Summary
Oncolytic virus är lovande för cancerbehandling. Förmågan att ta reda på infectability av levande vävnadsprover från patienter före behandling är en unik fördel med denna terapeutiska strategi. Detta protokoll beskriver hur att behandla vävnad för
Abstract
Oncolytic virus (OVS) är nya behandlingar som selektivt replikera i och döda tumörceller 1. Flera kliniska studier som utvärderar effekten av olika oncolytic plattformar, inklusive HSV, Reovirus och Vaccinia OVS som behandling för cancer pågår 2-5. En viktig egenskap hos oncolytic virus är att de genetiskt kan modifieras för att uttrycka reporter transgener som gör det möjligt att visualisera infektion i vävnader genom mikroskopi eller bio-luminiscens bildbehandling 6,7. Detta ger en unik fördel eftersom det är möjligt att infektera vävnad från patienter ex vivo före behandling för att fastställa sannolikheten för en framgångsrik oncolytic virotherapy 8. I detta syfte är det viktigt att på lämpligt vävnadsprover för att kompensera för mjukpapper heterogenitet och bedömer vävnaden livskraft, särskilt före infektionen 9. Det är också viktigt att följa virusreplikationen med reportern transgener om det uttrycks av oncolytic plattformen samt genom direkt titrering av vävnader efter homogenisering för att diskriminera mellan misslyckade och produktiv infektion. Syftet med detta protokoll är att ta upp dessa frågor och här beskriver 1. Provtagning och beredning av tumörvävnad för cellodling 2. Bedömningen av vävnad livskraft använda metabola färgämnet Alamar blå 3. Ex vivo-infektion av odlade vävnader med vaccinia virus antingen uttrycker GFP eller eldfluga luciferas 4. Upptäckt av transgens uttryck genom fluorescensmikroskopi eller med hjälp av ett in vivo-Imaging System (IVIS) 5. Kvantifiering av virus av plack-analysen. Denna omfattande metod innebär flera fördelar, inklusive enkel vävnad bearbetning, ersättning för vävnad heterogenitet, kontroll av vävnad livskraft, och diskriminering mellan misslyckade infektion och ben fide virusreplikation.
Protocol
1. Tissue bearbetning
- För bästa resultat bör detta protokoll utföras med nyligen isolerade vävnad deponeras i DMEM media som innehåller 10% FBS, 1% Pennicilin / streptomycin lösning och 0,1% Amphothericin B-lösning omedelbart efter operation före bearbetning. Om detta inte är möjligt, kan vävnaderna lämnas över natten i detta medium på 4 grader före bearbetning.
- Innan behandling provet, sterilisera metall pincett och engångsblad genom att deponera dem i en 70% etanol i minst 5 minuter. Också förbereda en 24-brunnar med 2 ml DMEM media som innehåller 10% FBS, 1% Pennicilin / streptomycin lösning och 0,1% Amphothericin B.
- Samla vävnadsprovet i ett laminärt flöde cellkultur köksfläkten med steriliserad pincett och deponera vävnaden i en tom 15 cm petriskål, hålla locket på sidan, sterila uppåt.
- I cellodling huven, använd en 2 mm biopsi punch för att få olika kärnor från olika regioner i vävnaden som i Figur 1. Deponera kärnor i locket på 15 cm Petri med hjälp av pincett, lämnar tillräckligt med utrymme mellan varje kärna, så att de enkelt kan skära längs den horisontella axeln.
- Dela varje kärna i 4 till och med kvartal med ett steriliserat rakblad som i figur 1.
- Med hjälp av en pipett spets, satte varje kärna kvartal utifrån en given kärna i en annan väl från A1 till A4 som i figur 1, som redan innehåller 1,5 ml DMEM innehåller 10% FBS, 1% Pennicilin / streptomycin lösning och 0,1% Amphothericin B-lösning . Upprepa för varje kärna. Detta bör göra det möjligt representativt urval av tumören och samtidigt minimera bias i en viss brunn / tillstånd. För bättre representation, öka antalet kärnor.
2. Bedömning av vävnad livskraft
- Efter vävnad bearbetning, lägga 25μl Alamar blått väl # A1 och A2 # som visas i figur 1 och inkubera i 1 timme vid 37 grader i en fuktig kuvös med 5% CO 2.
- Efter inkubation med Alamar blå, ta bort 3 gånger 100 l från varje A1 och A2 väl och överföring till 6 olika brunnar i en 96-brunnar. Läs signalen med hjälp av en fluorescens plattläsaren (530 excitation, 590 utsläpp) och hålla informationen för din bokföring.
- Efter Alamar blå signal har lästs, överföra alla bitar av vävnad med hjälp av en pipett tips, från såväl A1 till C1 som innehåller DMEM, 10% FBS + PS + AmphoB. Var noga med att inte överföra en större mängd media från både A1.
- Infektera brunnar A3 och A4 respektive med 10 6 PFU av GFP-uttryckande och luciferas-uttryckande vaccinia virus utspädd i 25 l av media. Tja A2 kan vara smittad av ett virus som som uttrycker en viss transgen inklusive ingen alls.
- 72 timmar senare, tillsätt 25 l Alamar blå i brunnarna C1 och D1 och upprepar steg 2,2
3. Visualisering av GFP transgenen uttryck genom att BLOMNINGSTID mikroskopi
- Ta bort allt material cellodling täcker vävnaden bitar för att kunna ta bra fluorescens bilder.
- Med hjälp av en fluorescens-kompatibel dissektion mikroskop, först ta en bild faskontrast vid en lämplig upplösning
- Växla till fluorescens-läge och ta en bild med rätt filter för att visualisera transgenen av intresse, i detta fall GFP.
- Använd en fluorescens-filter för en annan våglängd så långt en möjlig från den transgenen av intresse (t.ex. RFP) för att ta en bild av bakgrundsfluorescens
4. Visualisering av luciferas uttryck med hjälp av en in vivo imaging System (IVIS)
- Se till att IVIS initieras innan du börjar.
- I brunnar A4 och B4, tillsätt 5 ìl av luciferin substrat 10 mg / ml, blanda väl och inkubera i 5 minuter i rumstemperatur.
- Ställ IVIS exponeringstiden till 5 sekunder och ta en bild på din brunnar. Om bilden är mättad, upprepa med lägre exponeringstid. Om det inte finns någon signal, öka exponeringstiden.
- Använda IVIS bildprogram kan du ta bort bakgrunden med hjälp av signalen från såväl B4 och välj regionen av intresse att kvantifiera luminiscens signalen.
5. Bedöma virala titrar av plack analys
- Innan kvantifiera virus-titrar måste vävnaderna först homogeniseras att släppa viruspartiklar. Detta kan göras flera månader senare i den infekterade vävnaden proverna förvaras vid -80
- Väg provet som måste homogeniseras med en analytisk skala. I detta fall kommer vi att använda prov som tagits på bra A2.
- Placera vävnaden är i en 5 ml polystyren rundbottnad falk rör och tillsätt 1 ml PBS. Homogenisera vävnaden med hjälp av en vävnad homogeniseringsapparat. Om det behövs, lagra homogenatet vid -80 för bedömning av viral titrar vid ett senare tillfälle.
- För att titer vaccinia virus, först tallrik 1 miljoner U2OS celler i en 6-brunnar och inkubera över natten i en 37 graders, 5% CO 2 fuktigaified inkubator så att de har nått cirka 95% confluency följande dag.
- Använd serum fria medier att göra spädningar av virus, och se till att byta tips mellan varje spädning steg. Normalt gör vi 1 av 10 spädningar och använda 100 l överföra till 900 l. Hur många spädningar görs beror på den förväntade viruset avkastning.
- Efter att göra spädningar, ta bort materialet som täcker pläterade U20S cellerna sedan lägga till 500 l utspädd virus lager (för varje utspädning) att infektera U2OS celler. Inkubera cellerna i 1 timme minuter vid 37 grader Celsius i en 5% CO 2 fuktad inkubator.
- Under denna tid värma upp 2 X koncentrerade DMEM innehåller 20% FBS och 3% CMC lösning i en 37 graders vattenbad.
- Efter 1 timme inkubation, ta bort materialet som täcker infekterade U2OS celler. Blanda 01:01 volymer av 3% CMC: 2X DMEM, 20% FBS tillsammans och använda 2 ml av denna blandning för att täcka varje brunn på infekterade U2OS celler.
- Sätt cellerna tillbaka i en 37 graders 5% CO 2 fuktas inkubator i ytterligare 48 timmar.
- Efter 48 timmar, tillsätt 2 ml metanol, ättiksyra fixativ ovanpå CMC överlägget i varje brunn och inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter i en cellkultur huva.
- Kasta fast overlay och tvätta resten bort av brunnarna med kranvatten.
- Fläck fast U2OS celler med 2 ml en coomassie blå lösning per brunn och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur i låg fart på en tallrik shaker.
- Ta bort coomassie fläcken från brunnarna och tvätta plattorna med kranvatten. Låt torka med locket på i ca en timme.
- Den resulterande virus plack kan enkelt visualiseras i figur 2C. Plattorna kan lagras på obestämd tid i detta skede.
- Räkna plack vid utspädning steg där mellan 10 och 100 plack är synliga.
- Multiplicera antalet plack räknas av använt utspädning och multiplicera den resulterande antalet med 2 för att ge en titer i PFU / ml. Till exempel, om 25 plack räknas i brunnen, där en miljon gånger utspädning användes, är titer av den ursprungliga outspätt prov 25 multiplicerat med 1 miljon multipliceras med 2 eller 50 miljoner PFU / ml. Ytterligare dividera detta tal med vikten initialt åtgärd för provet att rapportera titrarna i PFU / g
6. Representativa resultat:
För att korrekt bedöma om ett kirurgiskt erhållit normal / tumörvävnad provet är eller inte är smittbara med virus, måste man först säkerställa att vävnadsprov är minst lönsamma. Fig 1a visar att lönsamheten kan bedömas med hjälp av en metabolisk färgämne (Alamar blå) och att både normala och tumörvävnad kan vara metaboliskt aktiva under en period på minst 72h. Detta tyder på att vävnader odlade ex vivo kan stödja virusreplikation. En stor fördel med oncolytic virus är att de kan vara konstruerad för att uttrycka terapeutisk eller avbildning transgener. Fig. 2D-E visar att GFP eller luciferas kan detekteras från vävnader infekterade ex vivo, ytterligare stöder att dessa vävnader är livskraftiga och även smittbara. Trots ökad transgens uttryck förknippas i allmänhet med virusreplikation, betyder det inte nödvändigtvis motsvara ett produktivt virusets livscykel som leder till själv-amplifiering och spridning, vilket tros vara viktigt för terapeutisk aktivitet. Av denna anledning är det nödvändigt att avgöra om fler virus produceras än vad som användes för att först infektera vävnad. Fig. 2B visar att när virus kvantifiering av plack-analysen, är mer virus uppnås efter 72 timmar infektion måste vävnad samlas in direkt efter infektion. Sammantaget Dessa data visar att opereras censurerade tumörvävnad kan förbli livskraftiga i cellkultur under en period av minst 72 timmar, under vilken tid virusreplikation kan stödjas.
Figur 1. Översikt av vävnaden provtagning / snittning protokollet. Vävnadsprov behandlas genom att ta bort flera 2 mm hylsor som sedan är uppdelade i fyra kvarter som slumpmässigt fördelas i brunnar A1-A4. Färgkoderna anger reagenser som används i varje brunn. Den grå-skuggade rutor i brunnar representerar varje kvartal från 6 avbildade enskilda kärnor. Vävnaden i väl A1 överförs till en ny brunn (C1) med media efter den inledande Alamar blå läsning. En andra behandling görs vid slutet av 72 timmars inkubation med virus. Wells A4 och B4 kompletteras med luciferin efter 72 timmars inkubering post-infektion
Figur 2. Livskraft och infectability av patientens vävnadsprover. A) Tissue lönsamheten mätt som Alamar blå signal på 2 timmar och 72 timmar efter samling. Y-axeln visar den tomma korrigerade Alamar blå signal. B) titer mot vaccinia virussamlas in per gram vävnadsprover 2 och 72 timmar efter infektion. C) Exempel på vaccinia virus plaketter på U2OS celler efter coomassie färgning. D) Luminescence signal som erhålls från patient VV-luciferas-infekterad vävnad avbildas med IVIS. E) fluorescensmikroskopi bilder av patient vävnadsprov infekterad med VV-GFP.
Discussion
En av de kritiska stegen i det här protokollet är att få färsk vävnadsprov. Om provet tas i cellodling efter en lång väntan på operationssalen på ett olämpligt material (t.ex. PBS), kan denna kompromiss vävnad livskraft och förhindra infectability. Att notera är normal vävnad sig mer benägna att dessa effekter än tumörceller. En annan kritisk punkt är hur många kärnor används för att provsmaka vävnad och konsekvensen i deras storlek. Inkonsekvenser i storlek kommer att leda till variationer i patientprover eftersom faktorer som hypoxi och infectectable ytan kommer att variera beroende på storleken av kärnor och kvartalen kärna. Även om detta kan delvis lösas med hjälp av vävnad skärmaskiner, är en fördel med metoden som presenteras här att det är relativt lätt, mindre benägna att föroreningar och allmänt tillämpas på en mängd olika vävnadstyper, inklusive mjuka eller trögflytande vävnader som inte lätta till vävnad skivning. Framför allt kan antalet kärnor höjas för att få bättre vävnad representation. Dessutom kan kärnor skäras i fler bitar (t.ex. 5-8) för att rymma andra potentiella analyser göras parallellt, såsom DNA, RNA eller protein extraktion. Däremot kommer antalet bitar där kärnorna kan kapas till reproducerbara storlekar beroende på den faktiska storleken på kärnor, som kan ändras med hjälp av olika storlek corers. Alternativt, är ett sätt att hjälpa få reproducerbart stora vävnad bitar för att jämna ut längden på kärnor med hjälp av en linjal före ytterligare dela upp dem i mindre bitar. Protokollet kan naturligtvis ändras för att rymma andra virus och vi har funnit att vävnader kan vara livskraftig och stöd replikering för upp till 6 dagar. Protokollet kan utökas till mätningar av andra viralt-uttryckta transgener inklusive cytrokines. Efter infektion, kan vävnaderna också vara inbäddade i paraffin för vidare snittning och färgning av immunhistokemiska metoder som möjliggör en ökad förädling av vävnaden histologi och hur det förhåller sig på virusinfektion 10-12.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr Hesham Abdelbary för att ge människor kirurgiska preparat för de data som presenteras i figur 2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| Fetal Bovine Serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Amphothericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | Use at 0.1% |
| Pennicilin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Use at 1% |
| Alamar Blue | Invitrogen | DAL1025 | |
| D-Luciferin potassium salt | Molecular Imaging Products | D-Luciferin potassium salt 1g | Resuspend in PBS at 10 mg/ml and filter on 0.22 μm filter |
| MEM powder | GIBCO, by Life Technologies | #41500018 | Make in half the suggested volume to make 2X MEM and filter on 0.22 μm filter prior to use |
| Carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C9481 | Make a 3% solution in deionized water and autoclave. Note that powder can take some time to resuspend |
| Coomassie Brilliant Blue R | Sigma-Aldrich | B7920 | |
| 2 mm Biopsy punch | Miltex Inc. | MX-33-31 | |
| Double Edge Prep Blades | Personna Medical Care | 74-0002 | |
| Fluorescence disection Microscope | Leica Microsystems | model M205 FA | |
| In vivo imaging system (IVIS) | Caliper Life Sciences | IVIS® 200 series | |
| Tissue Tearor | Biospec Products | model 985370-395 |
References
- Parato, K. A., Senger, D., Forsyth, P. A., Bell, J. C. Recent progress in the battle between oncolytic viruses and cancer. Nat Rev Cancer. 5, 965-976 (2005).
- Renouf, L. C., Thway, K., Sibtain, A., McNeish, I. A., Newbold, K. L., Goldsweig, H., Coffin, R., Nutting, C. M. Phase I/II study of oncolytic HSV GM-CSF in combination with radiotherapy and cisplatin in untreated stage III/IV squamous cell cancer of the head and neck. Clin Cancer Res. 16, 4005-4015 (2010).
- Lal, R., Harris, D., Postel-Vinay, S., de Bono, J. Reovirus: Rationale and clinical trial update. Curr Opin Mol Ther. 11, 532-539 (2009).
- Park, B. H., Hwang, T., Liu, T. C., Sze, D. Y., Kim, J. S., Kwon, H. C., Oh, S. Y., Han, S. Y., Yoon, J. H., Hong, S. H., Moon, A., Speth, K., Park, C., Ahn, Y. J., Daneshmand, M., Rhee, B. G., Pinedo, H. M., Bell, J. C., Kirn, D. H. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial. Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).
- Breitbach, C. J., Reid, T., Burke, J., Bell, J. C., Kirn, D. H. Navigating the clinical development landscape for oncolytic viruses and other cancer therapeutics: no shortcuts on the road to approval. Cytokine Growth Factor Rev. 21, 85-89 (2010).
- Boeuf, F. L. e Synergistic interaction between oncolytic viruses augments tumor killing. Mol Ther. 18, 888-895 (2010).
- Silva, N. D. e, Atkins, H., Kirn, D. H., Bell, J. C., Breitbach, C. J. Double trouble for tumours: exploiting the tumour microenvironment to enhance anticancer effect of oncolytic viruses. Cytokine Growth Factor Rev. 21, 135-141 (2010).
- Diallo, J. S. A high-throughput pharmacoviral approach identifies novel oncolytic virus sensitizers. Mol Ther. 18, 1123-1129 (2010).
- Cooke, S. L. Intra-tumour genetic heterogeneity and poor chemoradiotherapy response in cervical cancer. Br J Cancer. , Forthcoming (2010).
- Pennington, K., Chu, Q. D., Curiel, D. T., Li, B. D. L., Mathis, J. M. The Utility of a Tissue Slice Model System to Determine Breast Cancer Infectivity by Oncolytic Adenoviruses. J Surg Res. , 1-6 (2010).
- Hochberg, M. Tropism of herpes simplex virus type 1 to non-melanoma skin cancers. Br J Dermatol. , Forthcoming (2010).
- Kuip, H. vander Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6, 86-86 (2006).
