando eccesso o quantità equivalenti di legante e metallo (sulla base di analisi elementare dei materiali di partenza). Ci sono vantaggi e le limitazioni di ogni percorso. Il principale vantaggio di usare metallo in eccesso è che il legante è spesso il materiale più costoso di partenza, e questo metodo può risparmiare denaro. Tuttavia quando il metallo viene usato in eccesso, la rimozione del metallo in eccesso è di importanza fondamentale, perché qualsiasi metallo libero può influire notevolmente importanti proprietà comprese relassività e la tossicità. Se la dialisi contro l'acqua non è sufficiente a rimuovere il metallo in eccesso, dialisi contro tampone citrato può essere eseguita seguita da dialisi con acqua per eliminare tampone citrato. In alternativa, una colonna di dissalazione o HPLC può essere utilizzato fino a quando si presta attenzione a garantire che la neutralità del pH della fase mobile viene utilizzato. Quando ligando è usato in eccesso, non c'è più l'urgente necessità di rimuovere il metallo in eccesso e legante in eccesso probabilmente non influenza relassività, tuttavia, ligando libero resterà. Per le reazioni bioconjugation successivi, questo legante in eccesso può essere problematico e causare coniugati disomogeneo che sono difficili da separare. Per ovviare a questo problema, metallo complexes può essere precipitato da anidro etere dietilico o HPLC può essere utilizzata per separare complesso metallico da legante in eccesso. Idealmente, legante e metallo sarebbe stato utilizzato in un rapporto 1:1 con conseguente nessun sottoprodotti di metallo o di ligand-based. Tuttavia, l'analisi elementare per entrambi i materiali di partenza è necessaria prima di ogni reazione, e se c'è una leggera deviazione da un legante-metallo rapporto 1:1, allora la reazione si dividono in due il legante in eccesso o in metallo in categorie superiori, con la conseguente necessità di purificazione.
Abbiamo dimostrato metalation dove il complesso risultante è pronto per bioconjugation 15-17. Un'alternativa a questa strategia è la coniugazione di ligando e biomolecole primo seguito da metalation 18,19. Con questo coniugato-then-metalate strategia, gli stessi fattori devono essere presi in considerazione al momento di decidere su un percorso metalation (sensibilità pH e sensibilità alla temperatura delle biomolecole e la capacità di purificare prodotto da sali).
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Noi riconosciamo con gratitudine fondi avvio da Wayne State University (MJA), una borsa di studio dalla Fondazione Americana per Aging Research (SMV), e un percorso di transizione Career Award Indipendenza (R00EB007129) dal National Institute of Biomedical Imaging e Bioingegneria del National Institutes della Sanità (MJA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EuCl3∙6H2O | Sigma-Aldrich | 203254-5G | |
| p-SCN-Bn-DTPA | Macrocyclics | B-305 | |
| ammonium hydroxide | EMD Millipore | AX1303-3 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester (CE) Dialysis Membrane - 500 D MWCO | Fisher Scientific | 68-671-24 | |
| Millipore IC Millex-LG Filter Units | Fisher Scientific | SLLG C13 NL | |
| xylenol orange tetrasodium salt | Alfa Aesar | 41379 | |
| acetic acid | Fluka | 49199 | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-4-25 | |
| water purifier | ELGA | Purelab Ultra | |
| high performance liquid chromatography and mass spectrometry | Shimadzu Corporation | LCMS-2010EV | |
| relaxation time analyzer | Bruker Corporation | mq60 minispec | |
| UV-vis spectrophotometer | Fisher Scientific | 20-624-00092 | |
| freeze dryer | Fisher Scientific | 10-030-133 | |
| pH meter | Hanna Instruments | HI 221 | |
| spectrofluorometer | Horiba Instruments Inc | Fluoromax-4 | |
| Molecular Weight Calculator version 6.46 by Matthew Monr–, downloaded October 17, 2009 |  http://ncrr.pnl.gov/software/ |
Molecular Weight Calculator |
References
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