Low-Cost Cryo-Lumière de fabrication étape par microscopie lumineuse corrélées / Electron Microscopy

Summary

Nous démontrons la fabrication d'une scène à faible coût cryogénique conçu pour s'adapter à la plupart des microscopes optiques réfléchie. Cette étape de laboratoire construit cryogénique permet efficace et fiable d'imagerie corrélative entre la Cryo-lumière et cryo-microscopie électronique.

Abstract

Le couplage de la cryo-microscopie à la lumière (la cryo-LM) et la cryo-microscopie électronique (la cryo-ME) pose un certain nombre d'avantages pour la compréhension de la dynamique cellulaire et l'ultrastructure. Tout d'abord, les cellules peuvent être visualisées dans un environnement proche natif pour les deux techniques. Deuxièmement, en raison du processus de vitrification, les échantillons sont conservés par l'immobilisation physique rapide plutôt que la fixation chimique lente. Troisièmement, l'imagerie du même échantillon à la fois avec la cryo-LM et cryo-EM offre de corrélation des données provenant d'une seule cellule, plutôt que d'une comparaison des "échantillons représentatifs". Bien que ces avantages sont bien connus à partir d'études antérieures, l'utilisation généralisée des corrélative cryo-LM et cryo-EM reste limitée en raison de la dépense et la complexité de l'achat ou la construction d'un étage cryogénique convient microscopie optique. Ici nous démontrons l'assemblée, et l'utilisation d'un stade peu coûteuse cryogénique qui peut être fabriqué dans n'importe quel laboratoire pour moins de 40 $ avec des pièces trouvées dans les quincailleries et les épiceries locales. Cette étape cryo-LM est conçue pour une utilisation avec reflétée microscopes optiques qui sont équipés de longues travailler objectifs de l'air à distance. Pour corrélative cryo-ML et cryo-EM études, nous nous adaptons à l'utilisation du carbone revêtu standard de 3 mm cryo-EM grilles comme supports spécimen. Après adsorption de l'échantillon à la grille, les protocoles précédemment établies pour la vitrification de l'échantillon et le transfert / la manipulation de la grille sont suivies pour permettre multi-technique d'imagerie. En conséquence, cette configuration permet à n'importe quel laboratoire avec un microscope à lumière reflétée d'avoir accès à l'imagerie corrélative direct des échantillons congelés hydratés.

Protocol

1. Fabrication et montage

1. Placez le dissipateur thermique en aluminium à l'intérieur du 22,96 cm (9 ") moule à tarte d'environ 2 cm du côté de la poêle, comme le montre la figure 1c aide d'un marqueur noir, marque pour les trous de dissipateur thermique en aluminium Remarque:.. Si l'aluminium bloc (acheté dans un magasin de ferrailles locales ou en ligne à http://www.onlinemetals.com ) ne vient pas avec trous pré-percés, vous aurez besoin de prendre des dispositions pour avoir des trous percés et fraisés avant l'étape 1 pour obtenir de l'aluminium bloc à l'assiette à tarte. Nous avons utilisé 5 trous pour fixer le bloc à la plate-forme et 4 trous supplémentaires pour permettre aux bulles de gaz azote pour sortir du sous de l'aluminium.
2. Placez la boîte cryo-réseau à proximité de l'emplacement du puits de chaleur en aluminium et de marquer l'encoche et de chaque côté.
3. Percez des trous pour chaque position marquée en utilisant un bit # 17 trous de forage pour le radiateur en aluminium et un peu # 35 trous de forage pour le boîtier cryo-grille.
4. Montez le dissipateur thermique en aluminium avec 5 - # 10, 1,9 cm (3 / 4 ") à tête plate fendue boulons et écrous correspondants, ainsi que 15 - # 10 rondelles Placer deux rondelles en dessous du bloc en aluminium et le troisième à l'arrière de l'. moule à tarte pour chaque billet de trou:. surplombs non garantis du bloc en aluminium à proximité de la zone de visualisation peut entraîner des vibrations qui limitent les capacités d'imagerie de la scène Assurez-vous que tous les boulons de fixation sont bien serrées..
5. Insérer 3 - # 4, 0,95 cm (3 / 8 ") autour des boulons et des écrous à fente correspondante de l'arrière du moule à tarte d'agir comme la boîte de cryo-grille de montage.
6. Tape 4 baguettes en binôme avec un autre sommet baguettes. Ruban à chaque paire de bords opposés du moule à gâteau à agir comme des entretoises.
7. Mouiller la surface supérieure et inférieure du gâteau et la tarte aux casseroles respectivement avec ddH ₂ O.
8. Remplir le moule à cake avec deux couches de mousse isolante pulvérisée. Mouillant chaque couche avant d'aller à l'étape suivante.
9. Appuyez sur le moule à tarte dans la mousse.
10. Retourner les casseroles à l'envers et appuyez sur le moule à gâteau jusqu'à ce que le entretoises contacter le moule à tarte. Placez tous les objets pondérés au sommet de la moule à cake et laissez reposer toute la nuit pour guérir.
11. Avec un couteau dentelé, couper l'excès de pulvérisation de mousse isolante secs à partir du bord de la casseroles et enlever les baguettes.
12. Retirez le moule à gâteau de la moule à tarte. Le moule à tarte avec dissipateur thermique en aluminium est maintenant isolé et sera appelé le "étage cryotechnique» (figure 1a).
13. Placez une planchette à pince en plastique transparent (n'importe quelle couleur et plus de 3 mm d'épaisseur) sur le dessus de l'étage cryotechnique. Marquer avec un marqueur noir l'emplacement de la boîte de montage cryo-grille en dessinant un cercle d'environ 1,5 fois le diamètre d'un seul tour cryo-grille de la boîte. Découpez le trou avec un 1,9 cm (3 / 4 ") le trou vu. Ce presse-papier sera appelé le" écran de chargement "(Fig 1b).
14. Mettre un nouveau presse-papiers transparents au-dessus de l'étage cryogénique et le placer sur le microscope avec le dissipateur de chaleur directement sous lentilles de l'objectif. Avec un marqueur noir, marque le chemin des objectifs de leur rotation.
15. Coupez le long de la ligne marquée suppression d'un demi-cercle du bord de la planchette. Ceci peut être accompli avec une scie sauteuse ou en utilisant un 7,62 cm (3 ") le trou a vu plusieurs fois, comme indiqué dans la vidéo.
16. Enfin couper un trou de 1,9 cm (3 / 4 ") de demi-cercle, mais toujours dans la zone de l'antenne. Ce sera le port pour le remplissage d'azote liquide _(LN2), si baisse des niveaux tout en imagerie. Ce presse-papier sera renvoyé le "affichage à l'écran» (figure 1c).

2. Préparation des échantillons

1. Diluer la levure cellules phase log cultivé dans de synthèse complet (SC) des médias à une concentration appropriée de 1x10 ⁶ cellules / mL dans l'eau.
2. 2 ml de la levure diluée sont pipette sur une R2 / 1 400 mailles holey carbone revêtu de cuivre cryo-EM grille (fournitures SPI, West Chester, PA) et a permis à adsorber pendant 15 secondes.
3. Blot loin l'excès de liquide de la surface de la grille en touchant l'arrière de la grille pour un morceau de tissu déchiré de cellulose souple (Kimwipe) pendant 2 secondes.
4. Si nécessaire, la grille peut être lavée avec 3 gouttes uL d'eau (1-3 fois), et les méchants de suite que dans l'étape 3 en tamponnant à l'arrière.
5. Avant le lavage final, l'échantillon est chargé dans le congélateur plonger pneumatiques et la grille de la pendaison est lavé comme à l'étape 2.4. Après transfert de la grille avec un papier tissu déchiré (Kimwipe) pour enlever la majorité de l'eau de la surface, la grille est plongé dans ln ₂ éthane liquide refroidi et transféré à une boîte de cryo-grille pour le stockage Remarque ^1:. Il est important de laisser une couche de liquide aussi mince que possible sur la surface à conserver l'échantillon hydraté. Une mauvaise buvard sera soit sécher l'échantillon ou de quitter la glace qui est opaque au faisceau d'électrons.

3. Cryo-microscopie lumineuse

1. Remplir le stade cryogéniquesLN ₂ et de couvrir rapidement avec l'écran de chargement (clipboard en plastique avec une seule 1,9 cm (3 / 4 ") le trou).
2. Une fois que le métal atteigne la température de ln _2, le transfert de la boîte cryo-réseau à travers les 1,9 cm (3 / 4 ") le trou de l'écran de chargement et de transfert dans le montage créé par les 3 vis décrite dans la partie A5. Dévissez la boîte cryo-grille de son support et retirez le support pour améliorer l'accès. Maintenez le porte-case cryo-grille sous LN ₂ dans un dewar séparés jusqu'à l'étape 3.10. La boîte de cryo-réseau devraient également être maintenus sous LN ₂ pour empêcher le réchauffement de grille d'échantillonnage.
3. . Recharge LN ₂ de l'étage cryotechnique juste en dessous du haut de l'évier de chaleur en aluminium Remarque: ln ₂ niveaux doivent être vérifiés périodiquement et rempli pendant le processus d'imagerie afin d'assurer ln ₂ est continuellement en contact avec le dissipateur thermique. En général, la recharge se produit toutes les 10 minutes via le port de remplir l'écran de visualisation.
4. Pré-refroidir la pointe pince en ln _2, puis le transfert de votre grille (s) sur la surface plate de la visualisation dissipateur thermique en aluminium avec des pincettes, en utilisant le 1,9 cm (3 / 4 ") le trou de l'écran de chargement.
5. Soigneusement déplacer la cryo-dessous de scène pour les ouvertures objectif du microscope de lumière réfléchie.
6. Placez l'écran d'affichage transparents au-dessus de l'écran de chargement. Puis retirez lentement l'écran de chargement en le faisant glisser sous l'écran Remarque visualisation:. A ce stade, l'échantillon est le plus vulnérable. Tous les courants d'air autour du microscope doit être minimisée, notamment: la respiration, une ouverture de porte à proximité, les gens marchant passé, etc Nous vous suggérons de porter un masque ou d'accrocher un écran facial transparent ci-dessous les oculaires du microscope comme une mesure de précaution.
7. Tournez lentilles de l'objectif dans l'environnement de gaz d'azote froid de la cryo-scène et de balayage de l'échantillon sur la zone de visualisation dissipateur thermique plat. Utilisation de la norme lumière des techniques de microscopie en champ se concentrer sur la grille avec un objectif de faible grossissement pour trouver le centre et prendre une image d'aperçu. Spécifications concernant les lentilles de microscope optique utilisé pour cette expérience sont répertoriés dans la section expérimentale des matériaux. Remarque: ln ₂ n'entre pas en contact avec les lentilles de l'objectif et nous avons encore à voir la dégradation des images ou des dommages aux lentilles des effets du refroidissement .
8. Focus dans grossissement élevé sur une zone d'intérêt et d'acquérir des données avec un champ clair, fond noir, la lumière polarisée ou l'imagerie de fluorescence. Soyez sûr d'enregistrer l'emplacement de la zone d'intérêt sur l'image de terrain faible grossissement brillante pour la corrélation future. Si toutes les précautions énumérées ci-dessus pour le remplissage de la LN ₂ sont suivis, la pression positive de l'azote s'évapore est suffisante pour maintenir un environnement sans contamination (indépendante de l'humidité ambiante) pour la durée de l'imagerie.
9. Une fois terminé, remplacez l'écran de chargement en le faisant glisser sur le haut de l'écran de visualisation. Enlever l'écran d'affichage en ralentissant le faisant glisser sous l'écran de chargement.
10. Retirez le stade de la cryo microscope et avec pré-refroidissement des pincettes, le transfert de la grille de revenir à la boîte de cryo-grille. Visser le support boîte de cryo-grille dans la grille de cryo-case pour sceller contre l'environnement et le transfert à son détenteur d'un dewar LN2 pour le stockage et l'imagerie avenir.

4. Cryo-microscopie électronique

1. Suite à des techniques standard et établie, la charge de la grille de l'échantillon dans un support de transfert de cryo-EM tout en gardant l'échantillon à température de l'azote liquide à tout moment.
2. Insérez la cryo-porte avec grille échantillon dans un microscope électronique à transmission.
3. Dans une vue en faible grossissement adaptés (50-500x de grossissement nominal), trouver le centre de la grille d'échantillonnage.
4. Utilisez le faible grossissement précédemment recueillies cryo-LM données de l'étape 3.7 pour déterminer l'orientation relative des onglets de la grille en cuivre central (comme décrit dans la figure 2) et d'identifier les domaines précis d'intérêt pour la corrélation.
5. Procéder à l'alignement de microscope, à faible dose cryo-EM imagerie et de collecte de données.

5. Les résultats représentatifs

L'étage cryogénique (figure 1a) est un moyen efficace de rassembler des cryo-LM de données pour la cryo-microscopie par fluorescence et analyse cryo-LM/cryo-EM corrélative. La figure 2 montre comment la combinaison de bas et haut de grossissement cryo-LM images vous permet de construire des cartes de référence qui vous dirigent vers des zones spécifiques en cryo-EM. La résultante de cryo-LM carte de référence (figure 2b) a été utilisé lors de la cryo-EM acquisition de données pour localiser des régions exacte de la figure 3.

Figure 1. Étage cryogénique. A) L'aménagement de l'étage cryotechnique est constitué d'un transfert de zone de cryo-grille de montage indiqué wvec une flèche blanche et d'un dissipateur thermique en aluminium. Les grilles sont transférés en vertu de ln ₂ de la boîte de cryo-grille et placé directement sur ​​la zone de visualisation du dissipateur de chaleur, comme indiqué par la flèche noire. B) Image illustrant l'étage cryotechnique avec écran de chargement. Le trou dans l'écran de chargement est placé directement sur ​​la boîte cryo-grille de monter et agit comme un port de transférer des échantillons et des échantillons pour le déplacement de la boîte de cryo-grille à la surface de l'échantillon visualisation sur le dissipateur de chaleur avec des pincettes. C) Le cryogénique étape dans la position sous les lentilles d'objectif avec l'affichage à l'écran en place. La découpe spéciale sur l'écran d'affichage permet de lentilles de l'objectif de facilement swing dans la position sans bouger l'étage cryotechnique. Le trou dans l'écran de visualisation loin de la zone de l'échantillon agit comme un ln ₂ orifice de remplissage pour reconstituer ln ₂ niveaux si nécessaire.

Figure 2. Navigation dans la cryo-LM pour les études corrélatives. A) à faible grossissement cryo-LM vue des cellules de levure adhère à une grille d'échantillonnage. B) La même image dans (a) recouverte d'une image à fort grossissement de fluorescence d'une zone d'intérêt et avec un polygone rempli d'orange marquant le centre de la grille d'échantillonnage. Le centre se compose d'un groupe de quatre carrés, trois ayant une languette métallique supplémentaire et le quatrième ouvert. Pour les trois places avec une languette métallique supplémentaire, deux paires part l'onglet sur les axes longs et courts formant un centre asymétrique. Ce centre asymétrique peut être vu dans le coin supérieur gauche et a été utilisé pour indiquer l'angle de rotation et d'impartialité de la grille entre les cryo-LM et cryo-EM. D'un faible grossissement de nombreuses zones de l'image d'intérêt peut être marqué et utilisé comme une carte de référence pour localiser les zones identiques en cryo-EM. C) Un magnifié par fluorescence cryo-LM image de la zone d'intérêt en (b). HTA1-PCP, un marqueur de la PCP C-terminale des histones, peut être vu comme une structure verte ponctuée d'étiquetage de l'emplacement du noyau. D) Une image cryo-EM de la zone correspondante (c). Barres d'échelle représentent 50 microns.

Figure 3. Corrélation des cryo-LM et cryo-EM. Deux champs de vue montrant des cellules de levure identiques en corrélation avec la cryo-fond clair (A, D), la cryo-fluorescence (B, E), et cryo-EM (C, F Barres d'échelle). représentent 5 microns.

Discussion

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 – 22.86 cm (9") pie pan with sloped edge	Good Cook		Local grocery store
1 – 22.86 cm (9") cake pan	Good Cook		Local grocery store
4 pairs of chopsticks			Local grocery store
1 - Great Stuff spray foam	Great Stuff		Local hardware store
1 - 4cm x8cm x1cm block of aluminum			Local hardware store or metal scrap yard
5 - #10 1.91 cm (3/4") flat head slotted bolts w/ nuts			Local hardware store
3 - #4 0.95 cm (3/8") round slotted bolts w/ nuts			Local hardware store
15 - #10 washers			Local hardware store
2 - transparent plastic clipboards			Local office store
1 - Cryo-EM grid box holder	Ted Pella	160-41
1 - Cryo-EM grid box handling rod	Ted Pella	160-46
1 - R2/1 holey carbon film, 400-mesh copper cryo-EM support grid	SPI Supplies	4340C-XA
Experimental materials
Yeast strain: Hta1-CFP::Kan (KSC-3382: MATa, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-CFP::KanMX6 from the Kaplan lab at UC Davis). Cryo-Light Microscopy: Cryo-light microscopy images were taken on a Leica DM4000M reflecting microscope with a Leica DFC310 FX CCD camera. Bright Field, Dark Field and Fluorescence images were acquired using either a HCX PL FLUOTAR 5x 0.15 N.A. air objective, a HCX PL FLUOTAR 10x 0.30 N.A. air objective, a PL FLUOTAR 50x 0.55 N.A. air objective or a NPLAN 100x 0.75 N.A. air objective. Bright Field and Dark Field images used a 12V 100W tungsten lamp as the light source. For Fluorescence, an EL6000 UV lamp source was used in conjunction with a Leica JC1 (Ex.F.: BP 480/30, D.M.: LP 505, S.F. BP 535/40 & LP 580) Filter Cube. Cryo-Transmission Electron Microscopy: Cryo-EM images were acquired on a JEM-2100-FEG Transmission Electron Microscope (JEOL, Japan) operating at 200 KeV utilizing a Gatan 626 cryo-transfer holder (Gatan, USA). Micrographs were recorded at nominal magnifications of 50, 200, 1,200 and 4,000X on a 4,096 x 4,096 pixel Tietz CCD camera (TVIPS, Gauting, Germany).