Low-Cost Cryo-Light Microscopy Bühne Fabrication für Correlated Light / Electron Microscopy

Summary

Wir zeigen die Herstellung eines Low-Cost-Kryo-Stadium entwickelt, um die meisten Auflichtmikroskope fit. Dieses Labor gebaut kryogenen Stufe ermöglicht eine effiziente und zuverlässige korrelative Bildgebung zwischen Kryo-Licht und Kryo-Elektronenmikroskopie.

Abstract

Die Kopplung der Kryo-Lichtmikroskopie (Kryo-LM) und Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) stellt eine Reihe von Vorteilen für das Verständnis der zellulären Dynamik und Ultrastruktur. Erstens können Zellen in einer natürlichen Umgebung in der Nähe für beide Techniken abgebildet werden. Zweitens durch die Verglasung Prozess, werden die Proben durch schnelle physikalische Immobilisierung statt langsamen chemischen Fixierung erhalten. Drittens Bildgebung der gleichen Probe mit beiden Kryo-LM und Kryo-EM bietet Korrelation von Daten aus einer einzigen Zelle, sondern als ein Vergleich von "repräsentativen Stichproben". Während diese Vorteile auch aus früheren Studien bekannt sind, begrenzt die weit verbreitete Nutzung von korrelativen Kryo-LM und Kryo-EM bleibt aufgrund der Kosten und Komplexität der Kauf oder Bau eines geeigneten kryogenen Lichtmikroskopie Bühne. Hier zeigen wir die Montage und Verwendung eines kostengünstigen kryogenen Bühne, die in jedem Labor für weniger als $ 40 mit Teilen auf lokaler Hard-und Lebensmittelgeschäfte hergestellt werden können. Das Kryo-LM Bühne ist für den Einsatz mit Auflichtmikroskope, die mit großem Arbeitsabstand Luft Zielen ausgestattet ausgelegt sind. Für korrelative Kryo-LM und Kryo-EM-Untersuchungen, passen wir den Einsatz von Carbon beschichtet Standard-3-mm Kryo-EM-Grids als Muster unterstützt. Nach Adsorption der Probe an das Netz sind bereits etablierten Protokollen zur Verglasung der Probe und die Übertragung / Umgang mit dem Netz gefolgt, um multi-Technik Bildgebung ermöglichen. Als Folge können diese Einstellung jedes Labor mit einem Auflichtmikroskop, den Zugang zu direkten korrelativen Bildgebung von gefrorenen hydratisierten Proben haben.

Protocol

1. Fertigung und Montage

1. Setzen Sie die Aluminium-Kühlkörper im Inneren des 22,96 cm (9 ") Kuchenform ca. 2 cm von der Seite der Pfanne, wie in Abbildung 1c gezeigten Mit einem schwarzen Filzstift markieren Löcher für die Aluminium-Kühlkörper Hinweis:.. Wenn das Aluminium Block (gekauft in einem lokalen Schrott-Shop oder online unter http://www.onlinemetals.com ) nicht mit vorgebohrten Löchern kommen, müssen Sie vereinbaren, dass Löcher gebohrt und die vor dem 1. Schritt, um das Aluminium zu sichern versenkt Block auf die Kuchenform. Wir haben 5 Löcher, um den Block auf die Plattform und 4 extra Löcher zu sichern, damit Stickstoff Gasblasen unter dem Aluminium zu entkommen.
2. Legen Sie die Kryo-Gitterbox in der Nähe der Position des Aluminium-Kühlkörper und markieren Sie die Kerbe und jeder Seite.
3. Bohren Sie Löcher für jede markierte Position mit einem # 17 Bohrer für die Aluminium-Kühlkörper Löcher und Nr. 35 Bohrer für die Kryo-Gitterbox Löcher.
4. Montieren Sie die Aluminium-Kühlkörper mit 5 - Nr. 10, 1,9 cm (4.3 ") flacher Kopf Schlitzschrauben und entsprechenden Muttern sowie 15 - # 10 Scheiben Platz zwei Scheiben unter dem Aluminium-Block und der dritte auf der Rückseite der. Kuchenform für jedes Loch. Hinweis: Ungesicherte Überhänge der Aluminium-Block in der Nähe der Bildfläche kann in Schwingungen, die Möglichkeiten der Bildgebung von der Bühne zu begrenzen Ergebnis Überprüfen Sie, ob alle Schrauben fest angezogen sind..
5. Insert 3 - Nr. 4, 0,95 cm (8.3 ") runden Schlitz Schrauben und entsprechenden Muttern von der Rückseite der Kuchenform als Kryo-Gitterbox montieren zu handeln.
6. Tape 4 Stäbchen zusammen in Paaren mit einem Stäbchen auf einer anderen. Band jedes Paar an gegenüberliegenden Rändern der Kuchenform als Abstandshalter fungieren.
7. Wet den oberen und unteren Oberfläche des Kuchens und Kuchen Pfannen jeweils mit ddH ₂ O.
8. Füllen Sie die Kuchenform mit zwei Schichten aus isolierenden Schaum. Benetzung jeder Schicht, bevor Sie zum nächsten Schritt.
9. Drücken Sie die Kuchenform in den Schaum.
10. Drehen Sie die Pfannen auf den Kopf und drücken Sie auf der Kuchenform, bis die Abstandshalter an die Kuchenform. Legen Sie alle gewichteten Objekt oben auf den Kuchen Pfanne und lassen sich über Nacht zu heilen.
11. Mit einem gezackten Messer, schneiden Sie das überschüssige getrocknet isolierende Spritzschaum vom Rand der Pfannen und entfernen Sie die Stäbchen.
12. Entfernen Sie die Kuchenform aus der Kuchenform. Die Kuchenform mit Aluminium-Kühlkörper ist nun isoliert und wird als "Kryo-Bühne" (Abb. 1a) bezeichnet werden.
13. Legen Sie eine transparente Kunststoff Zwischenablage (jeder Farbe und größer als 3 mm dick) über die Oberseite der kryogenen Bühne. Mark mit einem schwarzen Marker die Lage der Kryo-Gitterbox Montage durch Zeichnen eines Kreises ungefähr 1,5 fache des Durchmessers einer einzigen Runde Kryo-Gitterbox. Cut-out-Bohrloch mit einem 1,9 cm (4.3 ") Loch sah. Diese Zwischenablage wird als die bezeichnet werden" loading screen "(Abb. 1b).
14. Legen Sie eine neue transparente Ablage oben auf der kryogenen Bühne und Platz auf dem Mikroskop mit dem Kühlkörper direkt unter dem Objektiv. Mit einem schwarzen Marker, markieren Sie den Pfad der Ziele, wie sie zu drehen.
15. Schneiden Sie entlang der markierten Linie das Entfernen eines Halbkreises vom Rand in die Zwischenablage. Dies kann mit einer Stichsäge oder mit einem 7,62 cm (3 ") Lochsäge mehrmals wie im Video gezeigt, erreicht werden.
16. Schließlich schnitt ein 1,9 cm (4.3 ") Loch weg von der Halbkreis, aber immer noch innerhalb des Bereichs der Schale. Dies wird den Hafen werden zum Nachfüllen flüssigem Stickstoff (LN _2), wenn Ebenen sinken, während Bildgebung. Diese Zwischenablage bezeichnet wird als "Anzeige-Bildschirm" (Abb. 1c).

2. Probenvorbereitung

1. Verdünnen Sie log-Phase Hefezellen in synthetische vollständige (SC) Medien auf eine geeignete Konzentration von 1x10 ⁶ Zellen / ml in Wasser gewachsen.
2. 2 mL der verdünnten Hefe sind auf einem R2 / 1 400 mesh löchrigen Kohlenstoff beschichtete Kupfer-Kryo-EM-Gitter (SPI Supplies, West Chester, PA) pipettiert und konnten zu adsorbieren für 15 Sekunden.
3. Blot entfernt überschüssige Flüssigkeit aus dem Netz Oberfläche durch Berühren der Rückseite des Gitters durch ein Stück weiches Gewebe Zellulose (Kimwipe) für 2 Sekunden.
4. Falls erforderlich, kann das Netz mit 3 ul Tropfen Wasser (1-3 mal), und abtransportiert wie in Schritt 3 durch Blotten von hinten gewaschen werden.
5. Vor dem letzten Waschschritt wird die Probe in die pneumatische stürzen Gefrierschrank geladen und die hängenden Gitter ist wie in Schritt 2.4 gewaschen. Nach dem Blotten des Gitters mit zerrissenen Seidenpapier (Kimwipe), um den größten Teil des Wassers von der Oberfläche entfernen, wird das Gitter in LN ₂ stürzte gekühlt flüssigem Ethan und in ein Kryo-Gitterbox für die Lagerung ¹ Hinweis:. Ist es wichtig, hinterlassen Sie eine Schicht aus flüssigem so dünn wie möglich an der Oberfläche zu halten die Probe hydratisiert. Unsachgemäße Blotting entweder Austrocknen der Probe oder verlassen Eis, das undurchlässig für den Elektronenstrahl.

3. Cryo-Light Microscopy

1. Füllen Sie den kryogenen Stufe mitLN ₂ und schnell mit dem Ladebildschirm (Kunststoff Klemmbrett mit einzelnen 1,9 cm (4.3 ") Loch) zu decken.
2. Sobald das Metall erreicht LN ₂ Temperatur, übertragen Sie die Kryo-Gitterbox durch die 1,9 cm (4.3 ") Loch der Ladebildschirm und in der Übertragung Montage durch die 3 Schrauben in Teil A5 beschrieben erstellt. Lösen Sie die Kryo-Gitterbox aus der Halterung und entfernen Sie die Halterung für einen verbesserten Zugang. Bewahren Sie die Kryo-Raster-Halter unter lN ₂ in einem separaten Dewar bis Schritt 3.10. Die Kryo-Gitterbox sollte auch unter LN ₂ gehalten werden, um Probe Raster Erwärmung zu verhindern.
3. . Refill lN ₂ in der kryogenen Stufe bis knapp unterhalb der Spitze des Aluminium-Kühlkörper Hinweis: lN ₂ Ebenen muss regelmäßig überprüft und neu befüllt werden während der bildgebenden Verfahren, um sicherzustellen, LN ₂ wird kontinuierlich in Kontakt mit dem Kühlkörper. In der Regel erfolgt das Nachfüllen alle 10 Minuten durch die Einfüllöffnung in den Bildschirm.
4. Pre-cool der Pinzette Spitze in lN _2, dann überweisen Sie Ihre Raster (s) auf die flache Oberfläche des Aluminium-Kühlkörper mit einer Pinzette, mit der 1,9 cm (4.3 ") Loch der Ladebildschirm.
5. Bringen Sie den Kryo-Bühne, um unter dem Auflichtmikroskop Ziel Öffnungen.
6. Setzen Sie die transparente Anzeige-Bildschirm oben auf dem Ladebildschirm. Dann langsam entfernen Sie die Lade-Bildschirm, indem Sie ihn unter den Bildschirm. Hinweis: An dieser Stelle wird die Probe am meisten gefährdeten. Alle Luftströmungen um das Mikroskop minimiert werden sollte, unter anderem: Atmung, einem nahe gelegenen Türöffnung, die Menschen vorbeigehen, etc. Wir empfehlen das Tragen einer Gesichtsmaske oder hängend eine transparente Gesichtsschutz unter dem Mikroskop Okulare als Vorsichtsmaßnahme.
7. Drehen Sie die Objektive in den kalten Stickstoff Umfeld der Kryo-Bühne und-Scan für die Probe auf dem flachen Kühlkörper Bildfläche. Mit Standard-Hellfeld Lichtmikroskopie Techniken konzentrieren sich auf die Gitter mit geringer Vergrößerung Ziel, die Mitte zu finden und nehmen Sie eine Übersicht Bild. Spezifikationen für die Lichtmikroskopie Objektive für dieses Experiment verwendet werden in die Experimentelle Werkstoffmechanik Abschnitt aufgeführt. Hinweis: lN ₂ nicht in Kontakt mit den Objektiven kommen und wir haben noch eine Verschlechterung der Bilder oder der Beschädigung der Linsen vor den Auswirkungen der Abkühlung sehen .
8. Focus in starker Vergrößerung auf einer Fläche von Zinsen und Erfassung von Daten mit Hellfeld, Dunkelfeld, polarisiertes Licht oder Fluoreszenz-Bildgebung. Achten Sie darauf, die Lage des Gebietes von Interesse auf die geringe Vergrößerung Hellfeldbild für zukünftige Korrelation aufnehmen. Wenn alle Vorsichtsmaßnahmen oben zum Nachfüllen der LN ₂ aufgeführt, gefolgt sind, dann ist die positive Druck der verdampfenden Stickstoff ausreicht, um eine Kontamination Umgebung (unabhängig von der Raumfeuchte) für die Dauer der Bildgebung zu erhalten.
9. Sobald Sie fertig sind, ersetzen Sie den Ladebildschirm, indem Sie sie über die Oberseite der den Bildschirm. Entfernen Sie den Bildschirm durch Verlangsamung Schiebe es unter dem Ladebildschirm.
10. Entfernen Sie die Cryostage aus dem Mikroskop und mit vorgekühlten Pinzette, übertragen das Netz zurück an den Kryo-Gitterbox. Schrauben Sie die Kryo-Raster-Halter in Kryo-Gitterbox, um gegen die Umgebung abzudichten und den Transfer der Inhaber einer LN2 Dewar für die Lagerung und Zukunft Bildgebung.

4. Cryo-Elektronenmikroskopie

1. Nach Standard-und etablierter Techniken, laden Sie die Probe Gitter in eine Kryo-EM-Übertragung Halter, während die Probe bei der Temperatur flüssigen Stickstoffs zu allen Zeiten.
2. Legen Sie die Cryo-Halter mit der Probe Gitter in einem Transmissions-Elektronenmikroskop.
3. In einem geeigneten geringer Vergrößerung ansehen (50-500x nominal Vergrößerung), finden Sie die Mitte der Probe Netz.
4. Verwenden Sie die zuvor gesammelten geringer Vergrößerung Kryo-LM Daten aus Schritt 3,7 bis die relative Orientierung des Gitters zentrale Kupfer-Tabs (wie in Abbildung 2 beschrieben) zu ermitteln und zu identifizieren genauen Bereiche von Interesse für die Korrelation.
5. Fahren Sie mit dem Mikroskop Ausrichtung, low-dose Kryo-EM-Imaging-und Datenerfassung.

5. Repräsentative Ergebnisse

Die Kryo-Stufe (Abb. 1a) ist ein effektiver Weg zur Kryo-LM-Daten für Kryo-Fluoreszenzmikroskopie und korrelative cryo-LM/cryo-EM Analyse zu sammeln. Abbildung 2 zeigt, wie die Kombination aus niedrigen und hohen Vergrößerungen Kryo-LM Bilder, die Sie zum Verweis Karten, die Sie auf bestimmte Bereiche in Kryo-EM direkten erstellen können. Die daraus resultierende Kryo-LM Referenzkarte (Abb. 2b) wurde während Kryo-EM-Datenerfassung genutzt werden, um genaue Regionen in Abbildung 3 dargestellt zu finden.

Abbildung 1. Cryogenic Bühne. A) Das Layout der kryogenen Stufe besteht aus einem Kryo-Gitterbox Transfer montieren angegeben wit einem weißen Pfeil und einem Aluminium-Kühlkörper. Grids sind unter lN ₂ aus dem Kryo-Gitterbox überführt und direkt auf dem Kühlkörper Sichtfeld der durch den schwarzen Pfeil gekennzeichnet. B) Bild der Darstellung der Kryo-Bühne mit Ladebildschirm. Das Loch in der Ladebildschirm wird direkt über die Kryo-Gitterbox montiert und wirkt platziert als Hafen Proben Transfer vom und zum Verschieben Proben aus dem Kryo-Gitterbox auf die Probe Sichtbereich auf dem Kühlkörper mit einer Pinzette. C) Die kryogene Bühne in Position unter den Objektiven mit den Bildschirm statt. Die spezielle Aussparung an den Bildschirm ermöglicht die Objektive leicht in Position schwingen, ohne die Kryo-Bühne. Das Loch in den Bildschirm vom Probenraum wirkt wie ein LN ₂ Einfüllöffnung für LN ₂ zu tanken, wenn nötig.

Abbildung 2. Navigieren in Kryo-LM für die korrelative Studien. A) Niedrige Vergrößerung Kryo-LM Ansicht von Hefezellen auf eine Probe Raster eingehalten werden. B) Das gleiche Bild in (a) mit einer hohen Vergrößerung Fluoreszenzbild einer Fläche von Interesse überlagert und mit einem gefüllten orangefarbenen Polygon Markierung der Mitte der Probe Netz. Das Zentrum besteht aus einer Gruppe von vier Quadraten, drei mit einem extra Metall Register und die vierte offen. Für die drei Plätze mit einem zusätzlichen Metall Register teilen sich zwei Paare den Reiter über den langen und kurzen Achsen bilden ein asymmetrisches Zentrum. Diese asymmetrische Zentrum kann in der linken oberen Ecke zu sehen und wurde verwendet, um den Drehwinkel und die Händigkeit des Rasters zwischen Kryo-LM und Kryo-EM zeigen. Von einem niedrigen Vergrößerung Bild, das viele Bereiche von Interesse können markiert und als Referenz Karte, um identische Bereiche in Kryo-EM suchen. C) Eine vergrößerte Fluoreszenz Kryo-LM Image der Region von Interesse in (b). HTA1-CFP, eine C-terminale GFP-Histon-Marker können als grüne punktförmige Struktur Kennzeichnung der Lage des Kerns zu sehen. D) Ein Kryo-EM-Bild des entsprechenden Bereichs in (c). Scale-Balken repräsentieren 50 Mikron.

Abbildung 3. Correlation der Kryo-LM und Kryo-EM. Zwei Felder der Ansicht, die identisch Hefezellen mit Kryo-Hellfeld (a, d), Kryo-Fluoreszenz (b, e) und Kryo-EM korreliert (c, f ). Scale-Balken stellen 5 Mikron.

Discussion

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 – 22.86 cm (9") pie pan with sloped edge	Good Cook		Local grocery store
1 – 22.86 cm (9") cake pan	Good Cook		Local grocery store
4 pairs of chopsticks			Local grocery store
1 - Great Stuff spray foam	Great Stuff		Local hardware store
1 - 4cm x8cm x1cm block of aluminum			Local hardware store or metal scrap yard
5 - #10 1.91 cm (3/4") flat head slotted bolts w/ nuts			Local hardware store
3 - #4 0.95 cm (3/8") round slotted bolts w/ nuts			Local hardware store
15 - #10 washers			Local hardware store
2 - transparent plastic clipboards			Local office store
1 - Cryo-EM grid box holder	Ted Pella	160-41
1 - Cryo-EM grid box handling rod	Ted Pella	160-46
1 - R2/1 holey carbon film, 400-mesh copper cryo-EM support grid	SPI Supplies	4340C-XA
Experimental materials
Yeast strain: Hta1-CFP::Kan (KSC-3382: MATa, ura3-52, lys2-801, ade2-101, trp1-Δ63, his3-Δ200, leu2-Δ1, Hta1-CFP::KanMX6 from the Kaplan lab at UC Davis). Cryo-Light Microscopy: Cryo-light microscopy images were taken on a Leica DM4000M reflecting microscope with a Leica DFC310 FX CCD camera. Bright Field, Dark Field and Fluorescence images were acquired using either a HCX PL FLUOTAR 5x 0.15 N.A. air objective, a HCX PL FLUOTAR 10x 0.30 N.A. air objective, a PL FLUOTAR 50x 0.55 N.A. air objective or a NPLAN 100x 0.75 N.A. air objective. Bright Field and Dark Field images used a 12V 100W tungsten lamp as the light source. For Fluorescence, an EL6000 UV lamp source was used in conjunction with a Leica JC1 (Ex.F.: BP 480/30, D.M.: LP 505, S.F. BP 535/40 & LP 580) Filter Cube. Cryo-Transmission Electron Microscopy: Cryo-EM images were acquired on a JEM-2100-FEG Transmission Electron Microscope (JEOL, Japan) operating at 200 KeV utilizing a Gatan 626 cryo-transfer holder (Gatan, USA). Micrographs were recorded at nominal magnifications of 50, 200, 1,200 and 4,000X on a 4,096 x 4,096 pixel Tietz CCD camera (TVIPS, Gauting, Germany).