Summary
我々は、メタル化、精製、及びランタニド錯体の特性を示しています。ここで説明する複合体は、磁気共鳴イメージング法を用いて、これらの分子のトラッキングを有効に高分子に結合させることができる。
Abstract
Polyaminopolycarboxylateベースのリガンドは、一般的にランタニドイオンをキレートするために使用され、結果として得られる複合体は、磁気共鳴画像（MRI）用造影剤として有用である。多くの市販のリガンドは、アミン反応性の活性エステルとイソチオシアネート基又はチオール反応性マレイミドを介して高分子と生体分子への彼らは、高速、高純度を可能にする官能基を含んでいるために特に有用であり、かつ高収率共役。これらのリガンドのメタル化は、コンジュゲーション化学、メタル化の手順の微妙な違いの分野における一般的な知識と考えている間に金属の出発物質を選択する際に考慮する必要があります。さらに、精製および特性評価のための複数のオプションが存在し、最も効果的な手順の選択は、部分的に出発原料の選択に依存します。これらの微妙な違いは、多くの場合、パブリッシュしたプロトコルでは無視されています。ここで、私たちの目標は、メタル化、精製、およびMRI（図1）のための造影剤として使用することができるランタニド錯体の特性評価のための一般的な方法を示すことです。我々は、この出版物は、生物医学科学者は、出発原料と精製方法の選択を緩和し、一般的に使用される反応の彼らのレパートリーにランタニド錯体形成反応を組み込むことが可能になることを期待しています。
Protocol
1。 LnCl 3塩を使用してメタル化
- 30から265 mMの溶液を生成する水の配位子を溶かす。配位子2 - （4 - isothiocyanatobenzyl） -ジエチレントリアミン五酢酸（P - SCN - BN - DTPA）は73 mMの濃度で、このビデオで使用されていました。
- 1 M NH 4 OHを添加することにより5.5と7.0の間に配位子の溶液のpHを調整します。このビデオでは、1 M NH 4 OH液0.2 mLを使用した。
- 5000〜1000 mMの濃度の溶液を生成するために水でLnCl 3の1〜2当量を溶解する。このビデオでは、EuCl 3、GdCl 3は 111 mMの濃度で使用された。金属の過剰は、多くの場合、完了するまでメタル化を促進し、その結果、精製を簡素化するために使用されます。
- 攪拌しながら、配位子の解決にLnCl 3の溶液を加える。
- LnCl 3を添加した後、0.2 M NH 4 OHを添加することにより5.5と7.0の間に得 られた反応混合物のpHを調整する。 0.2 M NH 4 OH溶液0.5 mLの合計は、このビデオで使用されていました。あなたのリガンドは、酸に敏感な官能基が含まれている場合、このステップの中のpHを複数回調整する。注意 - 解決策があまりにも基本的になれば、どのベースに敏感な官能基は、イソチオシアネートと同様に、結合体化のため使用できなくなります。
- pH測定を経由して反応を監視する。 pHが一定のままである時に反応は完了です。
2。 （このビデオに含まれているが、ベースに敏感な官能基のない配位子のためによくない）pHの精密検査を上げる
- ≥11にpHを調整するために反応混合物に濃NH 4 OHを追加。このステップでは、不溶性の水酸化物として任意の非錯化金属を沈殿する。
- 0.2μmのフィルターに通して上清をフィルターします。反応混合物は、フィルタをひいた場合、遠心分離の前のフィルタリングにデカントすることをお勧めします。
- 透析が実行されない場合は、減圧（回転蒸発または凍結乾燥をお勧めします）の下に溶媒を除去。
- 無料のランタニドが残っている場合は、手順2.1から2.3までを繰り返すことができます。
3。透析精密検査
- 余分な長さ（サンプルの体積の約10％）を残したまま、サンプルボリュームを保持するために（製造業者のガイドラインに従って）適切な長さに透析チューブをカット。このビデオでは、100から500ダルトンの分子量カットオフ（MWCO）膜が使用されていましたが、共役をメタル化する前に実行される場合は、大きいMWCOチューブを適宜用いることができる。また、透析カセットは、必要に応じて透析チューブの代替として使用することができます。
- メーカーのガイドラインに基づいて、適切な場合、周囲温度で15分間水にカット透析チューブを浸す。
- 水（透析液）で透析リザーバーを（1 Lのビーカーがこのビデオで使用された）入力してください。透析液の量は約100倍のサンプルのことでなければなりません。
- 倍管の一方の端を折ると透析の閉鎖クランプで管の折り返し部分を固定します。それは透析中に閉じたままであることを保証するために輪ゴムで閉鎖の端を巻きます。
- 0.2μmのフィルターを通して反応混合物をフィルタリングし、チューブを引き裂くように注意しながらチューブの開放端にろ液をロードする。チューブを閉じるには、十分なヘッドスペースを残してください。
- 二度、閉鎖と確保、および手順3.4のようにゴムバンドで閉鎖をラップチューブの残りの開放端を折る。
- ゴムバンドを使用して透析チューブの一端をクランプするために空気を含有するガラスバイアルを取り付けます。他のクランプへの砂の入ったバイアルを取り付けます。これらのバイアルは、チューブが透析液に浸漬に留まることを保証します。
- 透析液を含む透析リザーバーのフルチューブを置きます。
- 周囲温度で低速（無ボルテックス）で磁気攪拌プレートを用いて透析液をかき混ぜる。
- 一日の経過（このビデオでは、透析液を2.5、6.5、11.5時間で変更された）の3倍透析を変更してから、（透析の20〜28時間の合計）透析は一晩を継続することができます。
- 透析液から透析チューブを取り外し、慎重にサンプルを削除する1つの閉鎖を開きます。水で3倍の透析チューブを洗浄し、サンプルと洗浄液を組み合わせる。
- 減圧下で水を取り外します。凍結乾燥は、このビデオで使用されています。
4。フリー金属の存在の評価
- 酢酸緩衝液中で金属錯体を溶解（バッファの準備を：400 mLの水に酢酸1.4 mLを溶かし、1 M NH 4 OHで5.8にpHを調整し、500mLの総容積を生成するために水を加える）し、キシレノールを追加するオレンジ色のインジケータ（pH 5.8の緩衝液で16μM）。このビデオでは、複雑な0.3 mgをバッファ0.3 mLに溶解し、指示薬溶液の3mLを追加しました。
- 紫に黄色からインジケータの色の変化の観察を経由してフリー金属の存在を検出する。
- 必要に応じて、自由な金属の量は、検量線1を作成することによって定量することができる。また、染料アルセナゾIIIは、キシレノールオレンジ2の代わりに使用することができます。遊離金属が残っている場合、サンプルは、さらに前に特性評価するために透析、脱塩カラム、または高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて精製する必要があります。
5。水配位数の決定（Q）
- H 2 Oで複雑 な（〜1 mm）を含むIII - EUのソリューションとD 2 Oで同じ濃度の別の溶液を調製します分析前に、D 2 O溶液は、残留H 2 Oを除去するために三回を蒸発させて、D 2 Oに溶解する必要があります。
- きれいなキュベットに水溶液を追加し、分光にキュベットを置きます。
- （〜395 nmと〜595 nmの、それぞれ）ごとに最大値を決定するために励起および発光スキャンを実行します。
- ステップ5.3、励起および発光スリット幅（5 nm）から決定した励起および発光波長、発光回数（100）、最初の遅延（0.01ミリ秒）、最大遅延（13ミリ秒）：次のパラメータを使用して燐光時間の崩壊実験を行います、および遅延の増加（0.1ミリ）。これらの条件は、ほとんどの複合体に適していますが、最大遅延値と増分値は、極端に長いまたは極端に短い減衰時間を持つ種については増減することができます。
- ステップ5.1で作成したD 2 O溶液を用いて、ステップ5.4を繰り返します。
- 5.4と5.5で得られた発光減衰データから、強度対時間の自然対数をプロット。これらの線の傾きは、減衰率（τ-1）（図2）です。このビデオでは、Microsoft Excel 2007が生データから自然対数プロットを生成するために使用されていました。ホロックスと同僚（式1）3で開発された方程式に減衰率を使用してください。あなたの配位子が金属に配位するOHまたはNH基が含まれている場合、式は使用3の前に変更する必要があります。
式1： 
6。緩和測定
- T 1（縦緩和時間）またはT 2（横緩和時間）：緩和時間のアナライザで、目的のアプリケーションモードを選択します。
- Gdの異なる濃度IIIを含有する水性溶媒中での複合体を含む一連のサンプルを準備します。このビデオでは、水を溶媒として使用され、10.0、5.00、2.50、1.25、0.625、0 mMの溶液を調製した。その他の水性溶剤またはバッファが使用されますが、それは空白のような溶媒を使用することが重要であることができる。サンプルの最終容量は、使用されている楽器に固有のものです。
- 器にサンプルを置き、それは楽器の温度（37℃このビデオではC）に平衡に5分間放置します。
- T 1またはT 2（T 1とT 2の代表的な曲線を図3に示されている）のための滑らかな指数曲線を得るために、ソフトウェアのパラメータを調整することにより緩和時間を（秒単位）を決定します。
- 空白を含むすべてのサンプルのステップ6.3と6.4を繰り返します。
- s -1の単位で測定されたT 1またはT 2の値の逆数を計算します。
- T 1 -1またはT GdのIIIの濃度に対する2 -1の値を（mm単位の）をプロットする。ためにGdのIIIを含む複合体の吸湿性の性質から、原子吸光光度法又は誘導結合プラズマ質量分析法を用いたGdのIIIの濃度を確認する。直線とプロットをフィット。代表的なプロットを図4に示されています。
- 近似直線の傾きは緩和（T 1とT 2、それぞれのためのR 1またはR 2）であり、mMの-1 s -1の単位を持っています。
7。代表的な結果
このプロトコールのステップのための代表的なデータを表と図のセクションに含まれています。プロトコールに記載されて水の配位数と緩和の特性評価に加えて、それは標準的な化学的手法を用いて最終製品を特徴づけることが重要です。化合物の同定は、質量分析、及びGd IIIの診断同位体パターンを示す代表的な質量スペクトルを使用して取得することができます-とEu III含有複合体を図5に示されています。さらに、非GdのIII用
図1メタル化と精製の ための一般的なスキーム：スキームは、メタル化し、異なる精製の ルートを選んだ理由のための一般的な手順を描いた。
図2発光強度をプロットする：セクション5から強度対時間の自然対数の代表プロット。水とD 2 Oのソリューションのために取得した同じようなカーブから生成された線の傾きは、Euの水の配位数IIIを含有する複合体を特徴づけるために式1で使用されています。
図3リラクゼーションの減衰時間曲線：（左）T 1と（右）T 2取得 のための代表的なデータ。これらの曲線の形状からの偏差は、信頼できないデータが生成されます。
図4緩和の決定：GdのIIIの濃度対1 / T 1の代表的なプロット。近似直線の傾きは緩和であり、mMの-1 s -1の単位を持っています。
図5マススペクトル：（左）GD III含有複合体及び（右）のEu III含有複合体の診断同位体パターンを示す代表的な質量スペクトル。黒のガウスピークは理論的な同位体の分布を表し、赤い線が実際のデータです。
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Discussion
ランタニド系造影剤4-14を含んで出版物の増加を考えると、それはケアが、準備、精製、および再現性と比較可能な結果を確保するために製品の特性で撮影されていることが重要です。これらの複合体は、しばしば精製し、その常磁性の性質とバイオコンジュゲーションのために使用される可能性のある官能基の感受性に起因する有機分子の相対的な特徴づけるために挑戦と考えられている。我々は、ランタニド錯体の合成、精製、および特性評価のための一般的な方法を記載している。しかし、これらの方法のいずれかを選択するときに、それは研究されている特定のシステムを考慮することが重要です。
錯体形成反応において、市販されている金属塩の様々な使用することができ、塩の選択は、研究の目的に依存します。例えば、塩化（またはトリフレートまたは硝酸塩）塩を使用する利点は、比較的温和な条件は温度に対して必要であるということです。しかし、これらの方法は、pHの注意深い監視を必要とし、副産物として塩を生成する。研究されているシステムは、pHの変化に特に敏感である場合、pH値の注意深い監視と制御を実行する必要があります。また、塩の副産物が検討されているシステムにとって有害となる場合、それらを削除する必要がありますまたは別の合成法を使用する必要があります。出発物質ランタニド水酸化物（または酸化物）で、より高い温度があるため、これらの種の溶解度が低いから使用できますが、メタル化の唯一の副産物は水であるする必要があります。このメソッドは、脱塩するのは難しいだろうが、それは温度に敏感なシステムでは動作しないという反応に最適です。また、これらのメタル化反応は、金属と配位子の濃度に関して非常に堅牢であることを言及する価値がある。濃度は、我々は文献で見つけることができる濃度の範囲は1スパンの部分に記載されている範囲。
金属出発原料の思慮深い選択に加えて、それは金属と配位子の両方が可能性が密接に関連していることを強調することが重要であり、水と溶媒分子であっても、それらが乾燥したように見える場合。これらの余分な分子は多くの場合、反応の化学量論を大幅に歪曲するのに十分です。したがって、それはよく出発物質（元素分析）ので、これらの材料の正確な量は、反応に使用されていることを特徴としていると便利です。
この記事では、反応混合物のpHを維持することの重要性を強調する。このpH調整のため、pHが中性の近くから外れることが許されている場合失敗することが反応の複数の側面の非常に重要です。ランタニドイオンは、（中性のまたはより低いpHに近い）水溶性の維持する必要があります中に発生するメタル化反応の場合は、配位子上のカルボン酸は、（中性または高pHに近い）脱プロトン化されている必要があります。 pHが高すぎると、ランタニドイオンの不溶性の水酸化物複合体が沈殿し、反応を停止します。 pHが低すぎるとまた、、カルボン酸がプロトン化のままとなり、配位子が金属に配位することはありません。さらに、極端なpH値で、反応性官能基は、その後のコンジュゲーション反応に向かって不活性錯体を分解し、レンダリングします。さらに問題を複雑に、メタル化反応が起こるとしてカルボン酸が脱プロトン化されているように、反応混合物のpHが低下する。メタル化のpHのバランスをとる行為は複雑に見えるかもしれませんが、それは簡単に基地を慎重に添加して制御することができます。
微妙な違いを持つメタル化のための多くの戦略があります。この記事では、余分な金属の使用を記述することを選んだ。また、過剰なリガンドまたはリガンドと金属（出発物質の元素分析に基づく）の当量を使用することは可能です。各ルートの利点と制限があります。余分な金属を使用する主な利点は、リガンドがしばしば最も高価な原料である、そしてこの方法はお金を節約できることです。すべてのフリー金属が劇的に緩和し、毒性などの重要な特性に影響を与える可能性があるため、金属が過剰に使用されている場合、余分な金属の除去は非常に重要です。水に対して透析が過剰の金属、クエン酸緩衝液に対して透析を削除するには不十分な場合に実行クエン酸緩衝液を除去するために水で透析を続けることができます。また、脱塩カラムやHPLCが使用されている移動相のpHの中立性を確保するために注意を払わない限り、使用することができます。リガンドが過剰に使用されている場合、可能性緩和に影響を及ぼすことはありません余分な金属と過剰の配位子を除去するための重要な必要性がなくなりましたが、遊離のリガンドはそのまま残ります。その後のコンジュゲーション反応のために、この過剰なリガンドは、分離することが困難な不均一な複合体では問題と結果を指定できます。この問題、金属カンプを改善するlexisの複数形は、無水ジエチルエーテルから沈殿させることができるまたはHPLCは、過剰の配位子から金属錯体を分離するのに使用できます。理想的には、配位子と金属がなく、金属、またはリガンドベースの副産物で、その結果、1:1の割合で使用される。しかし、両方の出発原料のための元素分析は、各反応の前に必要とされる、および1:1リガンド - 金属の比から若干のずれがある場合、その後の反応はどちらかに分類されるリガンドの過剰または金属精製の必要性、その結果の過剰カテゴリ、。
結果として得られる複合体は、バイオコンジュゲーション15から17までの準備ができているところ我々は、メタル化を実証している。この戦略の代わりに、最初にメタル化18,19に続いて配位子と生体分子の結合です。この共役し、metalate戦略で、同じ要因がメタル化ルート（pH感受性と温度感受性生体分子のほか、塩から製品を精製する能力）を決める際に考慮する必要があります。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は感謝してウェイン州立大学（MJA）、研究（SMV）のエージングのためのアメリカ財団、国立研究所の生体イメージングとバイオの国立研究所から独立キャリアトランジション賞（R00EB007129）への経路からの助成金からのスタートアップ資金を認めるの健康（MJA）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EuCl3∙6H2O | Sigma-Aldrich | 203254-5G | |
| p-SCN-Bn-DTPA | Macrocyclics | B-305 | |
| ammonium hydroxide | EMD Millipore | AX1303-3 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester (CE) Dialysis Membrane - 500 D MWCO | Fisher Scientific | 68-671-24 | |
| Millipore IC Millex-LG Filter Units | Fisher Scientific | SLLG C13 NL | |
| xylenol orange tetrasodium salt | Alfa Aesar | 41379 | |
| acetic acid | Fluka | 49199 | |
| D2O | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-4-25 | |
| water purifier | ELGA | Purelab Ultra | |
| high performance liquid chromatography and mass spectrometry | Shimadzu Corporation | LCMS-2010EV | |
| relaxation time analyzer | Bruker Corporation | mq60 minispec | |
| UV-vis spectrophotometer | Fisher Scientific | 20-624-00092 | |
| freeze dryer | Fisher Scientific | 10-030-133 | |
| pH meter | Hanna Instruments | HI 221 | |
| spectrofluorometer | Horiba Instruments Inc | Fluoromax-4 | |
| Molecular Weight Calculator version 6.46 by Matthew Monr–, downloaded October 17, 2009 |  http://ncrr.pnl.gov/software/ |
Molecular Weight Calculator |
References
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