استهداف الخلايا العصبية عن طريق الجمع بين البصلة الشمية في فيفو Electroporation وGal4 محسن المستندة إلى خطوط مصيدة اسماك الزرد

Summary

القرار الزماني والمكاني من التلاعب الجيني الذي يحدد طائفة من الظواهر البيولوجية التي يمكن أن التشويش. هنا نستخدم زمنيا ومكانيا منفصلة

Abstract

في electroporation فيفو هو وسيلة قوية لإيصال البلازميدات التعبير الحمض النووي ، ورني الكواشف ، و[أليغنوكليوتيد] morpholino المضادة للمعنى لمناطق معينة من الأجنة النامية ، بما فيها تلك التي C. ايليجانس ، الفرخ ، القيطم ، الزرد ، والفأر ^1. في الزرد ، electroporation في الجسم الحي وقد تبين أن القرار ممتازة المكاني والزماني لإيصال هذه الكواشف ^2-7. القرار الزماني لهذا الأسلوب مهم لأنه يسمح لإدراج هذه الكواشف في مراحل معينة في عملية التنمية. وعلاوة على ذلك ، لأن التعبير من ناقلات electroporated يحدث في غضون 6 ساعات ⁷ ، وهذا الأسلوب هو أكثر ملاءمة من النهج المعدلة وراثيا. في حين أن القرار المكانية يمكن أن يكون دقيقا للغاية عندما استهدفت خلية واحدة ^{2 ، 6} ، غالبا ما يكون من الأفضل لدمج السكان في الكواشف خلية معينة داخل أنسجة أو بنية. عند استهداف خلايا متعددة ، في electroporation فيفو غير فعالة لتسليمها الى منطقة محددة من الجنين ، ومع ذلك ، لا سيما داخل الجهاز العصبي النامي ، فمن الصعب استهداف أنواع معينة من الخلايا فقط من خلال electroporation المنفصلة مكانيا. بدلا من ذلك ، محسن فخ خطوط المعدلة وراثيا تقدم ممتازة خلية نوع محدد من الجينات المحورة التعبير ^8. نحن هنا وصف نهج يجمع بين المعدلة وراثيا فخ محسن Gal4 المستندة إلى خطوط منفصلة مع ⁸ مكانيا في electroporation فيفو ^{7 و 9} خصيصا لاستهداف الخلايا العصبية النامية بصلة الشم لدى الزرد. وآخرون (zic4 : Gal4TA4 ، UAS : mCherry) ^hzm5 (GA80_9 سابقا) محسن خط فخ الموصوفة سابقا ⁸ ، يعرض التعبير المعدلة وراثيا المستهدف للتوسط mCherry من الزرد الأمثل Gal4 (KalTA4) الترانسكربتي المنشط في مناطق متعددة من الدماغ النامية بما في ذلك الدماغ المؤخر ، المخيخ ، الدماغ الأمامي ، والبصلة الشمية. لاستهداف GFP التعبير على وجه التحديد إلى البصلة الشمية ، وهي البلازميد مع تسلسل ترميز GFP تحت سيطرة Gal4 مواقع متعددة ملزمة (UAS) وكان في نهاية electroporated الأمامي من الدماغ المقدم في ساعات ما بعد الإخصاب 24-28 (HPF). على الرغم من أن هذا الأسلوب يتضمن الحمض النووي البلازميد في مناطق متعددة من الدماغ الأمامي ، هي فقط التي يسببها GFP التعبير في التعبير عن الخلايا transgenically عامل النسخ KalTA4. وهكذا ، وذلك باستخدام خط GA080_9 المعدلة وراثيا ، أدى هذا النهج في التعبير GFP حصرا في البصلة الشمية في البلدان النامية. وأظهرت الخلايا المستهدفة عن طريق GFP معربا عن هذا النهج التوقعات محواري نموذجي ، كما هو موضح سابقا لخلايا المترالي من البصلة الشمية ^10. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لتسليم المستهدفة من الكواشف الأخرى بما في ذلك القصيرة القاسي البلازميدات التدخل RNA التعبير ، والتي من شأنها أن توفر طريقة لمكانيا وزمانيا منفصلة تحليل الخسارة من وظيفة.

Protocol

1. الأجنة وراثيا

1. نحن هنا باستخدام خط المعدلة وراثيا من الزرد تنشأ من خلال أسلوب ينقول بوساطة فخ محسن ^8. إدراج المعدلة وراثيا تشمل اثنين من سلاسل الترميز : KalTA4 ، وهو نسخة محسنة من الزرد ، ومنشط Gal4 النسخي ، وبروتين أحمر فلوري ، mCherry. الأسلوب فخ محسن غلة خطوط الزرد المعدلة وراثيا التي تعبر عن هذا الكاسيت المعدلة وراثيا تحت سيطرة تسلسل محسن الذاتية. وبالتالي ، تبعا لهوية محسن تسلسل محدد ، يتم التعبير عن كل من المترجمة KalTA4 وmCherry إلى مناطق محددة من الدماغ النامية. لET (zic4 : Gal4TA4 ، UAS : mCherry) خط ^hzm5 اننا نستخدم هنا ، هو التعبير المترجمة إلى عدة مواقع في الدماغ المؤخر ، الدماغ الأمامي ، وذات أهمية خاصة هنا ، البصلة الشمية ⁸ (انظر أيضا الشكل 1). . ونظرا لهذا النمط من التعبير ، وتوطين كاسيت داخل الجينوم ، وتوقع أن تكون الجينات المحورة الخاضعة لسيطرة المروج zic4 ⁸ (انظر أيضا http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ تصوير الأعصاب / lines_distel / الرئيسي ).
2. وتزاوج الأسماك عادة ^hzm5 متخالف لإدراج المعدلة وراثيا مع السمك (AB) WT ، مما يؤدي إلى ذرية تقريبا 50 ٪ من البالغين وراثيا ET (mCherry zic4 : Gal4TA4 ، UAS). (للحصول على نسبة مئوية أعلى من نسل المعدلة وراثيا ، يمكن أن تزاوج two heterozygotes).
3. من أجل تشكيل كتلة الصباغ وتسهيل التصوير الفلورسنت ، وعلاج الأجنة وراثيا مع 100 ميكرومتر بداية (PTU) N - الفنيل في HPF 6-8.

2. تصاعد الأجنة

1. في HPF 24-28 ، ونقل الأجنة في الماء البيض دون PTU. تحديد الأجنة وراثيا عن طريق التعبير عن mCherry باستخدام المجهر الفلورسنت. إزالة الغشاء المشيمي من أجنة المعدلة وراثيا باستخدام الملقط الغرامة. نقل الأجنة التي تحررت من المشيماء على طبق بتري تحتوي العازلة electroporation زائد 0،02 ٪ tricaine [العازلة Electroporation : 180 مم كلوريد الصوديوم ، 5 ملي بوكل ، 1.8 ملي CaCl ₂ ، 5 ملي HEPES ، ودرجة الحموضة 7.2] ^(4). 2 دقائق للسماح للمخدر نافذ المفعول قبل الانتقال الى الخطوة في تصاعد مستمر.
2. إعداد محلول 0.5 ٪ منخفضة ذوبان نقطة agarose العازلة في electroporation زائد tricaine بواسطة الميكروويف الحل ، ومن ثم وضع الحل في الحاضنة 34-37 درجة مئوية. مرة واحدة في درجات الحرارة من الحل agarose ومعايرتها ، ومكان حدوث انخفاض كبير (~ 500 ميكرولتر) من الحل agarose إلى وسط صحن بيتري 60 مم. إضافة 6-8 أجنة تخدير لهذه قطرة من agarose.
3. باستخدام الملقط غرامة (أو نهايات غرامة قطع نصائح الماصة microloader) ، موقف هذه الأجنة انهم يواجهون جميعا في نفس الاتجاه والانحياز في صف واحد عمودي. ليصلب agarose ، واعتراض الأجنة في الموقف ، ووضع طبق على طبق بيتري كبيرة مع 2-3 مم من الجليد.
4. مرة واحدة في agarose وقد عززت والفيضانات الطبق مع العازلة electroporation tricaine زائد ، وضمان أن الحل يغطي تماما انخفاض agarose طدت.

3. الدقيقة حقن الحمض النووي التعبير البلازميد

1. تحضير التعبير GFP البلازميد باستخدام ميدي أو ماكسي الإعدادية ، طقم العزلة البلازميد (مثل Qiagen). تعليق البلازميد إلى تركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر في الماء المعقم بالإضافة إلى أحمر الفينول 0.03 ٪. للتجربة البصلة الشمية استهداف الموصوفة هنا ، نحن نستخدم تعبير البلازميد مع تسلسل ترميز EGFP تحت سيطرة Gal4 مواقع متعددة ملزمة (14 بالترادف متواليات UAS والمروج الأسماك القاعدية ، E1b). وسوف تستخدم هذا البلازميد ، معربا عن الخلايا فقط transgenically عامل النسخ KalTA4 تكون قادرة على التعبير عن GFP ، وبالتالي فإن التعبير وساطة تستهدف GFP.
   ملاحظة : نحن هنا لاستخدام أحمر الفينول تصور حقن الحمض النووي ، التي ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق لاستهداف مناطق أخرى من الدماغ النامي ، ما دام يمكن الوصول إلى المنطقة من البطينين. للاستهداف من أنواع الخلايا الأخرى التي تتطلب التصور فلوري ، يمكن أن يحتمل Bodipy أو الأصباغ Quantam نقطة يمكن استخدامها لتصور الحقن تحت الإضاءة الفلورسنت.
2. يمكن أن تكون ملفقة ماصات Microinjection إما باستخدام ماصة مجتذب أفقي أو عمودي. والحرارة وقوة سحب - الإعدادات تختلف تبعا لنوع من مجتذب ، ونوع من عنصر التدفئة ، ونوع من الشعرية أنابيب زجاجية.
   باستخدام مجتذب سوتر P - 30 العمودية ، استخدام إعداد الحرارة من 980 وسحب القوة من 960 لإنتاج ، مدبب طويل ، ماصات حادة من الزجاج رقيقة الجدران الشعرية البورسليكات مع شعيرات [سوتر الصك # BF100 - 78 - 10]. ومختومة ماصات Microinjetion انسحب مع هذه الإعدادات ، ويجب أن تكون مكسورة الظهر قبل الحقن.
3. استخدام غيض microloader ماصة لإضافة 1-2 ميكرولتر من محلول الحمض النووي البلازميد الى ماصة الحقن.
4. ويشنتأمين ماصة تحميلها في ضغط حقن حامل ماصة النظام.
5. كسر ظهر ماصة محملة ملقط يرام حتى تنتج نبضات الضغط الافراج منتفخ من الحل DNA الحمراء. بدلا من ذلك ، يمكن تقسيم نصائح الظهر عن طريق اختراق بسرعة المغمورة ، Kimwipe مختبر مطوية.
   ملاحظة : لأنه يتم في البداية مختومة ماصات الحقن ويجب كسر يدويا مرة أخرى ، وحجم وحجم غيض الحقن هي متغير. وينبغي حقن ماصات المثالي يتطلب حقن البقول 3-5 لملء تماما بطين الدماغ المقدم من الأجنة النامية HPF 24 (100 مللي البقول الحقن في 40 رطل).
6. حقن محلول الحمض النووي البلازميد في بطينات الدماغ النامي القسري مثل أن الحمض النووي المتاخمة ل، ومقحم في والمنطقة من الدماغ المخصصة لتشكيل البصلة الشمية. مشتق من خلايا البصلة الشمية في الجدار الأمامي أكثر من البطين الدماغ المقدم. وهكذا ، عن طريق إدراج ماصة الحقن في البطينين بحيث ماصة يتم الإشارة في نهاية الأمامي من الدماغ النامي ، وحقن ضغط القوات في الحمض النووي والمناطق المتاخمة لمبة والشمية المحتملين. حقن الحمض النووي حتى صبغ أحمر مرئيا بوضوح في نهاية الأمامي من الدماغ الأمامي للبطين. لأن الحمض النووي يبدأ في الانتشار على الفور مما خفف من الحمض النووي ، من المهم المضي قدما إلى الخطوة electroporation في أقرب وقت ممكن بعد الحقن (على سبيل المثال ، في غضون 10 ثانية).

4. Electroporation

1. ويتم Electroporation خارج باستخدام الذاتي شيدت أقطاب كهربائية مصنوعة من البلاتين العشب تحت الجلد (غراس التكنولوجيا # E2). وترد الأقطاب لتحقيق باليد ، والمسافة بين الأقطاب النهائي البلاتين يجب أن يكون 1 ملم (للاطلاع على تفاصيل البناء انظر ^9). ويتم إنتاج البقول electroporation مربع الموجة من خلال توصيل الأقطاب الكهربائية إلى تحفيز SD - 9 العشب (العشب التكنولوجيا ، الموديل SD - 9).
2. تعيين منشط SD - 9 لإنتاج واحد ، electroporation 5 مللي البقول بنسبة 70 فولت. موقف أقطاب بحيث يتم وضع القطب الموجب بجوار نهاية الأمامي من الجنين ، في حين أن القطب السالب هو الخلفية في الرأس الجنين. بدء يدويا ~ نبضات electroporation 7-8 باستخدام مفتاح الوضع واحدة من منشط SD - 9 ، وفصل كل نبضة بواسطة ~ 1 ثانية. والفولتية المناسبة تختلف تبعا لعمر الجنين ومصدر الجهد المستخدمة. أصغر أجنة تتطلب جهد كهربي أقل لتجنب الضرر الجنين ، في حين أن كبار السن الأجنة تتطلب ارتفاع الفولتية لبدء electroporation ^7.
3. السماح للأجنة لاسترداد ما لا يقل عن 10 دقيقة بعد electroporation قبل اطلاق سراحهم من agarose.
4. باستخدام الملقط غرامة ، حرر الأجنة من agarose بلطف عن طريق تتبع الخطوط العريضة للأجنة في حين تجنب الاتصال الفعلي مع الأجنة نفسها.
5. الافراج عن مرة واحدة ، والعودة إلى المياه من أجنة البيض (مع PTU إذا لزم الأمر). الاحتفاظ بها في 28 درجة مئوية حتى أنهم ليمكن تصوير للتعبير GFP.

5. تصاعد الأجنة للتصوير

1. نقل الأجنة من البيض بالإضافة إلى الماء إلى الماء PTU البيض زائد 0،02 ٪ tricaine. السماح لعدة دقائق حتى تصبح نافذة المفعول المخدر قبل الانتقال الى الخطوة في تصاعد مستمر.
2. إعداد محلول 0.5 ٪ منخفضة ذوبان نقطة agarose في الماء البيض زائد tricaine بواسطة الميكروويف الحل ، ومن ثم وضع الحل في الحاضنة 34-37 درجة مئوية. مرة واحدة في درجات الحرارة من الحل agarose ومعايرتها ، ومكان حدوث انخفاض كبير (~ 300 ميكرولتر) من الحل agarose إلى وسط صحن بيتري 35 مم. إضافة واحد تخدير الجنين في هذا الانخفاض من agarose.
3. باستخدام الملقط غرامة (أو نهايات غرامة قطع نصائح الماصة microloader) ، موقف هذه الأجنة أنهم تستقيم ، مما يجعل من الممكن تصور وجهة نظر الظهرية من الدماغ النامية مع المجهر تستقيم (نطاقات مقلوب يتطلب هندسة الجنين المختلفة ، وطبق مختلفة مما يسمح التصور من الأسفل ، وانظر ^12). يصلب agarose عن طريق وضع طبق على طبق بيتري كبيرة مع 2-3 مم من الجليد. ومن المرجح أن إعادة توجيه ملقط مع الغرامة المطلوبة خلال ترسيخ للتأكد من أن الجنين لا تقع على أكثر من جانبها.
4. مرة واحدة في agarose وقد عززت والفيضانات طبق البيض مع الماء زائد tricaine ضمان أن الحل يغطي تماما انخفاض agarose طدت.

6. ممثل النتائج :

ويمكن ملاحظة على الرغم من التعبير GFP في أقرب وقت بعد 6 ساعات electroporation ، نحن هنا تظهر الصور من الجنين بعد 4 ايام من هذا القبيل electroporation أن هيكل neurite الخلايا المستهدفة وضعت بما فيه الكفاية. وآخرون (zic4 : Gal4TA4 ، UAS : mCherry) ^hzm5 فخ محسن وراثيا خط يعرض التعبير التأسيسية للmCherry (وKalTA4) في الدماغ المؤخر ، والمخيخ ، الدماغ الأمامي ، والبصلة الشمية في أجنة في 5 أيام بعد الإخصاب (الشكل 1A و 1C). الأجنة التي كان لها التعبير UAS - GFP البلازميد التي تؤسسها electroporation استهدفت (كما هو موضح أعلاه) ، وتظهر التعبير GFP أن يقتصر على الخلايا الشمية من لمبة والنامية (الشكل 1B ، 1D ، و1E). خلايا فقط ، معربا عن transgenically عامل النسخ KalTA4 قادرة على تنشيط هذا التعبير من البلازميد UAS - GFP. إدماج هذا البلازميد في غير المعدلة وراثيا الأجنة لا يؤدي إلى أي تعبير GFP كشفها. وبالتالي ، فإن العمل المشترك من electroporation المستهدفة من UAS - GFP المعدلة وراثيا والتعبير المترجمة من السائق KalTA4 الذي يؤدي إلى التعبير الحصري لGFP في الخلايا الشمية من لمبة والنامية. وGFP - معربا عن الخلايا تظهر التوقعات محواري نموذجي للخلايا البصلة الشمية التاجي (1B الشكل و1D) ^10. وقد صور في الشكل و1D 1B من أجل تصور توقعات المحور ، أن تتعرض في مثل هذه المستويات العالية التي كانت جيدة في المنطقة لأكثر من أجسام الخلايا المعرضة. مستوى أدنى من التعرض (الشكل 1E) يدل على ان يتم ترجمة الواقع أجسام الخلايا معربا عن GFP إلى البصلة الشمية (قارن الشكل 1C 1E و؛ خط رمادي علامات الحدود بين البصلة الشمية).

الشكل 1. المستهدفة التعبير GFP في البصلة الشمية من جنين DPF الزرد 5. وآخرون (zic4 : Gal4TA4 ، UAS : mCherry) ^hzm5 فخ محسن خط المعدلة وراثيا ، ويعرض التعبير التأسيسية للmCherry في المخيخ ، الدماغ المؤخر ، الدماغ الأمامي ، والبصلة الشمية (A و C ، mCherry مضان هو مبين في الحمراء). وتتوسط هذه العبارة من قبل mCherry المعدلة وراثيا ، Gal4 التعبير. الأجنة التي تم electroporated مع ناقلات التعبير UAS - GFP في 28 HPF ، وعرض استهدفت التعبير GFP في البصلة الشمية في 5 أيام بعد التلقيح (B ، D و E ، GFP مضان يظهر باللون الأخضر. الجنين نفسه كما في ألف و C). صورة أقل التعرض في القاع (E) يبين أن يقتصر التعبير GFP للهيئات خلية من خلايا البصلة الشمية. خط رمادي يشير إلى حدود البصلة الشمية. وكان حقل مشرق (مقياس الرمادية) ، والأخضر ومضان (الأخضر) ، ومضان أحمر الصور (الحمراء) مع اتخاذ جميع مجهرا BX60 أوليمبوس مضان.

Discussion

وقد وصفت هنا لدينا خبير في أسلوب electroporation المجراة في الزرد التي تستخدم في فخ محسن Gal4 خط المعدلة وراثيا لاستهداف تعبير عن التحوير electroporated لمجموعة سكانية محددة من الخلايا الشمية في لمبة والنامية. هذا النهج يجمع بين ممتازة القرار الزماني في electroporation فيفو ⁷ مع التعبير الخلية نوع معين بوساطة خطوط محسن وراثيا فخ ^8. على الرغم من هنا قد وصفنا في استهداف البصلة الشمية ، electroporation في الجسم الحي ويمكن استخدامها لاستهداف مناطق أخرى من الجهاز العصبي النامي ^2-7 ، ومحسن خطوط فخ تتوفر مع التعبير تستهدف Gal4 في العديد من مختلف أنواع معينة من الخلايا أو الأنسجة ^{8 ، 11.} بالطبع ، يجب أن تكون هذه التقنية electroporation أيضا مناسبة للمناهج أخرى combinatioral الوراثية مثل تيت به lexa أو أنظمة ^{13 ، 14 ، 15.} والميزة الرئيسية لelectroporation هو أن ليس هناك حاجة لجعل خطوط المعدلة وراثيا إضافية نظرا إلى أن مناسبة Gal4 سطر هو متاح. هذا يحفظ ستة أشهر.

في الجسم الحي electroporation يسمح لدمج الخلايا العصبية في [أليغنوكليوتيد] وسلائفها في أي مرحلة معينة من تطور الجهاز العصبي هو من مصلحة ^7. هذا القرار الزماني هو مفيد خاصة بالنسبة للخسارة من وظيفة التحليل لأنه لا يمكن الالتفاف على المشاكل مع استهداف الجينات التي لها وظائف أساسية في مراحل سابقة التنموية. ويمكن أيضا الأسلوب وصفنا هنا أن تستخدم لإدراج الخسارة من وظيفة بما في ذلك [أليغنوكليوتيد] [رني الكواشف أو يبني وmorpholino المضادة للشعور [أليغنوكليوتيد] ^{4 و 7.} ويمكن أيضا البلازميد يحركها الكواشف مثل المهيمنة سلبية البلازميدات التعبير البروتين أو دبوس الشعر القصير البلازميدات رني أن توضع تحت سيطرة UAS Gal4 ، والسماح لنوع محدد خلية التعبير الدقيق لدينا هو موضح هنا للتعبير عن GFP.

Materials

Reagents: Agarose, low-melting-point (Sigma, A9414) Plasmid midi- or maxi-prep kit (e.g. Qiagen, #12643] Phenol red (Sigma, P3532) Equipment: Capillary glass with filament; ID = 0.78 mm; OD = 1.0 mm (Sutter Instruments, #BF100-78-10) Grass SD-9 Stimulator (Grass Technology, Model SD-9) Grass platinum subdermal electrodes, straight needle (Grass Technology, #E2) Micro-loader pipette tips (Eppendorf, #X22703R) Pipette puller (e.g. Sutter, Model P-30) Pipette puller (e.g. Sutter, Model P-30)