Summary
biarsenical 염료 플래시와 ReAsH 단백질의 tetracysteine 주제에 구체적으로 바인딩하고 선택적으로 살 세포에 단백질을 분류하실 수 있습니다. 최근에이 상표 전략은 다른 단백질 conformations 또는 oligomeric 상태에 대한 센서를 개발하는 데 사용되었습니다. 우리는 라벨 접근 방식을 설명하고 방법은 양적 바인딩을 분석합니다.
Abstract
형광 단백질 및 염료는 세포에있는 단백질 밀매, 현지화 및 기능 연구에 필수적인 도구입니다. 같은 녹색 형광 단백질 (GFP)로 형광 단백질이 광범위 작은 태그는 같은 conformational 변화로 세포 검사로 단백질의 새로운 기능을 활성화와 관심 1 단백질의 속성, 최근 발전을 추적하는 단백질을 융합 파트너로 사용되었습니다 동안 그리고 단백질 협회 2, 3. 작은 태그 시스템은 유전자 biarsenical 염료에 바인딩 대상 단백질에 삽입 tetracysteine의 모티브 (CCXXCC)를 포함, ReAsH (적색 형광) 심지어이 살고 세포에 높은 특이성과 플래시 (녹색 형광). TC / biarsenical 염료 시스템은 conformational 변화와 단백질 - 단백질 상호 작용 4-7를 측정하는 여러 가지 새로운 방법을 사용할 수 있습니다 형광 단백질보다 호스트 단백질을 훨씬 덜 steric 제약을 제공합니다. 우리는 최근에 돌연변이 huntingtin을 표현하는 세포의 oligomerization의 센서로 TC 태그의 소설 응용 프로그램을 개발하는 헌팅턴 질병 7 뉴런에서 집계를 변이된 경우. Huntingtin은 두 개의 형광 염료, 하나 단백질 위치를 추적할 수있는 형광 단백질에만 단량체의 biarsenical 염료를 바인딩 두 번째 TC 태그 적었습니다. 따라서, 단백질과 biarsenical 염료 반응성 사이 colocalization의 변화는 공간 세포 내에서 매핑하는 submicroscopic 올리고머 컨텐츠를 활성화. 여기, 우리는 플래시 또는 ReAsH 라이브 포유 동물 세포와 방법을 두 가지 색상의 형광 (체리 / 플래시, CFP / / 플래시 또는 GFP를 수치와 형광 단백질 (체리, GFP 또는 CFP)로 융합 TC - 태그 단백질을 분류하는 방법에 대해 설명합니다 ReAsH 조합).
Protocol
1. ReAsH / 플래시 라벨에 대한 세포의 준비
- 관심의 세포 라인에 대한 표준 세포 배양 방법을 사용하여 직접 transfection 준비 라이브 셀 이미징 슬라이드에 자기편 세포의 문화를 준비합니다.
- 선택의 transfection 방법에 따라 관심의 플라스미드가 포함된 TC - 태그 유전자를 Transfect.
TC 태그에 특정 바인딩의 범위를 평가하고 공촛점 micrographs를 수집하면 채널 사이에 형광 bleedthrough에 대한 평가에 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 사용하는 것이 중요합니다. 따라서, 두 색상 (예 : 플래시 / 체리 또는 ReAsH / CFP 또는 ReAsH / GFP 조합)에 대한 샘플은 단일 색상 (예 : 형광 단백질 혼자 또는 가능한 경우없이 형광등 플래시 / ReAsH 이에 바운드 TC - 태그 단백질에 대한 준비가되어 확인 단백질)
- 하나하는 데 이틀이 transfection 후 부드럽게 HBSS (37 ° C에서) 300 μL 사전 예열로 세포를 씻어.
- 부드럽게 prewarmed HBSS와 10 μm의 1,2 - ethanedithiol (동부 서머 타임) 300 μL 1 μm의 플래시 (또는 ReAsH)로 세포를 잠그다.
세포에 추가하기 위해 플래시 / ReAsH를 추가하기 전에 동부 서머 타임을 추가하고 방금 전에 버퍼를 만드는 것이 중요합니다. 37 ° 조직에서 C 문화 인큐베이터에서 정확히 30 분 알을 품다. 우리의 경험을 더 이상 배양 시간이 크게 배경 형광을 증가시킵니다. 새로운 구조는 또한 시간 및 Flash / ReAsH 농도 (0.5-2 μm의) 라벨에 최적화된해야합니다.
- 부드럽게 300 μL prewarmed HBSS + 250 μm의 37 15 분에 대한 2,3 - dimercaptopropanol (BAL) ° C.로 교체 후 세포에서 솔루션을 라벨링 기음과
- 부드러운 열망으로 솔루션을 씻고 300 μL prewarmed HBSS로 교체 제거합니다.
우리가이가 아닌 특정 biarsenical 염료의 형광을 증가시킬 수있다는 것을 발견했지만이 세척 후, 세포는 paraformaldehyde (3.2 %의 솔루션으로 15 분)에 고정 수 있습니다. 따라서 우리는 일반적으로 이미지 세포는 실온에서 살고있다. (라벨이 biarsenical 염료 바인딩을 방지하기 전에 세포의 고정을합니다.)
2. 공촛점 현미경의 영상은 세포
- 공촛점 현미경에서 이미징 개별 fluorophores (표 1 참조)에 대한 매개 변수를 설정하고 채널 간의 무시할 bleedthrough이있다는 것을 확인하십시오. 이것은 형광 각각 다른 형광 수집 설정에 대한 개별 fluorophores을 (제어 샘플)를 선택하여 얻을 수 있습니다. 방출 파장 범위를 조정하면 (이것은 또한 신호 / 잡음을 줄일 수 있지만) bleedthrough을 최소화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 또한 예제에서 최대 형광이 탐지기를 포화하지 않도록 photomultiplier 설정을 조정합니다. (이것은 SP2 Leica 공촛점에있는 Q - LUT 설정을 사용하여 감지 수 있습니다.) 일단 최고의 영상 설정이 결정되며, 샘플 간의 그들 중 하나를 변경하지 마십시오.
- 우리가 일반적으로 사용하는 다른 설정 (이가 최적화할 수 있지만) 200 Hz의 스캔 속도이며, 4 린 평균 1 에어리 단위의 핀홀 직경를 수집합니다. 핀홀 직경은 신호 / 노이즈가 문제가있다면하지만,이 영상의 일부 손실을 초래할 수 확장 될 수 있습니다.
- 가능하면 12 비트 (또는 이상) 형식으로 공촛점 이미지를 수집합니다. 12 비트 포맷은 8 비트 (0-255)보다 각 픽셀 강도에 대한 값 (0-4095)의 큰 다이나믹 레인지를 캡처합니다. 이것은 가장 부유한 데이터 세트가 정량 데이터 분석의 품질을 극대화하는, 기록 확보하는 것이 중요합니다.
- 형광 단백질 채널 (체리, GFP 또는 CFP)와 또한 모든 샘플에 대한 biarsenical 염료 채널 (플래시 또는 ReAsH)에 대한 이미지를 수집합니다.
3. 데이터의 분석
- 컴퓨터 8 소프트웨어 ImageJ를 설치합니다. http://rsbweb.nih.gov/ij/
- ImageJ의 버전은 다음과 같은 플러그인이 있는지 확인합니다 :
- 오픈 ImageJ 및 v1.32c보다 오래된 버전을 사용하는 경우, 여러 개의 이미지를 한 번 (당신이 다른 파일을 클릭하면서 어떤이 컨트롤 버튼을 누른하여 수행할 수 있습니다)에서 열 수 있도록 다음과 같은 옵션을 클릭합니다 :
- ImageJ에 대한 관심의 이미지를 엽니다.
ImageJ는 자동으로 별도로 각각의 이미지를 화면에 표시되는 최대 및 최소 픽셀 농도를 정의합니다. 서로 다른 이미지가 D가됩니다 감안할 때ifferent 픽셀 농도,이 조회로 표시된 이미지가 비교되지 않습니다 것을 의미합니다. - 열린 이미지가 같은 규모의 모든 있도록하기 위해서는 물리적으로 상부를 정의할 수 있으며, 낮은 픽셀 농도는 (이것은 다른 소프트웨어의 경우 것입니다 같은 이미지의 실제 데이터 내용을 변경하지 않습니다) 볼 수 있습니다. 이러한 값은 다음과 같은 메뉴에서 설정할 수 있습니다 :
- 다른 접근 방식은 같은 규모로 스택에 (볼) 모든 이미지를 하나의 파일에 모두 함께 이미지를두고 자동으로 규모 것입니다 스택에서 작동하는 것입니다. 데이터 작업하는 가장 쉬운 방법은 스택 각 채널을 변환하는 것입니다. 따라서, 형광 단백질 채널과 같이 스택에 대한 모든 변환합니다. 당신은 쉽게 제목에 일반적인 이름 (예 : "ch00")가 포함된 모든 이미지를 쌓아하여 하나의 채널을 선택할 수 있습니다.
- 이제 분석을 위해 8 비트로 열려있는 모든 이미지를 변환합니다. 이것은 실제로 0-255 범위 (8 비트를 정의하는)에 조회 범위를 rescale 것입니다.
중요 : 원래 12 비트 (또는 이상) 형식을 통해 저장하거나 정보 콘텐츠를 잃게됩니다하지 마십시오. 이 형식은 그림 등을 만드는 데 유용합니다 때문에 일부 소프트웨어 패키지는 8 비트 이미지를 표시할 수 있습니다
- 옵션 "으로 ... 저장"을 사용하여 "8 비트 변환"라는 새 폴더에 복사본을 저장합니다.
- 전체 이미지 biarsenical 염색 바인딩의 범위를 조사하는 한 가지 방법은 픽셀 강도 상관 계획을 수행하는 것입니다. 두 번째 채널에 해당 픽셀의 가치에 상대적으로 하나의 채널이 플롯은 모든 픽셀 값. 고친이있다면 따라서 CFP 형광 높은 픽셀 위치도 ReAsH의 형광 높은 것입니다.
- 공동 상관 픽셀을 분석하기 위해 8 비트 ReAsH 및 세룰리안 / GFP 이미지 ImageJ에서 열려 있는지 확인하십시오.
- 아래 표시된대로 '이미지 상관기 "플러그인을 엽니다. ReAsH 또는 Flash 스택과 형광 단백질 스택으로 "Image2"로 "Image1"를 선택하십시오.
- 그 결과 스택은 모든 자세한 정보를 표시하지 않을 수 있습니다 -이 정상입니다. "Scatterplots"라는 새 폴더에 스택을 저장하고 그것을 그것이 참조하는 샘플과 동일한 파일 이름을 지정 (예 : "플래시 - 체리 상관 줄거리")
- 데이터를 보려면 의미 당신은 두 가지 옵션 중 하나를 할 수 있습니다. 이 로그 형식으로되어 있도록 먼저 데이터를 변환. 그렇다면 시각적으로 다음과 같이 데이터를 rescale :
- 또는, 당신은 단지 낮은 값을 표시 (예 : 1-255)과 특수 LUT를 사용하여 데이터를 표시하는 시각 데이터를 rescale 수 있습니다. LUT가 (테이블을 보라) 이미지에서 각 픽셀 값에 할당된 색상의 테이블을 나타냅니다 . 이것은 이미지에 대한 pseudocolor 스키마를 정의하는 데 사용하고 이미지의 특정 기능을 정의하는 데 유용합니다 수 있습니다. "LUT 편집기"에 대한 사용자 정의 LUT 클릭을 만들고 같은 (이것은 저장하고 나중에 사용할 수 있습니다) 그림과 같이 새로 만들 수 있습니다.
- 0-255에서 밝기 / 대비 범위 (위의 단계 13에서 설명한) 설정합니다. 화면에 표시된 것과 같은 이미지 "에서 잠금"이미지가 각 픽셀의 빨강, 녹색 및 파랑 색상의 각 8 비트 값을 저장 RGB 형식으로 변환할 수 있습니다.
다른 프로그램에 이미지를 복사하여 붙여 넣으려면 먼저 8 비트 또는 16 비트 이미지를 엽니다. 위의 14 단계에서 설명한 이미지 LUT 색 구성표를 지정합니다. CFP 들어, 아래에 설명된 "청록색"LUT를 지정 ...
- 이미지를 선택하고 클립 보드에 복사를 선택 ...
4. 대표 결과 :
biarsenical 염료와 라벨링 세포의 성공은 몇 가지 주요 매개 변수에 따라 달라집니다. 먼저 염료와 라벨의 타이밍이 중요합니다. 우리가 찾은 그 상표의 연장 기간 (이상 30 분) 이외의 구체적인 배경 얼룩 높은 수준의 결과. 그림 1은 이전 7 설명한 것처럼 TC 태그를 포함하는 CFP 파생 세룰리안에 융합 huntingtin 조각의 야생 식 양식 (25Q)에 대한 전형적인 결과를 보여줍니다. 이 샘플은 ReAsH 30 분 스테인드 및 TC 태그를 부족 샘플에서 최소한의 배경이있다했습니다. 우리는 paraformaldehyde 증가의 배경으로 세포를 고정하는 것은 메탄올로 고정하면 형광 단백질 태그의 형광을 abrogates 동안 나타났습니다. 따라서 세포가 가능한 우리가 이미지를 살고 있습니다. 또한 그 전에 고정에 유의하는 것이 중요하다biarsenical 염료와 라벨을하면 TC 모티브로의 변경으로 인해 아마도 그들의 바인딩을 방지합니다.
일관성있는 결과를 또 다른 중요한 요인은 세포의 밀도입니다. 우리는 느슨하게 배포되고 또한 광범위한 clumping 다른 세포에 biarsenical 염료의 고르지 얼룩으로 이어질 수있는 이미지 세포에 중요한 발견했다.
그림 1. Tetracysteine 태그와 huntingtin (exon1 - 25Q) 세룰리안 fusions와 함께 살고 transfected 세포 ReAsH 염색법. TC 태그는 huntingtin - 세룰리안 융합합니다 (7 설명)의 교차점에 위치하고 있습니다. 픽셀 강도 상관 줄거리는 세포를 통해 바인딩 ReAsH의 차이에 대한 평가를 가능하게하고 conformational 변경 또는 리간드 상호 작용에 의한 구속력 ReAsH의 변화를지도하는 데 사용할 수 있습니다.
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Discussion
두 번째 염료와 형광 단백질과 conformational 속성 레이블 단백질 지방화에 대한 접근 방법은 단백질의 다양한 conformations가 세포와 단백질 형태의 역학을 변경 이벤트에 발생한 위치를 매핑에 대한 많은 가능성을 제공합니다. ReAsH / 플래시 먼저 포유 동물 세포 retinoic 산성 바인딩 단백질 I 4 단백질 접힘에 대한의 세포 센서로 사용되었다. 이 예제에서는 TC 태그에 바운드 플래시 제가 펼쳐 양식에 상대적으로 접힌 형태의 형광 수율 감소했다 세포 retinoic 산성 바인딩 단백질로 설계하고, 접는는 E.으로 추적할 수 대장균 세포. 최근에는 단백질 접힘과 자기 협회는 bipartite tetracysteine 표시 6 모델 단백질에서 시연되었다. 이 예제에서는 모델 펩티드의 말초 dicysteine 쌍은 dicysteine 쌍을 포함하는이 펩티드의 결합시 또는 바인딩 biarsenical 염료에 대한 기능 tetracysteine의 모티브를 재구성하는 펩타이드의 접는로 가까운 거리에 가지고 있었다. 우리는 TC 태그로 인해 oligomers에서 단량체를 구분 개발 센서로 한 걸음 더 나아가이 방법을 취했던 모든 oligomeric 형태 7 구속력을 biarsenical 염색에서 occluded되었다.
TC 태그와 conformational 변화와 협회 기자 등 biarsenical 염료의 잠재력에도 불구하고, 방법론은 기본 배경 형광 구의 결과로서 형광 단백질에 비해 비교적 낮은 신호 / 노이즈 신호를 필요에 시달리고. 따라서 형태 센서를 개발하는 노력에 같은 13 아미노 산성 펩티드 순서 3 coumarin의 derivates을 conjugates 엔지니어링 형광단의 ligase 시스템으로 개발되고 다른 새로운 분류 방법의 몇 가지를 테스트 보람 것입니다.
여기에 제시 분석 세포의 차이 내에서 관심의 단백질에 ReAsH / 플래시의 바인딩에서 발생하는 위치를 검사하기 위해 추가로 확장할 수 있습니다. 이렇게하려면 이미지의 관심 영역 (ROI)을 생성하고 이미지의 다른 부분을 (이것은 모든 ImageJ에서 할 수 있습니다) 필터 마스크로 변환하여 subregions로 나눌 수 있습니다. 따라서 픽셀 밀도 플롯의 비교에 의해 그것은 통계 센서를 사용하여 세포 subregions 차이를 평가할 수 있어야한다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 DMH와 TDM (NHMRC 프로젝트 보조금)에 부여로 투자했다. DMH는 미건야 트러스트에 의해 자금을 그림 웨이드 연구원입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well μ-slides | Ibidi | 80826 | We find these chamber slides to be particularly useful for culturing cells for imaging. |
| TC-FlAsH II In-cell Tetracysteine Tag Detection Kit *green fluorescence* *for live-cell imaging | Invitrogen | T34561 (FlAsH) or T34562 (ReAsH) | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-103 | |
| 2,3-Dimercapto-1-propanol | Sigma-Aldrich | D1129-5ML | |
| 1,2-Ethanedithiol | Sigma-Aldrich | 02390-25ML |
References
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