Summary
Den biarsenical färgämnen Flash och ReAsH binder specifikt till tetracysteine motiv i proteiner och kan selektivt etikett proteiner i levande celler. Nyligen denna märkning strategi har använts för att utveckla sensorer för olika proteiner konformationer eller oligomeric stater. Vi beskriver märkning tillvägagångssätt och metoder för att kvantitativt analysera bindande.
Abstract
Fluorescerande proteiner och färgämnen är viktiga verktyg för studier av protein handel, lokalisering och funktion i celler. Medan fluorescerande proteiner såsom grön fluorescens protein (GFP) har i stor utsträckning använts som fusion partner till proteiner för att spåra egenskaper hos ett protein av intresse 1, den senaste tidens utveckling med mindre taggar möjliggöra nya funktioner av proteiner som skall undersökas i celler som conformationaländring och protein-förening 2, 3. En liten tagg-systemet innebär en tetracysteine motiv (CCXXCC) genetiskt in i ett målprotein, som binder till biarsenical färgämnen, ReAsH (röd fluorescerande) och Flash (grönt fluorescerande), med hög specificitet även i levande celler 2. TC / biarsenical dye-systemet erbjuder mycket mindre steriska begränsningar till värden protein än fluorescerande proteiner som har möjliggjort flera nya metoder för att mäta conformationaländring och protein-protein interaktioner 4-7. Vi har nyligen utvecklat en ny tillämpning av TC-taggar som sensorer av oligomerisering i celler som uttrycker mutant huntingtin, som när den muterat aggregat i nervceller i Huntingtons sjukdom 7. Huntingtin var märkta med två fluorescerande färger, en ett fluorescerande proteinet för att spåra proteiner plats, och den andra en TC-tagg som bara binder biarsenical färgämnen i monomerer. Därför aktiverat förändringar i colocalization mellan protein och biarsenical färgämnet reaktivitet submikroskopiska oligomerer innehåll vara geografiskt kartläggas i celler. Här beskriver vi hur etiketten TC-taggade proteiner smält till ett fluorescerande protein (Cherry, GFP eller GFP) med Flash eller ReAsH i levande däggdjursceller och hur man kan kvantifiera de två färg fluorescens (Körsbär / Flash, GFP / Flash eller GFP / ReAsH kombinationer).
Protocol
1. Beredning av celler för märkning med ReAsH / Flash
- Med standardmetoder cellodling för din cellinje av intresse, förbereda en kultur av vidhäftande celler direkt i en levande cell imaging bilden klar för transfektion.
- Transfektera din plasmid som innehåller TC-märkta genen av intresse enligt dina transfektion metod val.
Anmärkning Det är viktigt att använda positiva och negativa kontroller för att bedöma omfattningen av specifika bindning till TC taggar och för att bedöma för bleedthrough av fluorescens mellan kanalerna när du hämtar konfokala micrographs. Därför, för två färger (t.ex. Flash / körsbär eller ReAsH / GFP eller ReAsH / GFP kombinationer), se till att proven är förberedda för enskilda färger (till exempel fluorescerande protein ensam om möjligt eller en TC-taggade bundet till Flash / ReAsH men utan fluorescerande protein)
- En till två dagar efter transfektion, försiktigt spola cellerna med 300 mikroliter förvärmda (vid 37 ° C) HBSS.
- Försiktigt doppa cellerna med 1 mikroM Flash (eller ReAsH) i 300 mikroliter av uppvärmd HBSS och 10 mikroM 1,2-ethanedithiol (lokal tid).
Det är viktigt att lägga EDT först innan du lägger Flash / ReAsH och göra buffert strax innan du lägger den till cellerna. Inkubera exakt 30 minuter vid 37 ° C i vävnadsodling kuvös. Enligt vår erfarenhet längre inkubationstiderna ökar avsevärt bakgrundsfluorescens. Nya konstruktioner bör även vara optimerad för märkning tid och Flash / ReAsH koncentration (0,5-2 M).
- Försiktigt aspirera märkning lösning från celler och sedan ersätta med 300 mikroliter uppvärmd HBSS + 250 mikroM 2,3-dimercaptopropanol (BAL) i 15 minuter vid 37 ° C.
- Avlägsna tvättlösningen genom försiktig uppsugning och ersätta med 300 mikroliter uppvärmd HBSS.
Efter denna tvätt, får cellerna fastställas med paraformaldehyd (15 min med 3,2% lösning), även om vi har funnit att detta ökar icke-specifika biarsenical färgämne fluorescens. Därför brukar vi bild cellerna lever i rumstemperatur. (Observera att fixeringen av celler innan märkning förhindrar biarsenical färg bindande.)
2. Imaging cellerna på en konfokalmikroskop
- På konfokalmikroskop, ställa in parametrar för bildbehandling individen fluoroforer (se tabell 1) och se till att det är försumbar bleedthrough mellan kanalerna. Detta kan uppnås genom att kontrollera enskilda fluoroforer (i kontrollprover) för varje olika fluorescerande förvärv inställning för fluorescens. Justera intervallet utsläppen våglängd kan hjälpa till att minimera bleedthrough (även om detta också kan minska signal / brus).
- Också justera fotomultiplikatorn inställningarna så att maximal fluorescens i provet inte mätta detektorn. (Detta kan upptäckas med hjälp av Q-LUT inställningen på SP2 Leica konfokala). När bästa avbildning inställningar bestäms inte ändra någon av dem mellan proven.
- Andra inställningar vi normalt använder (även om dessa kan optimeras) är en genomsökning på 200 Hz och samla 4 linje medelvärden och ett hål diameter på 1 Airy enhet. Den Pinhole diameter kan utökas om signal / brus är ett problem, dock kan detta resultera i en viss förlust av avbildning.
- Samla konfokala bilder i 12-bitars (eller högre) format om möjligt. 12-bitars format fångar ett större dynamiskt omfång av värden (0-4095) för varje pixel intensitet än 8-bitar (0-255). Detta är viktigt för att säkerställa de rikaste uppsättning data registreras, vilket maximerar kvaliteten på kvantitativ analys av data.
- Samla bilder för fluorescerande protein kanal (Cherry, GFP eller GFP) och även för biarsenical dye-kanal (Flash eller ReAsH) för alla prover.
3. Analys av data
- Installera programmet ImageJ på datorn 8. http://rsbweb.nih.gov/ij/
- Se till att din version av ImageJ har följande plugins:
- Öppna ImageJ, och om du använder en version äldre än v1.32c, klicka på följande alternativ så att flera bilder kan öppnas på en gång (vilket kan göras genom att hålla ned Control-knappen medan du klickar på olika filer):
- Öppna bilder av intresse för ImageJ.
ImageJ kommer automatiskt att definiera den högsta och lägsta pixel intensitet som visas på skärmen för varje bild separat. Med tanke på att olika bilder kommer att ha different pixel stödnivåer innebär detta de bilder som visas inte är jämförbara sett. - För att säkerställa att de öppnade bilderna är alla i samma skala, kan du definiera fysiskt övre och nedre pixel intensitet ses (detta kommer inte att ändra de faktiska uppgifter innehållet i bilderna som skulle vara fallet i en del andra program). Dessa värden kan ställas in under följande meny:
- Ett alternativ är att arbeta med staplar, som sätter alla bilder ihop till en fil och kommer automatiskt skala (för visning) alla bilderna i bunten i samma skala. Det enklaste sättet att arbeta med data är att konvertera varje kanal till en skorsten. Således, för fluorescerande proteinet kanalen konvertera alla att stapla som visas. Du kan enkelt välja en kanal genom att stapla alla bilder som innehåller ett gemensamt namn (t.ex. "ch00") i titeln.
- Nu konvertera alla öppna bilder till 8-bitars för analys. Detta kommer faktiskt att skala om totalt sortimentet i en 0-255 intervall (som definierar 8-bitars).
VIKTIGT: Spara inte på den ursprungliga 12-bitars (eller högre) format eller du kommer att förlora information om innehåll. Observera att en del programpaket endast kan visa 8-bitars bilder så detta format är användbart för att göra diagram mm
- Spara en kopia i en ny mapp som heter "8-bitars konverterade" med "Spara som ..." alternativet.
- En metod för att undersöka omfattningen av biarsenical färg bindande i en hel bild är att utföra en pixel tomt intensitet korrelation. Detta plottar varje pixel värde i en kanal i förhållande till motsvarande pixelvärde i en andra kanal. Därför en pixel ställning hög i den gemensamma fiskeripolitiken fluorescens kommer också vara hög i ReAsH fluorescens om det är hög bindande.
- Att analysera pixel co-korrelationen, se till att 8-bitars ReAsH och Cerulean / GFP bilder är öppna i ImageJ.
- Öppna "Bild Correlator" plugin som anges nedan. Välj "Bild1" som ReAsH eller Flash stacken och "Bild2" som fluorescerande proteinet stacken.
- Den resulterande stacken får inte visa någon detaljerad information - detta är normalt. Spara bunten i en ny mapp som heter "Scatterplots" och ge den samma namn som provet den hänvisar till (t.ex. "Flash-cherry korrelation plot")
- Om du vill visa data som meningsfullt kan du göra ett av två alternativ. Först omvandla informationen så att det är i log-format. Sedan visuellt skala om uppgifter enligt följande:
- Alternativt kan du skala om data visuellt för att bara visa låga värden (t.ex. 1 till 255) och visa data med hjälp av en speciell LUT. En LUT (Look Up Table) är en tabell över färger som tilldelas varje pixel värde i en bild . Detta kan användas för att definiera en pseudofärger system för en bild och är användbart för att definiera vissa funktioner i en bild. Vill skapa en anpassad LUT klicka på "LUT editor" och göra en ny som ett visas (det här kan sparas och användas senare).
- Ställ in ljusstyrka / kontrast sträcker sig från 0-255 (enligt beskrivningen i steg 13 ovan). För att "låsa in" bilden som den som visas på skärmen kan bilden konverteras till RGB-format vilket sparar en 8-bitars värde för var och en av de röda, gröna och blå färgen för varje pixel.
För att kopiera och klistra in bilder till andra program först öppna den 8-bit eller 16-bitars bilder. Som beskrivs i steg 14 ovan, tilldela ett system LUT färg till bilden. För den gemensamma fiskeripolitiken, tilldela "Cyan" LUT enligt nedan ...
- Markera bilden och kopiera det till urklipp, välj ...
4. Representativa resultat:
Framgången för märkning av celler med biarsenical färgämnen är beroende av ett fåtal nyckelparametrar. För det första är tidpunkten för märkning med färgämnen avgörande. Vi har funnit att längre perioder av märkning (mer än 30 min) resulterar i en hög nivå av icke-specifik bakgrundsfärgning. Fig 1 visar ett typiskt resultat för en vildtyp form av huntingtin fragment (25Q) smält den gemensamma fiskeripolitiken derivatan Cerulean innehåller en TC-tagg som beskrivits tidigare 7. Detta prov var målat i 30 min med ReAsH och det finns minimala bakgrund i urvalet saknar TC taggen. Vi har funnit att fastställa celler med paraformaldehyd ökar bakgrunden medan fastställande med metanol upphäver fluorescensen hos fluorescerande proteinet taggen. Därför är möjligt vi bilden cellerna lever. Det är viktigt att också notera att fixering föremärkning med biarsenical färgämnen hindrar deras bindande, förmodligen på grund av ändringar av TC motiv.
En annan kritisk faktor för konsekventa resultat är tätheten av celler. Vi har funnit det viktigt att bilden celler som är löst ut och att omfattande bildning kan leda till ojämn färgning av biarsenical färgämnen i olika celler.
Figur 1. Tetracysteine taggar och ReAsH färgning i levande celler transfekterade med huntingtin (exon1-25Q)-Cerulean fusioner. TC-taggen ligger vid korsningen av huntingtin-Cerulean fusion (som beskrivs i 7). Pixeln intensitet korrelationen tomten gör en bedömning av skillnader i ReAsH bindande för hela cellen och kan användas för att kartlägga förändringar i ReAsH bindande grund conformationaländring eller interaktioner ligand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod för att märka protein lokalisering med en fluorescerande protein och konformationsanalys fastigheter med en andra färg ger stor potential för kartläggning där olika konformationer av proteiner uppstår i celler och händelser som förändrar dynamiken av protein konformation. ReAsH / Flash användes först som ett i-cell sensor för proteinveckning av däggdjur cellulär retinoinsyra-bindande protein I 4. I detta exempel Flash bunden till en TC tagg konstruerad i cellulär retinoinsyra-bindande protein jag hade minskat fluorescens avkastning i vikta form i förhållande till ovikt form, och det fällbara kunde spåras i E. coli celler. På senare tid proteinveckning och själv-föreningen visades i modellen proteiner genom tvåparts tetracysteine display 6. I detta exempel var distala dicysteine par på modell peptider tas i närheten vid bindning av två peptider som innehåller dicysteine par, eller genom att vika av en peptid som återuppstår en funktionell tetracysteine motiv för bindning biarsenical färgämnen. Vi tog denna strategi ett steg längre genom att utveckla sensorer som skiljer monomerer från oligomerer grund av TC-taggen att bli blockerad från biarsenical färga bindande i alla oligomeric former 7.
Trots möjligheterna till TC taggar och biarsenical färgämnen som reportrar för konformationsändringar och föreningsfrihet, lider metoden från att ha en jämförelsevis låg signal / brus-signal jämfört med fluorescerande proteiner som en följd av baslinjen bakgrundsfluorescens 9. Därmed i arbetet med att utveckla konformation sensorer skulle det vara värt att testa några av de andra nyare märkning metoder utvecklas som en konstruerad fluoroforen ligas system som konjugat kumarinderivat till en 13 aminosyror peptid sekvens 3.
Den analys som presenteras här kan utökas ytterligare undersöka var i cellerna skillnader förekomma i bindningen av ReAsH / Flash mot proteinet av intresse. För att göra detta, kan bilderna delas upp i ekonomiska regioner genom att skapa regioner av intresse (ROI) och konvertera dem till masker för att filtrera olika delar av bilden (detta kan alla göras i ImageJ). Därför genom jämförelse av pixeln intensiteten tomterna bör det vara möjligt att statistiskt utvärdera skillnader mellan intracellulära distrikt med sensorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av bidrag till DMH och TDM (NHMRC projektbidrag). DMH är ett Grimwade Fellow, som finansieras av Miegunyah Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
References
- Tsien, R. Y.
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-2672 (1998).
- Uttamapinant, C. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 10914-10919 (2010).
- Ignatova, Z., Gierasch, L. M. Monitoring protein stability and aggregation in vivo by real-time fluorescent labeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 523-528 (2004).
- Coleman, B. M. Conformational detection of prion protein with biarsenical labeling and FlAsH fluorescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 564-568 (2009).
- Luedtke, N. W., Dexter, R. J., Fried, D. B., Schepartz, A. Surveying polypeptide and protein domain conformation and association with FlASH and ReAsH. Nat. Chem. Biol. 3, 779-784 (2007).
- Ramdzan, Y. M. Conformation sensors that distinguish monomeric proteins from oligomers in live cells. Chem. Biol. 17, 371-379 (2010).
- Abramoff, M. agelhaes, PJ, S. J. R. am
- Hearps, A. The biarsenical dye Lumio exhibits a reduced ability to specifically detect tetracysteine-containing proteins within live cells. J. Fluor. 17, 593-597 (2007).
- Adams, S. R. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).
