Summary
biarsenical染料Flash和ReAsH特异性结合蛋白质tetracysteine图案，并在活细胞中的蛋白质可以选择性地标签。最近这个标签的战略已被用于开发传感器用于不同的蛋白质的构象或低聚国家。我们描述了标签的方式和方法，定量分析具有约束力。
Abstract
荧光蛋白染料是蛋白质贩运，本地化和细胞的功能研究的重要工具。虽然荧光蛋白，如绿色荧光蛋白（GFP）已被广泛应用于蛋白质作为融合伙伴跟踪与较小的标签启用新功能的蛋白质，在构象改变，如细 胞研究的利息1蛋白的性质，最近的事态发展和蛋白质协会2，3。一个小标签系统涉及tetracysteine 的主题（CCXXCC）基因插入到目标蛋白质，其中结合biarsenical染料，ReAsH（红色荧光）和Flash（绿色荧光），特异性高，即使是在2活细胞。 TC / biarsenical染料系统提供宿主蛋白的荧光蛋白比，这使一些新的方法来衡量的构象变化和蛋白质的相互作用4-7远不如立体的约束。我们最近开发的传感器齐聚细胞表达突变亨廷顿在一个新颖的TC标签应用程序发生突变时，聚集在神经元在亨廷顿病7。亨廷顿是两个荧光染料，荧光蛋白跟踪蛋白的位置，第二一个TC标签，它仅在单体结合biarsenical染料标记。因此，蛋白质和biarsenical染料反应之间的共定位的变化，使细胞内的空间映射微观低聚物含量。在这里，我们描述如何标注训练班标签蛋白融合在生活的哺乳动物细胞的FLASH或ReAsH和如何量化两色荧光（樱桃/ FLASH，CFP / Flash或GFP /荧光蛋白（樱桃，GFP或CFP） ReAsH组合）。
Protocol
1。细胞的制备与ReAsH / FLASH标签
- 使用标准的细胞培养方法，为您感兴趣的细胞株，准备直接在一个活细胞成像幻灯片的转染贴壁细胞培养。
- 转染质粒TC利息根据您所选择的转染法标记的基因。
注意：重要的是使用阳性和阴性对照，以评估特异性结合的程度，TC的标签和通道之间的荧光bleedthrough评估时，收集共焦显微。因此，两种颜色（如Flash /樱桃或ReAsH / CFP或ReAsH / GFP组合），确保样品为单一颜色（如荧光蛋白单独或如果可能的话一个TC -标记蛋白结合FLASH / ReAsH但没有荧光准备蛋白质）
- 转染后一到两天，轻轻300μL预热（37℃）的HBSS冲洗细胞。
- 轻轻浸入1微米闪存（或ReAsH）在300μL预热的HBSS和10μM1,2 - ethanedithiol（EDT）细胞。
添加东部时间之前，先加入FLASH / ReAsH和缓冲区前将它添加到的细胞，它是重要的。整整30分钟的孵育37 °组织彗星文化的孵化器。在我们的经验，潜伏期较长时间显着增加的背景荧光。新的结构也应优化标签的时间和闪存/ ReAsH浓度（0.5-2μM）。
- 轻轻吸出，然后更换标签解决方案，从细胞，用300μL预热的HBSS + 250微米2,3 - dimercaptopropanol（BAL）为15分钟，在37 ° C。
- 温柔的愿望，取出洗净的解决方案，并取代用300μL预热的HBSS。
在此之后洗净，可固定细胞多聚甲醛（3.2％溶液15分钟），虽然我们已经发现，这会增加非特异性biarsenical染料的荧光。因此，我们通常形象的细胞住在室温下。 （注，固定细胞前标签防止biarsenical染料结合。）
2。共聚焦显微镜成像的细胞
- 在共聚焦显微镜，成立成像（见表1）单个荧光团的参数，并确保有之间的通道可以忽略不计bleedthrough。这样就可以实现通过检查单个荧光团（对照样品），对每个不同的荧光的荧光收购设置。调整发射波长范围，可有助于减少bleedthrough（虽然这也可以减少信号/噪声）。
- 还可以调整设置，使样品中的最大荧光不饱和探测器的光电倍增管。 （这可以使用的Q - LUT的设置上SP2徕卡共聚焦检测）。一旦确定了最佳的成像设置，不改变他们之间的任何样品。
- 我们通常使用的其他设置（虽然这可以优化）是一个200赫兹的扫描速度，并收集4号线的平均值和一个针孔的直径1艾里单位。如果信号/噪音是一个问题，不过，这可能导致一些损失的成像，针孔的直径可扩展。
- 如果可能的话，收集12位（或更高）格式的共聚焦图像。 12位格式捕捉的每个像素点的亮度值（0-4095）的动态范围大于8位（0-255）。这一点很重要，以确保最富有的数据集的记录，从而最大程度的定量分析数据的质量。
- 收集荧光蛋白通道（樱桃，GFP或CFP），也为biarsenical染料通道对所有样品（闪存或ReAsH）的图像。
3。数据分析
- 第八您的计算机上安装软件ImageJ。 http://rsbweb.nih.gov/ij/
- 确保您的ImageJ版本有以下插件：
- 打开ImageJ，如果使用比v1.32c旧版本，请点击下列选项，使多个图像在同一时间（可以通过按住控制按钮，当你点击不同的文件）打开：
- 打开ImageJ感兴趣的图像。
ImageJ将自动定义的最高和最低分别为每幅图像的屏幕上显示的像素强度。 由于不同的图像将有different像素的强度，这意味着作为观看，显示的图像不具有可比性。 - 为了确保打开的图像上同等规模的，您可以物理定义上，较低的像素强度来看待（这是不会改变图像的实际数据内容将在其他一些软件的情况下）。这些值可以设置在以下菜单：
- 另一种方法是栈，汇集成一个文件，把所有的图像，并会自动调整（只供观看）在栈中的所有图像同等规模的工作。工作与数据最简单的方法是把每个通道堆栈。因此，转换荧光蛋白通道的所有协议栈，如图所示。您可以轻松地选择一个通道，通过堆叠的所有图像标题中含有一个共同的名字（例如，“CH00”）。
- 现在所有打开的图像转换为8位，以供分析。这实际上是将重新调整成一个0-255范围内（定义8位）的观看范围。
要点 ：不要超过原来的12位（或更高）格式保存，不然就会失去信息内容。请注意，一些软件只能显示8位的图像，所以这种格式用于数字等
- 所谓“8位转换”选项“另存为...”一个新的文件夹中保存的副本。
- 检查biarsenical染料结合在一个整体形象的程度的一种方法是执行一个像素强度的相关情节。这地块每一个通道，相对于在第二个通道的相应像素值的像素值。因此一个像素高CFP荧光的位置也将在ReAsH荧光，如果有高结合。
- 分析像素的合作相关，确保8位ReAsH和蔚蓝/ GFP图像ImageJ开放。
- 打开“图像相关”插件，如下所示。选择作为ReAsH或Flash栈和“较受欢迎”的荧光蛋白栈“我们无法找到您所查找的内容”。
- 导致堆栈可能不会显示任何详细信息 - 这是正常的。堆栈保存在一个新的文件夹称为“散点图”，并给它作为样品的相同的文件名，它是指（如“樱桃FLASH相关情节”）
- 要查看数据有意义，你可以做以下两个选项之一。首先转换数据，以便它在日志格式。然后以可视重新调整数据如下：
- 或者，您可以直观地重新调整的数据，仅显示较低的值（如255），并显示数据，使用一个特殊的LUT。LUT（查找表）表示，被分配在图像的每个像素值的颜色表这可以用来定义一个图像的伪彩色计划是用于定义图像中的某些功能。要创建一个自定义的LUT单击“LUT的编辑器”，使一个如所示（这可以被保存并用于以后）一个新的。
- 设置范围从0-255的亮度/对比度（如上述步骤13所述）。 “锁定”在屏幕上显示的图像，图像可以转换为RGB格式，从而节省了为每个像素的颜色，红色，绿色和蓝色的8位值。
复制并粘贴到其他程序的图像，首先开放的8位或16位图像。由于在第14步以上所述，指定图像的LUT的配色方案。对CFP，分配如下所述的“青色”的LUT ...
- 选择图像，并把它复制到剪贴板，选择...
4。代表性的成果：
biarsenical染料标记细胞的成功是依赖于几个关键参数。首先，标签与染料的时间是至关重要的。我们发现，长时间的标签（30分钟以上），在一个高层次的非特异性背景染色的结果。图1显示了一个典型的结果为野生型亨廷顿片段的形式融合到CFP衍生蔚蓝，包含一个TC标签， 描述以前7（25Q ）。这个范例是染色与ReAsH 30分钟，并有最小的背景在缺乏TC标记的样本。我们发现，固定与多聚甲醛增加背景的细胞，而用甲醇固定废除荧光蛋白标记的荧光。因此，在可能的情况下，我们的形象细胞活。重要的是还注意到，固定前biarsenical染料标记，防止它们的结合，可能是因为训练班图案的修改。
一致的结果的另一个关键因素是细胞的密度。我们发现它的关键松散地分布，还广泛聚集可以导致不平衡，在不同的细胞biarsenical染料染色的细胞图像。
图1。Tetracysteine 标签和ReAsH在亨廷顿（exon1 - 25Q）蔚蓝的融合与转染活细胞染色。 TC标记是位于亨廷顿的蔚蓝融合的交界处（7） 。像素强度的相关情节，使评估ReAsH整个细胞具有约束力的差异，可以用来映射ReAsH的变化结合构象变化或配体的相互作用。
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Discussion
一种荧光蛋白和第二个染料的构象属性的方法来标记蛋白定位提供了潜在的映射不同的构象的蛋白质在细胞和改变蛋白质构象的动态的事件累积。 ReAsH / FLASH首次用于哺乳动物细胞视黄酸结合蛋白， 我 4折叠的蛋白质在细胞传感器作为。在这个例子中，绑定到一个TC标签的FLASH设计到细胞视黄酸结合蛋白，我减少了在折叠的形式展开的形式相对荧光量子产率，可以在大肠杆菌中进行跟踪和折叠大肠杆菌细胞。最近蛋白质折叠和自我关联模型蛋白被证明在双边tetracysteine 显示6。在这个例子中，模型肽远端dicysteine对被带进靠近后两个含有dicysteine对的肽具有约束力，或由一种肽，重组一个有约束力的biarsenical染料功能tetracysteine图案的折叠。我们采取这种做法，通过开发不同的传感器，由于TC的标签从低聚物单体一步成为闭塞biarsenical染料结合在所有 7个低聚形式。
尽管潜在的TC标签和构象变化和结社记者biarsenical染料，这种方法受到了一个比较低的信号/噪声信号，而作为基线背景荧光9荧光蛋白。因此，在努力发展构型传感器，测试一些其他新的标签正在开发的方法，如一个精心设计的，一个13个氨基酸的肽序列共轭香豆素衍生物的荧光团连接酶系统，这将是值得的。
这里提出的分析，可以进一步扩展，研究细胞内的差异，在ReAsH / FLASH的结合蛋白发生。要做到这一点，图像可以被划分到分区域，创建感兴趣区域（ROI），并把它们转换成口罩，过滤图像的不同部分（这都可以在ImageJ）。因此，比较的像素点的亮度地块，应尽可能利用细胞内的传感器次区域之间的差异进行统计评估。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由DMH和TDM（NHMRC项目赠款）的赠款。 DMH是Grimwade研究员，由Miegunyah信托基金资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
References
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