Summary
Die biarsenical Farbstoffe Flash und ReAsH binden spezifisch an Tetracysteinmotiv Motive in Proteinen und kann wahlweise Label Proteine in lebenden Zellen. Kürzlich diese Kennzeichnung Strategie wurde verwendet, um Sensoren für verschiedene Proteinkonformationen oder oligomeren Zustände zu entwickeln. Wir beschreiben die Label-Ansatz und Methoden zur quantitativen Analyse bindend.
Abstract
Fluoreszierende Proteine und Farbstoffe sind wesentliche Instrumente für die Untersuchung von Protein Menschenhandel, Lokalisation und Funktion in Zellen. Während fluoreszierende Proteine, wie zB grün fluoreszierendes Protein (GFP) wurden intensiv als Fusionspartner an Proteine verwendet werden, um die Eigenschaften eines Proteins von Interesse 1, die jüngsten Entwicklungen bei kleineren Tags ermöglichen neue Funktionalitäten von Proteinen in Zellen wie Konformationsänderung untersucht werden track und Protein-Vereins 2, 3. Ein kleiner Tag-System beinhaltet eine Tetracysteinmotiv Motiv (CCXXCC) genetisch in ein Zielprotein, das biarsenical Farbstoffe bindet eingefügt, ReAsH (rote Fluoreszenz) und Flash (grün fluoreszierend), mit hoher Spezifität auch in lebenden Zellen 2. Die TC / biarsenical Farbstoff-System bietet weit weniger sterische Einschränkungen an den Host-Protein als fluoreszierende Proteine, die mehrere neue Ansätze ermöglicht hat, Konformationsänderung und Protein-Protein-Interaktionen 4-7 messen. Wir haben vor kurzem eine neuartige Anwendung des TC tags als Sensoren der Oligomerisierung in Zellen, die mutierte Huntingtin, die, wenn mutierte Aggregate in Neuronen in Huntington-Krankheit 7. Huntingtin wurde mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen, einer ein fluoreszierendes Protein zu Protein Ort zu verfolgen und die zweite ein TC-Tag, das bindet nur biarsenical Farbstoffe in Monomeren getaggt. Daher aktiviert Veränderungen in Kolokalisation zwischen Protein und biarsenical Farbstoff Reaktivität submikroskopischen Oligomergehalt räumlich innerhalb von Zellen abgebildet werden. Hier beschreiben wir, wie TC-markierte Proteine fusioniert an ein fluoreszierendes Protein (Cherry, GFP oder GFP) mit Flash oder ReAsH in Live Säugetierzellen und wie die beiden Farben-Fluoreszenz (Cherry / Flash, CFP / Flash oder GFP / quantifizieren Label ReAsH Kombinationen).
Protocol
1. Vorbereitung der Zellen für die Kennzeichnung mit ReAsH / Flash
- Mit Standard-Zellkultur-Methoden für Ihre Zelllinie von Interesse, bereiten eine Kultur von adhärenten Zellen direkt in einem Live Cell Imaging Rutsche bereit für die Transfektion.
- Transfizieren Ihre Plasmid TC-markierten Gen von Interesse nach Ihren Transfektion Methode der Wahl.
Hinweis Es ist wichtig, um positive und negative Kontrollen nutzen, um das Ausmaß der spezifischen Bindung an den TC tags zu bewerten und für Übersprechen der Fluoreszenz zwischen den Kanälen zu beurteilen, wenn das Sammeln konfokalen Aufnahmen. Daher ist für zwei Farben (zB Flash / Cherry oder ReAsH / CFP oder ReAsH / GFP-Kombinationen), sicherzustellen, Proben für die einzelnen Farben (z. B. fluoreszierende Protein allein oder wenn möglich ein TC-markierte Protein gebunden Flash / ReAsH aber ohne fluoreszierende bereit sind, Protein)
- Ein bis zwei Tage nach der Transfektion, sanft waschen Sie die Zellen mit 300 ul vorgewärmte (bei 37 ° C) HBSS.
- Sanft tauchen die Zellen mit 1 uM Flash (oder ReAsH) in 300 ul vorgewärmtes HBSS und 10 uM 1,2-Ethandithiol (EDT).
Es ist wichtig, EDT hinzufügen, bevor Hinzufügen von Flash / ReAsH und machen den Puffer kurz vor Zugabe zu den Zellen. Inkubieren genau 30 min bei 37 ° C in Gewebekultur-Inkubator. Nach unseren Erfahrungen längere Inkubationszeiten erhöht die Hintergrundfluoreszenz. New Konstrukte sollte auch für die Kennzeichnung Zeit und Flash / ReAsH Konzentration (0.5-2 nM) optimiert werden.
- Vorsichtig absaugen Kennzeichnung Lösung von Zellen und ersetzen Sie dann mit 300 ul vorgewärmtes HBSS + 250 uM 2,3-Dimercaptopropanol (BAL) für 15 min bei 37 ° C.
- Entfernen Sie Waschlösung durch leichtes Ansaugen und ersetzen mit 300 ul vorgewärmtes HBSS.
Nach diesem Waschen, können die Zellen mit Paraformaldehyd (15 min mit 3,2% ige Lösung) fixiert werden, obwohl wir festgestellt, dass diese unspezifischen biarsenical Farbstofffluoreszenz erhöht haben. Daher haben wir in der Regel Bild der Zellen leben bei Raumtemperatur. (Beachten Sie, dass die Fixierung der Zellen vor der Markierung verhindert biarsenical Farbstoff verbindlich.)
2. Imaging die Zellen auf einem konfokalen Mikroskop
- Auf dem konfokalen Mikroskop eingestellten Parameter für die Abbildung der einzelnen Fluorophore (siehe Tabelle 1) und stellen Sie sicher, dass es unerheblich ist Übersprechen zwischen den Kanälen. Dies kann durch Überprüfung einzelner Fluorophore (in Kontrollproben) gegeneinander verschiedenen fluoreszierenden Erwerb Einstellung für die Fluoreszenz erreicht werden. Einstellen der Emission Wellenlängenbereich kann helfen, Übersprechen zu minimieren (obwohl dies auch zu einer Verminderung des Signal / Rausch).
- Auch passen die Photomultiplier so, dass die maximale Fluoreszenz in der Probe nicht in die Sättigung des Detektors. (Dies kann unter Verwendung des Q-LUT-Einstellung auf dem SP2 Leica konfokalen werden). Nachdem die besten Bildeinstellungen sind entschlossen, nicht ändern, jeder von ihnen zwischen den Proben.
- Andere Einstellungen, die wir verwenden in der Regel (obwohl diese optimiert werden können) werden mit einer Abtastrate von 200 Hz und sammeln 4 Zeilen Durchschnittswerte und einer Lochkamera Durchmesser von 1 Airy Einheit. Der Durchmesser der Blende kann erweitert werden, wenn das Signal / Rausch ist ein Thema, jedoch kann dies in einem gewissen Verlust von bildgebenden Folge sein.
- Sammeln Sie die konfokalen Bilder in 12-bit (oder höher)-Format, wenn möglich. 12-Bit-Format erfasst einen größeren Dynamikbereich von Werten (0-4095) für jedes Pixel die Intensität als 8-Bit-(0-255). Dies ist für die Gewährleistung der reichsten Datensatz aufgezeichnet wird, die maximale Qualität der quantitativen Datenanalyse wichtig.
- Sammeln Sie Bilder für das fluoreszierende Protein-Kanal (Cherry, GFP oder GFP) und auch für die biarsenical Farbstoff-Kanal (Flash oder ReAsH) für alle Proben.
3. Die Analyse der Daten
- Installieren Sie die Software ImageJ auf Ihrem Computer 8. http://rsbweb.nih.gov/ij/
- Stellen Sie sicher, dass Ihre Version von ImageJ die folgenden Plugins hat:
- Öffnen ImageJ, und wenn Sie eine ältere Version als v1.32c, auf der folgenden Optionen klicken, damit mehrere Bilder auf einmal (das kann bei gedrückter Control-Taste erfolgen, während Sie auf anderen Dateien) geöffnet werden:
- Öffnen Sie die Bilder von Interesse in ImageJ.
ImageJ wird automatisch die maximale und minimale Pixelintensitäten die auf dem Bildschirm für jedes Bild einzeln angezeigt werden. Da die verschiedenen Bilder werden d habenUNTERSCHIEDLICHE Pixelintensitäten bedeutet dies, die angezeigten Bilder sind nicht vergleichbar, wie angesehen. - Um sicherzustellen, dass die geöffneten Bilder sind alle im gleichen Maßstab, können Sie physisch definieren die obere und untere Pixelintensitäten zur Ansicht (dies ändert nichts an der eigentlichen Dateninhalt der Bilder als wäre der Fall in eine andere Software sein). Diese Werte können unter folgenden Menü eingestellt werden:
- Ein alternativer Ansatz ist es, mit Stapeln, die alle Bilder stellt zusammen in einer Datei und wird automatisch skaliert (zum Anschauen) alle Bilder im Stapel auf die gleiche Ebene zu arbeiten. Der einfachste Weg, mit den Daten arbeiten ist für jeden Kanal, um einen Stapel zu konvertieren. So für das fluoreszierende Protein-Kanal alle konvertieren zu stapeln, wie dargestellt. Sie können wählen Sie einen Kanal durch das Stapeln alle Bilder mit einem gemeinsamen Namen (zB "CH00") in den Titel.
- Nun wandeln Sie alle geöffneten Bilder in 8-Bit für die Analyse. Dies wird tatsächlich skalieren die angesehen Bereich in einen Bereich 0-255 (die definiert 8-bit).
WICHTIG: Speichern Sie keine über den ursprünglichen 12-Bit (oder höher)-Format oder finden Sie Informationen zu verlieren. Beachten Sie, dass einige Software-Pakete kann nur 8-Bit-Bildern ist dieses Format ist nützlich, um Zahlen etc.
- Speichern Sie eine Kopie in einen neuen Ordner namens "8-Bit umgewandelt" mit der Option "Speichern unter ...".
- Eine Methode, um das Ausmaß der biarsenical Farbstoffbindung in ein ganzes Bild zu untersuchen ist, eine Pixelintensität Korrelationskurve durchzuführen. Diese Grundstücke jeder Pixelwert in einem Kanal gegenüber dem entsprechenden Pixelwert in einem zweiten Kanal. Daher ist eine Pixel-Position hoch in GFP-Fluoreszenz wird auch hoch in ReAsH Fluoreszenz, wenn es hoch bindend.
- Zur Analyse der Pixel-co-Korrelation, sicherzustellen, dass die 8-Bit-ReAsH und Cerulean / GFP Bilder in ImageJ öffnen.
- Öffnen Sie die "Bild Correlator" plugin wie unten angegeben. Wählen Sie "Image1", wie die ReAsH oder Flash-Stack und "Image2", wie das fluoreszierende Protein Stack.
- Die daraus resultierende Stapel kann nicht angezeigt werden, alle Informationen - das ist normal. Speichern Sie die Stapel in einen neuen Ordner namens "Streudiagramme" und geben Sie ihm den gleichen Dateinamen wie die Probe es sich bezieht (zB "Flash-Kirsche Korrelationskurve")
- Um die Daten sinnvoll Sie tun können, eine der beiden Optionen. Erste Transformation der Daten, so dass es in log-Format ist. Dann visuell skalieren die Daten wie folgt:
- Alternativ können Sie die Daten visuell neu zu skalieren, dass nur geringe Werte (zB 1-255) und die Daten mit einem speziellen LUTs. Eine LUT (Look Up Table) stellt eine Tabelle von Farben, die zu jeder Pixelwert in einem Bild zugeordnet werden . Dies kann eine Falschfarben-System um ein Bild zu definieren und ist nützlich für die Definition bestimmter Merkmale in einem Bild. Um eine benutzerdefinierte LUT klicken Sie auf "LUT Editor" erstellen und einen neuen, wie oben gezeigt (diese können gespeichert und genutzt werden später auf).
- Stellen Sie die Helligkeit / Kontrast reichen von 0-255 (wie in Schritt 13 beschrieben). Um "lock in" das Bild, um die auf dem Bildschirm dargestellt, kann das Bild, um RGB-Format, die einen 8-Bit-Wert für jede der roten, grünen und blauen Farbe der einzelnen Pixel speichert umgewandelt werden.
Zum Kopieren und Einfügen von Bildern in andere Programme öffnen Sie zunächst die 8-Bit-oder 16-Bit-Bildern. Wie in Schritt 14 oben beschrieben, weisen eine LUT Farbschema, um das Bild. Für CFP, weisen Sie den "Cyan" LUT, wie unten beschrieben ...
- Wählen Sie das Bild und es in die Zwischenablage zu kopieren, wählen Sie ...
4. Repräsentative Ergebnisse:
Der Erfolg der Markierung von Zellen mit biarsenical Farbstoffe ist abhängig von ein paar wichtige Parameter. Zuerst wird der Zeitpunkt der Kennzeichnung mit Farbstoffen von entscheidender Bedeutung. Wir haben festgestellt, dass längere Kennzeichnung (mehr als 30 min) ergibt sich ein hohes Maß an unspezifischer Hintergrundfärbung. Abb. 1 zeigt ein typisches Ergebnis für einen Wildtyp-Form des Huntingtin-Fragment (25Q) fusioniert mit dem GFP-Derivat Cerulean mit einer TC-Tag wie beschrieben bisher 7. Diese Probe wurde für 30 min mit ReAsH gefärbt und es ist minimal Hintergrund in der Probe nicht über die TC-Tag. Wir haben festgestellt, dass die Festsetzung Zellen mit Paraformaldehyd erhöht Hintergrund, während Fixierung mit Methanol hebt die Fluoreszenz des fluoreszierenden Protein-Tag. Wo also möglich, dass wir Bild der Zellen leben. Es ist wichtig zu beachten Sie auch, dass die Fixierung vormit biarsenical Farbstoffe Kennzeichnung verhindert ihre Bindung, vermutlich aufgrund von Änderungen des TC-Motiv.
Ein weiterer entscheidender Faktor für konsistente Ergebnisse ist die Dichte der Zellen. Wir fanden es wichtig, image-Zellen, die locker verteilt sind und auch, dass umfangreiche Verklumpung kann eine ungleichmäßige Färbung der biarsenical Farbstoffe in verschiedenen Zellen führen.
Abbildung 1. Tetracysteinmotiv tags und ReAsH Färbung in lebende Zellen mit Huntingtin (exon1-25Q)-Cerulean Fusionen transfiziert. Die TC-Tag wird an der Kreuzung des Huntingtin-Cerulean Fusion (wie in 7 beschrieben) befindet. Die Pixel-Intensität Korrelationskurve ermöglicht eine Bewertung der Unterschiede in ReAsH Bindung in der Zelle und kann verwendet werden, um Veränderungen in ReAsH Bindung durch Konformationsänderung oder Ligand-Wechselwirkungen abzubilden.
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Discussion
Der Ansatz zur Kennzeichnung Proteinlokalisierung mit einem fluoreszierenden Protein und konformativen Eigenschaften mit einem zweiten Farbstoff bietet viel Potenzial für die Zuordnung, wo verschiedene Konformationen von Proteinen in Zellen und Ereignisse, die die Dynamik der Protein-Konformation ändern anfallen. ReAsH / Flash wurde zuerst als in-cell-Sensor für die Proteinfaltung von Säugetieren zelluläre Retinsäure-bindende Protein I 4 verwendet. In diesem Beispiel, das Flash gebunden an ein TC-Tag in zelluläre Retinsäure-bindende Protein I Fluoreszenzausbeute reduziert in der gefalteten Form in Bezug auf die entfaltete Form hatte entwickelt, und die Faltung konnte in E. verfolgt werden coli-Zellen. In jüngerer Zeit Proteinfaltung und Selbst-Verein wurde im Modell-Proteine durch bipartite Tetracysteinmotiv Anzeige 6 gezeigt. In diesem Beispiel wurden distalen dicysteine paarweise auf Modell-Peptide in der Nähe bei der Bindung von zwei Peptiden, die dicysteine Paare, oder durch die Faltung ein Peptid, das eine funktionelle Tetracysteinmotiv Motiv für die Bindung biarsenical Farbstoffe wieder her gebracht. Wir haben diesen Ansatz noch einen Schritt weiter durch die Entwicklung von Sensoren, die Monomere von Oligomeren durch die TC-Tag unterscheiden immer verschlossen aus biarsenical Farbstoffbindung in allen oligomeren Klassen 7.
Trotz des Potenzials der TC-Tags und biarsenical Farbstoffe als Reporter für Konformationsänderungen und Vereinigungsfreiheit, leidet die Methodik von mit einer vergleichsweise geringen Signal / Rausch-Signal im Vergleich zu fluoreszierenden Proteine als Folge der Grundlinie Hintergrundfluoreszenz 9. Daher bei den Bemühungen um Konformation Sensoren entwickeln würde es sich lohnen, einige der anderen neueren Kennzeichnung Ansätze entwickelt, wie ein technisch Fluorophor-Ligase-System, das Cumarin-Derivaten Konjugate ein 13 Aminosäuren-Peptid-Sequenz-3-Test.
Die hier vorgelegte Analyse kann weiter ausgebaut werden, zu prüfen, wo in den Zellen Unterschiede in der Bindung von ReAsH / Flash auftreten, um das Protein von Interesse. Dazu können die Bilder in Teilbereiche durch die Schaffung von regions of interest (ROI) und konvertiert sie in Masken, die verschiedenen Teile des Bildes (das kann alles in ImageJ durchgeführt werden) Filter aufgeteilt werden. Daher durch Vergleich der Pixel-Intensität zeichnet es sollte möglich sein, statistisch auswerten Unterschiede zwischen intrazellulären Subregionen mit den Sensoren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien an DMH und TDM (NHMRC Projekt Zuschüsse) finanziert. DMH ist ein Grimwade Fellow, durch die Miegunyah Trust finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
References
- Tsien, R. Y.
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-2672 (1998).
- Uttamapinant, C. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).
- Ignatova, Z., Gierasch, L. M. Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).
- Coleman, B. M. Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).
- Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH. Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).
- Ramdzan, Y. M. Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells. Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).
- Abramoff, M. agelhaes, PJ, S. J. R. am
- Hearps, A. The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells. J. Fluor. 17, 593-597 (2007).
- Adams, S. R. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).
