Summary
Flash ve ReAsH biarsenical boyalar özellikle proteinlerin tetracysteine motiflerine bağlanır ve seçici canlı hücrelerde protein etiketleyebilirsiniz. Son zamanlarda bu etiketleme stratejisi, farklı protein konformasyonlar veya oligomerik devletler için sensörler geliştirmek için kullanılır olmuştur. Biz etiketleme yaklaşımı tanımlar ve yöntemleri kantitatif bağlayıcı analiz etmek.
Abstract
Floresan proteinleri ve boyalar, hücrelerin protein kaçakçılığı, yerelleştirme ve fonksiyon çalışması için gerekli araçları vardır. Yeşil floresan proteininin (GFP) gibi floresan proteinleri yoğun proteinlere füzyon ortağı olarak küçük etiketleri konformasyonel değişikliği gibi hücrelerin incelenmesi gereken proteinlerin yeni işlevler sağlayan bir protein ilgi 1 özellikleri, son gelişmeleri takip etmek için kullanılmış olsa da ve protein dernek 2, 3. Bir küçük etiket sistemi genetik biarsenical boyalar bağlayan bir hedef protein, içine yerleştirilen bir tetracysteine motifi (CCXXCC) içerir ReAsH (kırmızı floresan) ve Flash (yeşil floresan), 2 canlı hücrelerinde bile yüksek özgüllüğü. TC / biarsenical boya sistemi, konformasyonel değişikliği ve protein-protein etkileşimleri 4-7 ölçmek için birçok yeni yaklaşımlar sağladı floresan proteinleri daha ana proteine daha az sterik kısıtlamalar sunmaktadır . Yakın zamanda hücrelerde mutant huntingtin ifade oligomerization, sensörler, bir roman gibi TC etiketleri uygulama geliştirdi Huntington hastalığı 7 nöronların agrega mutasyona uğramış. Huntingtin iki floresan boyalar, bir protein konumunu izlemek için floresan protein ve sadece monomerlerin biarsenical boyalar bağlayan ikinci bir TC etiketi ile etiketlenmiş. Bu nedenle, protein ve biarsenical boya reaktivitesi arasında ko değişiklikler hücre içinde mekansal eşlenebilir mikroskopik oligomer içerikler sağladı. Burada, Flash veya ReAsH canlı memeli hücrelerinde ve nasıl iki renkli floresan (Kiraz / Flash CFP / / Flash veya GFP ölçmek için bir floresan proteini (Kiraz, GFP veya CFP) erimiş TC etiketli proteinlerin nasıl etiketlemek için tarif ReAsH kombinasyonları).
Protocol
1. ReAsH / Flash ile etiketlenmesi için hücrelerin hazırlanması
- Ilgi hücre hattı için standart hücre kültürü yöntemleri kullanarak, doğrudan transfeksiyon için hazır bir canlı hücre görüntüleme slayt yapışık hücreler bir kültür hazırlayın.
- Seçtiğiniz transfeksiyon yöntemine göre faiz plazmid içeren TC etiketli gen Transfect.
TC etiketleri belirli bağlayıcı ölçüde değerlendirmek ve odaklı mikrograflar toplama kanalları arasında floresan bleedthrough değerlendirmek için pozitif ve negatif kontrollerin kullanılması önemlidir Not. Bu nedenle, iki renk (örneğin Flash / Cherry veya ReAsH / CFP veya ReAsH / GFP kombinasyonları), örnekler, tek renk (örneğin Floresan protein tek başına ya da mümkünse hiçbir floresan ile Flash / ReAsH ama bağlı TC-etiketli bir protein için hazırlanan sağlamak protein)
- Transfeksiyon Bir iki gün sonra, HBSS (37 ° C) 300 mcL önceden ısıtılmış hücreleri nazikçe yıkayın.
- Prewarmed HBSS ve 10 mcM 1,2-ethanedithiol (EDT) 300 mcL 1 mcM Flash (ya da ReAsH) hücreler yavaşça bırakın.
Hücreler ekleyerek Flash / ReAsH eklemeden önce EDT ekleyebilir ve hemen önce tampon yapmak önemlidir. 37 ° C dokusunda kültür inkübatör tam 30 dakika boyunca inkübe. Eşiğe deneyimimiz uzun inkübasyon süreleri önemli ölçüde artırır. Yeni yapıları da, zaman ve Flash / ReAsH konsantrasyonu (0.5-2 mcM) etiketlenmesi için optimize edilmelidir.
- Yavaşça 300 mcL prewarmed HBSS + 250 mcM 37 az 15 dakika boyunca 2,3-dimercaptopropanol (BAL) ° C ile değiştirin sonra hücrelerin çözüm etiketleme aspirat
- Çözüm nazik aspirasyonu ile yıkayın ve 300 mcL prewarmed HBSS ile değiştirin çıkarın.
Bu yıkamadan sonra, hücreler, bu non-spesifik biarsenical boya floresan artırdığını bulduk rağmen paraformaldehid (% 3.2 solüsyonu ile 15 dakika) ile sabit olabilir. Bu nedenle genellikle görüntü hücreleri oda sıcaklığında yaşıyor. (Etiketleme biarsenical boya bağlanmasını engelleyen önce bu hücre fiksasyonu unutmayın.)
2. Görüntüleme konfokal mikroskop hücreleri
- Konfokal mikroskop, görüntüleme bireysel fluorophores (bkz. Tablo 1) parametrelerini ayarlamak ve kanallar arasında ihmal edilebilir bleedthrough olduğundan emin olunuz. Bu floresan için her biri farklı floresan bir satın alma ayarı karşı bireysel fluorophores (kontrol numuneleri) kontrol ederek elde edilebilir. Emisyon dalga boyu aralığında ayarlanması bleedthrough (bu da sinyal / gürültü azaltabilir rağmen) en aza indirmek için yardımcı olabilir.
- Ayrıca numune maksimum floresans dedektör doyurabilecek kalmaması photomultiplier ayarlarını. (SP2 Leica konfokal Q-LUT ayarını kullanarak tespit edilebilir). Bir kez iyi görüntüleme ayarları belirlenir, bunların örnekleri arasında herhangi bir değişiklik yok.
- Diğer ayarlar (bu optimize edilmiş olmasına rağmen) biz genellikle 200 Hz tarama hızı ve 4 hat ortalamalar ve bir iğne deliği çapı 1 Airy birim toplamak. Iğne deliği çapı sinyal / noise bir sorun olup olmadığını, ancak, bu görüntüleme bazı kaybına neden olabilir genişletilebilir.
- Mümkünse, 12-bit (veya üstü) formatında konfokal görüntüleri toplayın. 12-bit formatında, 8-bit (0-255) göre, her bir piksel yoğunluğu için değerleri (0-4095) daha yüksek dinamik aralık yakalar. Bu zengin veri seti nicel verilerin analiz kalitesini en üst düzeye kaydedilir sağlamak için önemlidir.
- Floresan protein kanal (Kiraz, GFP veya CFP) ve aynı zamanda tüm örnekler için biarsenical boya kanal (Flash veya ReAsH) görüntüleri toplayın.
3. Verilerin analizi
- Yazılım bilgisayarınıza 8 ImageJ yükleyin. http://rsbweb.nih.gov/ij/
- ImageJ sürümüne aşağıdaki eklentileri olduğundan emin olun:
- Açık ImageJ ve v1.32c daha eski bir sürümü kullanıyorsanız, bir kez (farklı dosyalar üzerinde tıklarken kontrol düğmesi basılı tutarak yapılabilir) açılacak birden fazla görüntü sağlamak için aşağıdaki seçenekleri tıklayın:
- ImageJ ilgi görüntüleri açın.
ImageJ, her resim için ayrı ayrı ekranda görüntülenen maksimum ve minimum piksel yoğunlukları otomatik olarak tanımlayacaktır. Farklı görüntüler d olacağı verilenifferent piksel yoğunlukları bakıldığında görüntülenen görüntüleri karşılaştırılabilir DEĞİLDİR anlamına gelir. - Açılan görüntülerin hepsi aynı ölçekte sağlamak için, fiziksel üst tanımlayabilirsiniz ve daha düşük piksel yoğunluklarda (bu başka bir yazılım olacak gibi görüntülerin gerçek veri içeriği değişmeyecek) görülebilir. Bu değerler aşağıdaki menü altında ayarlanabilir:
- Alternatif bir yaklaşım, aynı ölçekte yığın (görüntülemek için) tüm görüntüleri bir dosya içine tüm görüntüleri bir araya koyar ve otomatik olarak ölçekli yığınları ile çalışmak için. Verilerle çalışmak için en kolay yolu, her kanal bir yığın dönüştürmek için. Böylece, floresan protein kanal için gösterildiği gibi yığını tüm dönüştürmek. Başlığında bir ortak adı (örneğin, "ch00") içeren tüm görüntüleri istifleme tarafından kolayca bir kanal seçebilirsiniz.
- Şimdi analiz için 8-bit için tüm açık görüntüleri dönüştürmek. Bu aslında bir 0-255 aralığı (8-bit tanımlayan) içine görüntülenen aralık rescale.
ÖNEMLİ NOT: orijinal 12-bit (veya üstü) biçiminde tasarruf ya da bilgi içeriğini kaybedersiniz . Not, bu biçimi, rakamlar vb yapmak için yararlıdır bu nedenle bazı yazılım paketleri sadece 8-bit görüntüleri görüntüleyebilirsiniz
- "Seçenek" olarak ... Kaydet "seçeneğini kullanarak 8-bit dönüştürülür" olarak adlandırılan yeni bir klasörde bir kopyasını kaydedin.
- Biarsenical boya bağlayıcı bir bütün görüntü ölçüde incelemek için bir yöntem, bir piksel yoğunluğu korelasyon arsa gerçekleştirmek için. Bu araziler bir kanal ikinci bir kanala karşılık gelen piksel değerine göre her piksel değeri. Bağlayıcı yüksek olup olmadığını Dolayısıyla CFP floresan yüksek bir piksel konumunu da ReAsH floresan yüksek olacak.
- Co-korelasyon piksel analiz etmek, 8-bit ReAsH ve Cerulean / GFP görüntüleri ImageJ açık olduğundan emin olun.
- "Görüntü korelatör" eklentisi aşağıda gösterildiği gibi açın. ReAsH veya flash yığını ve floresan protein yığını olarak "Image2" gibi "image1" i seçin.
- Yığını herhangi bir ayrıntılı bilgi görüntülemek olmayabilir, bu normaldir. "SCATTERPLOTS" olarak adlandırılan yeni bir klasöre yığını kaydedin ve bunu atıfta örnek olarak aynı dosya adını vermek (örneğin, "flash-kiraz korelasyon komplo")
- Verileri görüntülemek için anlamlı iki seçenekten birini yapabilirsiniz. Öncelikle günlük biçiminde böylece veri dönüşümü. Sonra aşağıdaki gibi görsel veri rescale:
- Alternatif olarak, sadece düşük değerler (örneğin 1-255) ve özel bir LUT kullanarak veri görüntülemek için görsel veri rescale. LUT (Yukarı Bak), bir görüntüdeki her bir piksel değeri atanır renk bir masa temsil eder Bu bir görüntü için bir Pseudocolor düzenini tanımlamak için kullanılan ve bir görüntüdeki bazı özellikleri tanımlamak için yararlı olabilir. "LUT editörü" özel bir LUT tıklama oluşturmak ve yeni bir biri olarak gösterilir (bu kaydedilir ve daha sonra kullanılabilir) yapmak için.
- 0-255 parlaklık / kontrast aralığı (yukarıdaki 13. adımda açıklandığı gibi) ayarlayın. "Kilidi" olarak ekranda gösterilen görüntü, görüntüdeki her bir pikselin kırmızı, yeşil ve mavi renk, her bir 8-bit değeri kaydeder RGB formatına dönüştürülecek için.
8-bit veya 16-bit görüntüleri ilk görüntüleri diğer programlara kopyalama ve yapıştırma için açın. Yukarıda adım 14 olarak açıklandığı gibi, resmin bir LUT renk düzeni atayın. CFP için, aşağıda açıklandığı gibi "Cyan" LUT atamak ...
- Görüntüyü seçin ve panoya kopyalamak için seçmek ...
4. Temsilcisi sonuçları:
Biarsenical boya ile etiketleme hücrelerin başarı, birkaç anahtar parametreleri bağlıdır. Öncelikle, boya ile etiketleme zamanlaması çok önemlidir. Biz bulduk, etiketleme uzun süre (30 dakika daha fazla) yüksek düzeyde bir non-spesifik bir arka plan boyama sonuç. Şekil 1, daha önce 7 açıklandığı gibi TC etiketi içeren CFP türev Cerulean erimiş huntingtin parçası yabani tip formu (25Q) için tipik bir sonucu gösterir . Bu örnek ReAsH ile 30 dakika boyanmış ve TC etiketi eksik örnek minimal arka plan var. Biz paraformaldehid artar arka plan ile hücre sabitleme metanol ile tespit floresan protein etiketi floresan lağvetti ederken bulduk. Bu nedenle hücreler mümkünse biz görüntü canlı. Ayrıca bu fiksasyon önce dikkat etmek önemlidir.biarsenical boya ile etiketleme için TC motifi değişiklikler nedeniyle, muhtemelen onların bağlayıcı önler.
Tutarlı sonuçlar elde etmek için bir başka kritik faktör, hücre yoğunluğu. Biz, gevşek bir şekilde dağıtılmış ve aynı zamanda geniş bir topaklanma farklı hücreler biarsenical boyaların düzensiz boyanma yol açabilir görüntü hücreleri kritik bulduk.
Şekil 1 Tetracysteine etiketleri ve huntingtin (exon1-25Q) Cerulean füzyonlar ile transfekte canlı hücrelerde ReAsH boyanma. TC etiketi huntingtin Cerulean füzyon (7 açıklandığı gibi) kavşak noktasında yer almaktadır. Piksel yoğunluğu korelasyon arsa hücre boyunca bağlayıcı ReAsH farklılıkları bir değerlendirme sağlar ve konformasyonel değişikliği veya ligand etkileşimleri nedeniyle bağlayıcı ReAsH değişiklikler harita için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ikinci bir boya ile floresan protein ve konformasyonel özellikleri ile etiket protein lokalizasyon yaklaşımı farklı proteinlerin konformasyonlar hücreleri ve protein konformasyonu dinamiklerini değiştiren olaylar tahakkuk haritalama için çok potansiyel sunmaktadır. ReAsH / Flash ilk memeli hücresel retinoik asit bağlayıcı protein 4 protein katlanması için bir hücre sensörü olarak kullanılmıştır. Bu örnekte, bir TC etiketi bağlı Flash gelişeceğini formuna göre katlanmış şeklinde floresans verimi azalır hücresel retinoik asit bağlayıcı protein mühendisliği ve katlama E. izlenen olabilir coli hücrelerinde. Daha yakın zamanda protein katlanması ve kendi kendine örgütlenme iki taraflı tetracysteine ekran 6 model proteinlerde olduğu gösterilmiştir. Bu örnekte, model peptit distal dicysteine çifti, dicysteine çiftleri içeren iki peptidler bağlanması üzerine veya bağlayıcı biarsenical boyalar için fonksiyonel bir tetracysteine motifi yeniden bir peptid katlama yakın haline getirildi. Biz TC etiketi nedeniyle oligomerler monomerlerin ayırt gelişmekte olan sensörler bu yaklaşımı bir adım ileri sürmüştür tüm oligomerik formları 7 biarsenical boya bağlayıcı tıkalı olma.
TC etiketleri ve yapı değişiklikleri ve dernek için gazetecilere olarak biarsenical boyalar potansiyeline rağmen, metodoloji, başlangıçtaki arka planda floresan 9 bir sonucu olarak floresan proteinleri ile karşılaştırıldığında nispeten düşük sinyal / gürültü sinyali muzdarip . Bu nedenle konformasyon sensörler geliştirme çabaları, kumarin türevleri, 13 amino asit peptid dizisi 3 konjugatları bir mühendislik fluorofor ligaz sistemi olarak geliştirilen diğer yeni etiketleme yaklaşımları, bazı test etmek için faydalı olacaktır .
Burada sunulan analiz ReAsH / Flash bağlayıcı hücreleri farklılıklar içinde ilgi protein meydana nerede incelemek için daha da uzatılabilir. Bunu yapmak için, görüntüleri, ilgi alanları (ROI) oluşturma ve görüntü farklı parçalar (hepsi bu ImageJ yapılabilir) filtre maske dönüştürerek alt bölgelerini içine ayrılabilir. Bu nedenle, piksel yoğunluğu araziler karşılaştırıldığında istatistiksel sensörler kullanılarak hücre içi alt bölgelerin arasındaki farklılıkları değerlendirmek mümkün olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma DMH ve TDM (NHMRC proje hibe) bağışları ile finanse edilmiştir. DMH Miegunyah Trust tarafından finanse edilen bir Grimwade Üyesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
References
- Tsien, R. Y.
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-2672 (1998).
- Uttamapinant, C. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).
- Ignatova, Z., Gierasch, L. M. Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).
- Coleman, B. M. Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).
- Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH. Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).
- Ramdzan, Y. M. Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells. Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).
- Abramoff, M. agelhaes, PJ, S. J. R. am
- Hearps, A. The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells. J. Fluor. 17, 593-597 (2007).
- Adams, S. R. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).
