Summary
Мы показываем, изготовление недорогих криогенных этапе разработаны, чтобы соответствовать самым отражение микроскопы света. Эта лаборатория встроенной криогенной стадии позволяет эффективно и надежный коррелятивных изображений между крио-свет и крио-электронной микроскопии.
Abstract
Связь крио-световой микроскопии (крио-LM) и крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ) представляет ряд преимуществ для понимания клеточной динамики и ультраструктура. Во-первых, клетки могут быть отображены в ближайшем родной среде для обоих методов. Во-вторых, из-за процесса стеклования, образцы сохраняются при быстрой физической иммобилизации, а не медленной фиксации химических веществ. В-третьих, изображение того же образца и с крио-LM и крио-ЭМ обеспечивает корреляцию данных из одной клетки, а не сравнение "репрезентативной выборки". Хотя эти преимущества хорошо известны из предыдущих исследований, широкое использование корреляционного крио-LM и крио-ЭМ остается ограниченным из-за расходы и сложность покупке или строительстве подходящего криогенной стадии световой микроскопии. Здесь мы показываем, сборки, а также использование недорогих криогенных этап, который может быть изготовлен в любой лаборатории менее чем за $ 40 с части, обнаруженные на местном оборудовании и продуктовых магазинах. Этот крио-LM этап предназначен для использования с отраженным светом микроскопы, которые устанавливаются с длинными рабочими целями расстояние воздуха. Для корреляционного крио-LM и крио-ЭМ исследования, мы адаптируем использования углеродных покрытием стандартной 3-мм крио-ЭМ сетки в качестве образца поддерживает. После адсорбции образца к сетке, ранее установленные протоколы для витрификации образцов и передачи / обработки сетки следует разрешить мульти-метод визуализации. В результате, эта установка позволяет любой лаборатории с отраженным светом микроскопом, чтобы иметь доступ к прямой коррелятивной изображений замороженных гидратированных образцов.
Protocol
1. Изготовление и монтаж
- Место раковина алюминия тепло внутри 22,96 см (9 ") кастрюли пирога примерно 2 см от сторон на сковороде, как показано на рисунке 1c Использование черный маркер, отметьте отверстия для алюминиевого радиатора Примечание:.. Если алюминия блок (купить в местном магазине металлолома или на сайте http://www.onlinemetals.com ) не идут с предварительно просверленные отверстия, вам необходимо договориться иметь отверстия, просверленные и потайной до шага 1 по обеспечению алюминия блок в кастрюлю пирога. Мы использовали 5 отверстий для обеспечения блока платформы и 4 дополнительных отверстий, чтобы пузырьки азота сбежать из-под алюминий.
- Место крио-сеткой поле, расположенном рядом расположения алюминиевого радиатора и отметьте насечкой и с каждой стороны.
- Дрель отверстия для каждой отмеченной позиции, используя # 17 сверло для алюминиевых отверстия радиатора и № 35 сверло для крио-сетка отверстий коробки.
- Горы раковина алюминия тепло с помощью 5 - № 10, 1,9 см (3 / 4 ") с плоской головкой прорези болты и соответствующие орехов, а также 15 - # 10 шайб Место две шайбы под алюминиевый блок и третий на обратной стороне. кастрюли пирога для каждой скважины. Примечание: Необеспеченные свесы из алюминиевого блока возле область просмотра может привести к вибрации, которые ограничивают возможности визуализации сцены Убедитесь, что все крепежные болты плотно затянуты..
- Вставка 3 - № 4, 0,95 см (3 / 8 ") круглые прорези болты и гайки с соответствующей задней пирога кастрюлю, чтобы действовать как крио-сеткой окна монтирования.
- Лента 4 палочки в парах с одной палочки на вершине другого. Лента каждой паре противоположных ребер кекса выступать в качестве прокладки.
- Влажные верхней и нижней поверхности торта и пирог кастрюли, соответственно, с DDH 2 O.
- Заполните кекса с двумя слоями изоляционной пены брызг. Смачивание каждого слоя перед переходом к следующему шагу.
- Пресс кастрюли пирога в пену.
- Флип кастрюли с ног на голову и нажмите на торт сковороде до прокладки контакт пирога кастрюлю. Размещать любую взвешенный объект поверх кекса и пусть сидят всю ночь, чтобы вылечить.
- С зазубренный нож, срежьте избыточный сушеные изоляционной пены брызг от края кастрюли и удалить палочками для еды.
- Снимите кастрюлю с торта пирог кастрюли. Пирог кастрюли с алюминиевой радиатора теперь изолирован и будет называться "криогенная ступень" (рис. 1а).
- Место прозрачной пластиковой буфер обмена (любого цвета и более 3 мм) по сравнению с верхней части криогенной ступени. Марка с черным маркером расположение крио-сеткой окна горы, рисуя круг примерно в 1,5 раза больше диаметра один раунд крио-сеткой окна. Вырежьте отверстие 1,9 см (3 / 4 ") отверстие видел. Этот буфер обмена будет называться" экран загрузки "(рис. 1б).
- Поместите новый прозрачный буфер обмена поверх криогенной ступени и место на микроскоп с радиатором прямо под объективы. С черным маркером, наметить пути целей, как они вращаются.
- Разрезать вдоль отмеченной линии удаления полукруг от края буфер обмена. Это может быть выполнено с помощью лобзика или с использованием 7,62 см (3 ") отверстие видел несколько раз, как показано на видео.
- Наконец сократить 1,9 см (3 / 4 ") отверстие от полукруга, но все еще в пределах области блюдо. Это будет порт для заправки жидким азотом (LN 2) если уровень падает в то время как изображения. Этот буфер обмена будет называться как "проекционный экран" (рис. 1в).
2. Подготовка образцов
- Развести дрожжи логарифмической фазы клетки, выращенные в синтетических полной (SC) СМИ соответствующей концентрации 1х10 6 клеток / мл в воде.
- 2 мл разбавленной дрожжей пипеткой на R2 / 1 400 сетки дырявые углерода покрытые медью крио-ЭМ сетки (SPI поставки, Уэст-Честер, штат Пенсильвания) и позволил адсорбировать на 15 секунд.
- Пятно от лишней жидкости из сетки поверхности соприкасается с задней сетки разрывается кусок мягкой ткани целлюлозы (Kimwipe) в течение 2 секунд.
- При необходимости сетку можно мыть с 3 мкл капли воды (1-3 раза), и злой мест, как в шаге 3 к промокательной со спины.
- Перед последней промывки, образцы загружают в морозильную камеру окунуться пневматических и висит сетка промывается, как в пункте 2.4. После промокательной сетку с рваной бумаги ткани (Kimwipe), чтобы удалить большую часть воды с поверхности, сетки погружается в Ln 2 охлажденного жидкого этана и переданы в крио-сетки ящик для хранения Примечание 1:. Важно оставить слой жидкости как можно тоньше на поверхности, чтобы сохранить образец обезвоживания. Неправильное промокательной либо высыхают образца или оставить лед, который является непрозрачным для электронного пучка.
3. Cryo-световой микроскопии
- Заполните криогенных сцене сLN 2 и быстро накройте экран загрузки (пластик буфер обмена с одним 1,9 см (3 / 4 "), отверстие).
- После металла достигает Ln 2 температуры, передача крио-сетки ящик через 1,9 см (3 / 4 ") отверстие экран загрузки и передачи в гору созданный 3 винта, описанных в части A5. Отвинтите крио-сетки окна его из держателя и снимите держатель для улучшения доступа. Имейте крио-сетки окно держателя под Ln 2 в отдельной Дьюара до шага 3.10. крио-сетки окна должны также находиться под LN 2 для предотвращения потепления образец сетки.
- . Refill Ln 2 в криогенной стадии чуть ниже верхней части алюминиевого радиатора Примечание: Л. Н. 2 уровня должно периодически проверяться и пополнен в течение визуализации процесса для обеспечения Ln 2 постоянно в контакте с радиатором. В общем, заправка происходит каждые 10 минут через заполнить порт просмотра на экране.
- Предварительное охлаждение пинцет чаевые в LN 2, а затем перенести ваши сетки (ы) на плоской поверхности просмотра раковина алюминия тепла с помощью пинцета, используя 1,9 см (3 / 4 ") отверстие экрана загрузки.
- Тщательно перемещать крио-этапе цель отверстия под отраженный свет микроскопа.
- Место прозрачной просмотра на экране поверх экрана загрузки. Затем медленно удалить экран загрузки, сдвинув его под проекционный экран. Примечание: На данный момент, образец наиболее уязвимы. Все воздушные потоки вокруг микроскопа должно быть сведено к минимуму, в том числе: дыхания, поблизости открывания двери, люди проходят мимо, и т.д. Мы рекомендуем носить маски или висит прозрачная защитная маска ниже окуляры микроскопа в качестве меры предосторожности.
- Поворот объективы в холодной окружающей среде газообразного азота из крио-сцены и сканирование образца на плоский участок раковины просмотр тепла. Используя стандартные светлого поля световой микроскопии сосредоточиться на сетке с низким целью увеличения найти центр и принять обзора изображения. Технические требования к освещенности микроскопии использовали для этого эксперимента приведены в Экспериментальная часть материалов. Примечание: Ln 2 не вступают в контакт с линз объектива и нам еще предстоит увидеть деградацию изображения или повреждения линзы от эффекта охлаждения .
- Фокус в большом увеличении на сферу интересов и получать данные с светлое поле, темное поле, поляризованный свет или флуоресценции. Обязательно запишите расположение области интереса на малом увеличении яркое изображение поле для будущей корреляции. Если все перечисленные выше меры предосторожности для заправки Ln 2 следуют, то положительного давления от испарения азота достаточно для поддержания свободной загрязнения окружающей среды (независимо от влажности в помещении) в течение всего срока изображений.
- После завершения, заменить загрузочный экран, сдвинув ее поверх просмотра на экране. Удалить просмотра на экране, замедляя сдвинув ее под экран загрузки.
- Удалить этап крио от микроскопа и с предварительным охлаждением пинцет, передача сетку обратно в крио-сеткой окна. Винт крио-сеткой окна держатель в крио-сеткой окна, чтобы запечатать против окружающей среды и передача владельцу LN2 Дьюара для хранения и будущего изображения.
4. Крио-электронной микроскопии
- После стандартных и устоявшиеся методы, загрузить образец сетки в крио-ЭМ передачи владельцу, сохраняя при этом образце при температуре жидкого азота во все времена.
- Вставьте крио-держатель с образцом сетки в электронной микроскопии.
- В подходящем низкой зрения увеличением (50-500x Номинальное увеличение), найти центр образца сетки.
- Использование ранее собранных малом увеличении крио-LM данным шагом 3,7 для определения относительной ориентации центральной вкладки сетки меди (как показано на рис 2) и определить точное областях, представляющих интерес для корреляции.
- Приступить к микроскоп выравнивание, низкие дозы крио-ЭМ визуализации и сбора данных.
5. Представитель Результаты
Криогенной ступени (рис. 1а) является эффективным способом сбора крио-LM данных для крио-флуоресцентной микроскопии и корреляционного анализа cryo-LM/cryo-EM. Рисунок 2 показывает, как сочетание низкого и высокого увеличения крио-LM изображений позволяет создавать ссылки карты, которые направят вас к конкретным областям, в крио-ЭМ. В результате крио-LM ссылка карте (рис. 2б) был использован во время крио-ЭМ сбора данных, чтобы найти точное регионах показано на рисунке 3.
Рисунок 1. Крб.) Расположение криогенная ступень состоит из крио-сеткой окна передачи горе указано Wго белая стрелка и раковина алюминия тепла. Сетки переданы в Ln 2 из крио-сеткой окна и помещается непосредственно на область просмотра радиатора, как указано черной стрелкой. Б) изображение изображением криогенных сцену с экрана загрузки. Отверстия в экране загрузки размещается непосредственно над крио-сетки окна монтировать и выступает в качестве порта для передачи образцов и для перемещения образцов из крио-сеткой поле, чтобы образец область просмотра на радиаторе с помощью пинцета. В) криогенные этап в положение под объективы с проекционный экран на месте. Специальный вырез на экране просмотра позволяет объективы легко качаться на место, не двигая криогенной ступени. Отверстия в экране просмотра от площади образца выступает в качестве Ln 2 заполнить порт для пополнения Ln 2 уровнях, если это необходимо.
Рисунок 2. Навигация в крио-LM для корреляционных исследований.) Низкая увеличением крио-LM вид дрожжевых клеток придерживался образца сетки. Б) то же изображение в () перекрывается большим увеличением флуоресценции образ область интересов и с заполненной оранжевый многоугольник маркировки центре образца сетки. Центр состоит из группы из четырех квадратов, имеющих три дополнительных вкладки металла и далее открытым. Для трех квадратов с дополнительной вкладке металла, две пары доля вкладку о длинной и короткой осей формирования асимметричных центра. Это асимметричный центр можно увидеть в левом верхнем углу и используется для указания угла поворота и беспристрастности сетки между крио-LM и крио-ЭМ. С одной малом увеличении изображения многих областях, представляющих интерес может быть отмечен и используется в качестве эталонной карте, чтобы найти идентичные области в крио-ЭМ. В) увеличенных флуоресценции крио-LM образ область интересов в (б). HTA1-CFP, с-терминал CFP гистонов маркер, можно рассматривать как зеленый точечной структуры маркировки расположения ядра. Г) крио-ЭМ образ соответствующей области в (с). Шкала барах составляют 50 микрон.
Рисунок 3. Корреляция крио-LM и крио-ЭМ. Два поля зрения изображением одинаковых клеток дрожжей коррелирует с крио-светлого поля (а, г), крио-флуоресценции (б, е), и крио-EM (C, F ). баров шкалы представляют 5 микрон.
Discussion
Disclosures
Авторы заявляют не конкурирующие между собой финансовые интересы.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Брэндон Дж. Zipp и Кен Б. Каплан за предоставление доступа к штамм дрожжей, используемых в данном исследовании. Авторы также благодарят Хулио Ленина Домингес-Рамирес за помощью видеозаписи. JEE признает NIH финансовой поддержке гранта число 5RC1GM91755.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 – 22.86 cm (9") pie pan with sloped edge | Good Cook | Local grocery store | |
| 1 – 22.86 cm (9") cake pan | Good Cook | Local grocery store | |
| 4 pairs of chopsticks | Local grocery store | ||
| 1 - Great Stuff spray foam | Great Stuff | Local hardware store | |
| 1 - 4cm x8cm x1cm block of aluminum | Local hardware store or metal scrap yard | ||
| 5 - #10 1.91 cm (3/4") flat head slotted bolts w/ nuts | Local hardware store | ||
| 3 - #4 0.95 cm (3/8") round slotted bolts w/ nuts | Local hardware store | ||
| 15 - #10 washers | Local hardware store | ||
| 2 - transparent plastic clipboards | Local office store | ||
| 1 - Cryo-EM grid box holder | Ted Pella | 160-41 | |
| 1 - Cryo-EM grid box handling rod | Ted Pella | 160-46 | |
| 1 - R2/1 holey carbon film, 400-mesh copper cryo-EM support grid | SPI Supplies | 4340C-XA | |
Experimental materials |
|||
|
|||
References
- Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments. Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).
- Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes. Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).
- Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching. J Microsc. 227, 98-109 (2007).
- Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images. J Microsc. 238, 21-26 (2010).
- Sartori, A. Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography. J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).
- McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. J Microsc. 235, 273-281 (2009).
- van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells. Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).
- Gaietta, G. Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science. 296, 503-507 (2002).
- Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. Markers for correlated light and electron microscopy. Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).
