Summary
biarsenical染料FlashとReAsHは、タンパク質のテトラモチーフに特異的に結合し、選択的に生細胞内のタンパク質にラベルを付けることができます。最近このラベリング戦略は、異なるタンパク質のコンフォメーションまたはオリゴマー状態のセンサーを開発するために使用されています。我々は、定量的に結合分析するためにラベルをつける方法とメソッドを説明します。
Abstract
蛍光タンパク質と色素が細胞内のタンパク質輸送、局在化と機能の研究に欠かせないツールです。このような緑色蛍光タンパク質（GFP）等の蛍光タンパク質は広く関心1のタンパク質の特性を追跡するために蛋白質に融合パートナーとして使用されているが、小さなタグと最近の進展は、このようなコンフォメーションの変化などの細胞で検査されるタンパク質の新しい機能を有効にすると蛋白質-関連2、3。一つの小さなタグでも、システムは生細胞に高い特異性と2を遺伝的にbiarsenical染料に結合する標的蛋白質、挿入テトラのモチーフ（CCXXCC）、ReAsH（赤色蛍光）とFLASH（緑色蛍光）を伴います。 TC / biarsenical染料のシステムは、コンフォメーション変化とタンパク質間相互作用4-7測定するためにいくつかの新しいアプローチを有効にしている蛍光タンパク質よりもホストのタンパク質へのはるかに少ない立体制約を提供しています。我々は最近、ハンチントン病7の神経細胞に凝集体を変異変異ハンチンチンを発現する細胞のオリゴマー化のセンサーとして、TCタグの新規な用途を開発した。ハンチンチンは、2つの蛍光色素、一つのタンパク質の場所を追跡するために蛍光タンパク質、及びだけモノマーのbiarsenical色素を結合する第二TCタグでタグ付けされた。したがって、タンパク質とbiarsenical染料の反応性との間の共局在の変化は、空間的に細胞内にマッピングする顕微鏡的オリゴマーのコンテンツを有効にする。ここでは、FlashやReAsH生哺乳動物細胞での方法、および2つの色の蛍光（チェリー/フラッシュ、CFP / / FlashやGFPを定量化すると蛍光タンパク質（チェリー、GFPまたはCFP）に融合されたTC -タグタンパク質を標識する方法について説明します。 ReAsHの組み合わせ）。
Protocol
1。 ReAsH / Flashで標識化するための細胞の調製
- 興味のある細胞株の標準的な細胞培養法を用いて、直接トランスフェクションのための準備ができて、ライブセルイメージングのスライドでの付着細胞の培養物を準備。
- 好みのトランスフェクション法にしたがって目的のプラスミドを含むTC -タグ付き遺伝子をトランスフェクション。
それは、TCのタグに特異的結合の程度を評価すると共焦点顕微鏡写真を収集し、チャネル間の蛍光のbleedthroughのために評価するために、ポジティブとネガティブコントロールを使用することが重要です。したがって、2つの色（例：Flash /チェリーまたはReAsH / CFPまたはReAsH / GFPの組み合わせ）のために、サンプルは、単一の色（例えば蛍光タンパク質単独で、または、可能であれば無蛍光灯とフラッシュ/ ReAsHだけにバインドされているTC -タグ融合タンパク質のために用意されていることを確認蛋白質）
- 1〜2日間トランスフェクション後、静かに300μL予め温めておいた（37℃）HBSSで細胞をリンス。
- 優しく温めておいたHBSSと10μMの1,2 - エタンジチオール（EDT）300μlで1μMのフラッシュ（またはReAsH）で細胞を浸す。
細胞にそれを追加するには、Flash / ReAsHを追加する前に、EDTを追加し、直前にバッファを作成することが重要です。 37℃で正確に30分間インキュベート組織培養インキュベーターでCを。我々の経験より長いインキュベーション時間が大幅にバックグラウンド蛍光を増加させる。新しい構文はまた時間およびFlash / ReAsH濃度（0.5-2μM）標識に最適化する必要があります。
- 静かに細胞から標識溶液を吸引し、300μL温めておいたHBSS + 37℃で15分間では250μM2,3 - dimercaptopropanol（BAL）と交換してください
- 穏やかな吸引により溶液を洗浄し、300μL温めておいたHBSSで置き換える取り外します。
我々は、これは非特異的biarsenical色素の蛍光を増大させることを発見したが、この洗浄後、細胞は、（3.2％溶液で15分間）パラホルムアルデヒドで固定してもよい。したがって、私たちは通常、画像の細胞は、室温で生活しています。 （ラベリングの前に細胞を固定がbiarsenical色素の結合を妨げることに注意してください。）
2。イメージング共焦点顕微鏡で細胞
- 共焦点顕微鏡では、画像の個々の蛍光物質（表1参照）のパラメータを設定し、チャネル間の無視bleedthroughがあることを確認してください。これは、蛍光用のそれぞれ異なる蛍光取得の設定に対して、個々の蛍光物質を（コントロールサンプルで）チェックすることによって達成することができます。発光波長範囲を調整することで（これはまた、信号/ノイズを低減することができます）bleedthroughを最小限に抑えることができます。
- また、サンプル中の最大蛍光は検出器を飽和させないように光電子増倍管の設定を調整します。 （これは、SP2ライカ共焦点でQ - LUTの設定値を用いて検出することができる）。かつて最高のイメージング設定が決定されている、サンプル間のそれらのいずれかを変更しないでください。
- 我々は一般的に使用するその他の設定は、（これらを最適化することができますが）200Hzのスキャン率であり、4行の平均値と1エアリーユニットのピンホール径を収集する。ピンホールの直径は、信号/雑音が問題となる場合、しかし、これは画像の一部失われる可能性が拡大することができます。
- 可能であれば12ビット（またはそれ以上）の形式で共焦点画像を収集する。 12ビットのフォーマットは8ビット（0〜255）より各ピクセルの輝度値（0〜4095）の広いダイナミックレンジをキャプチャします。これは定量的なデータ分析の質を最大にする、最も豊富なデータセットが記録されることを保証するために重要です。
- 蛍光タンパク質のチャンネル（チェリー、GFPまたはCFP）のため、また、全てのサンプルに対してbiarsenical色素のチャンネル（FlashまたはReAsH）の画像を収集する。
3。データの分析
- お使いのコンピュータ8日にソフトImageJをインストールします。 http://rsbweb.nih.gov/ij/
- ImageJのバージョンが以下のプラグインを持っていることを確認してください：
- オープンImageJの、そしてv1.32cよりも古いバージョンを使用している場合は、複数の画像を一度に（別のファイルをクリックしながらコントロールのボタンを押しながら行うことができる）で開くことができるようにするには、次のオプションをクリックしてください：
- ImageJの関心の画像を開きます。
ImageJは自動的に別々にそれぞれの画像の画面上に表示される最大値と最小値の画素の強度を定義します。別の画像は、dがあることを考えるとifferentピクセルの強度、これは見たときに表示される画像は比較できないことを意味します。 - 開かれたイメージが同じスケールですべてであることを保証するためには、物理的に（いくつかの他のソフトウェアの場合のように、これは画像の実際のデータの内容は変更されません）見られるように、上下のピクセルの強度を定義することができます。これらの値は、以下のメニューで設定することができます。
- 別のアプローチは、一つのファイルにまとめ、すべての画像を置くと自動的に同じスケールに（表示用）スタック内のすべての画像を拡大縮小されるスタックで動作するようです。データを操作する最も簡単な方法は、スタックの各チャンネルに変換することです。このように、蛍光タンパク質のチャネルに示すようにスタックにすべて変換します。あなたは簡単にタイトルに共通の名前（例えば"CH00"）を含むすべての画像を積み重ねることによって片方のチャンネルを選択することができます。
- 今分析のために8ビットに開いているすべての画像を変換する。これは実際には0〜255の範囲（8ビットを定義します）に表示範囲を再スケーリングされます。
重要 ：オリジナルの12ビット（またはそれ以上）の形式上の保存するか、またはあなたが情報の内容を失うことにしないでください。このフォーマットは、数字などを作るのに便利ですので、一部のソフトウェアパッケージが唯一の8ビット画像を表示できることに注意してください
- "8ビットの変換""名前を付けて保存..."オプションを使用して、という名前の新しいフォルダにコピーを保存します。
- 画像全体にbiarsenical色素の結合の程度を調べるために一つの方法は、ピクセル輝度の相関プロットを実行することです。これはプロット番目のチャネルの対応するピクセル値に対する相対的な一つのチャネル内のすべてのピクセル値を。結合高がある場合したがって、CFPの蛍光の高画素の位置はまたReAsH蛍光に高くなります。
- 共同相関ピクセルを解析するために、8ビットのReAsHとセルリアン/ GFP画像はImageJので開いていることを確認してください。
- 以下に示すように、"画像相関器"プラグインを開きます。 ReAsHまたはFlashスタックと蛍光タンパク質のスタックとして"画像2"として"画像1"を選択します。
- 結果としてスタックは詳細情報が表示されないことがあります - これは正常です。 "散布図"と呼ばれる新しいフォルダにスタックを保存し、それが参照するサンプルと同じファイル名を（例えば、"FLASH -桜の相関プロット"）与える
- 意味のあるデータを表示するには、2つのオプションのいずれかを行うことができます。最初にログの形式になるようにデータを変換する。その後、視覚的に次のようにデータを再スケーリング：
- また、あなただけの低い値（例えば1〜255）を表示し、特別なLUTを使用してデータを表示するために視覚的にデータを再スケーリングすることができます。LUT（ルックアップテーブル）イメージの各ピクセル値に割り当てられている色のテーブルを表します。これは、画像の擬似カラースキームを定義するために使用し、画像内の特定の機能を定義する場合に便利ですできます。 "LUTエディタ"上のカスタムLUTをクリックして作成すると示されているもの（これを保存して後で使うことができます）などの新しいものを作る。
- 0から255までの明るさ/コントラストの範囲を（上記の手順13で説明）を設定します。画面上に示されているのようにイメージ"でロックする"ために、画像は各ピクセルの赤、緑、青の各8ビットの値を保存RGBフォーマットに変換することができます。
他のプログラムへ画像をコピー＆ペーストするには、最初の8ビットまたは16ビットの画像を開きます。上記の手順14で説明したように、画像のLUTのカラースキームを割り当てます。 CFPについては、下記のように"シアン"LUTを割り当てる...
- イメージを選択し、クリップボードにコピーする、を選択...
4。代表的な結果：
biarsenical色素で標識する細胞の成功は、いくつかの重要なパラメータに依存しています。最初に、染料でラベルのタイミングが重要です。我々は発見したそのラベルの長時間（30分以上）非特異的バックグラウンド染色の高レベルの結果。図1は、以前に7を説明するようにTCのタグを含むCFP派生セルリアンに融合したハンチンチン断片（25Q）の野生型形態の典型的な結果を示しています。このサンプルはReAsHで30分間染色し、最小限の背景には、TCタグを欠く試料に存在した。我々は、メタノールで固定しながらパラホルムアルデヒドの増加の背景を持つ細胞を固定する蛍光タンパク質タグの蛍光をabrogatesことを発見した。したがって、可能であれば、細胞が生きる我々がイメージ。また、その前固定に注意することが重要ですbiarsenical色素で標識することはおそらくTCモチーフの変更にともなってそれらの結合を防ぎます。
一貫性のある結果を得るためのもう一つの重要な要素は、細胞の密度です。我々は、大まかに大規模な塊が別々のセルにbiarsenical染料の不均一な染色につながることも、分散している画像の細胞にそれが重大な発見した。
図1。テトラタグとハンチンチン（exon1 - 25Q） -セルリアン融合でトランスフェクトした生細胞におけるReAsH染色。 TCタグは、ハンチンチン-セルリアン融合（7に記載のように）の合流点に位置しています。ピクセル強度の相関プロットは、セル全体結合ReAsHの違いにアセスメントを可能にし、コンホメーション変化またはリガンドの相互作用による結合ReAsHの変化をマッピングするために使用することができます。
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Discussion
第二の色素と蛍光タンパク質とコンホメーション特性を持つラベルのタンパク質局在化へのアプローチは、タンパク質の異なるコンフォメーションは、細胞やタンパク質の立体構造のダイナミクスを変更するイベントに積算どこにマッピングするための多くの潜在的な提供しています。 ReAsH /フラッシュは、最初の哺乳類細胞内レチノイン酸結合タンパク質I 4のタンパク質の折り畳みのために、セルセンサーとして使用されていました。この例では、細胞内レチノイン酸結合タンパク質に設計TCのタグにバインドされているFlashは、私が展開したフォームからの相対折り畳まれた形の蛍光収率を減少していた、と折りたたみはE.で追跡することができます大腸菌細胞。さらに最近ではタンパク質の折りたたみと自己会合は、二部テトラのディスプレイ6で、モデル蛋白質で実証された。この例では、モデルペプチド上遠位dicysteineペアはdicysteineのペアを含む2つのペプチドの、または結合biarsenical染料のために機能的なテトラのモチーフを再構成するペプチドの折り畳みによって結合時に近接に持ち込まれた。我々は、すべてのオリゴマーの形態7のbiarsenical色素の結合から閉塞になるTCタグにより、オリゴマーからモノマーを区別するセンサーを開発することにより、さらに一歩このアプローチを取りました。
TCタグとコンホメーション変化との関連付けの記者としてbiarsenical染料の可能性にもかかわらず、方法論はベースラインのバックグラウンド蛍光9の結果として、蛍光タンパク質に比べて比較的低信号/ノイズ信号を持って苦しんでいる。したがって、コンフォメーションセンサーを開発する努力で、そのような13アミノ酸ペプチド配列3にクマリン誘導体をコンジュゲートエンジニアリング蛍光団リガーゼシステムとして開発されている他の新しいラベリング手法、のいくつかをテストする価値はあります。
ここで紹介する解析は、細胞の違いの中で目的のタンパク質にReAsH / Flashの結合で発生場所を調べるためにさらに拡張することができます。これを行うには、画像が関心領域（ROI）を作成し、イメージの異なる部分を（これはすべてのImageJで行うことができます）フィルタリングするためのマスクに変換することで、サブ領域に分割することができます。したがって、ピクセル強度のプロットを比較することによって、それは統計的にセンサーを用いて細胞内の小地域間の差異を評価することができるはずです。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、DMHとTDM（NHMRCプロジェクトの助成金）への補助金によって賄われていた。 DMHはMiegunyahトラストが資金提供グリムフェロー、です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
References
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