Summary
आनुवंशिक जोड़तोड़ के अस्थायी और स्थानिक संकल्प जैविक घटना है कि वे उपद्रव कर सकते हैं की स्पेक्ट्रम निर्धारित करता है. यहाँ हम अस्थायी और spatially असतत उपयोग
Protocol
1. ट्रांसजेनिक भ्रूण
- यहाँ हम zebrafish की एक ट्रांसजेनिक लाइन एक transposon की मध्यस्थता बढ़ाने जाल 8 विधि के माध्यम से बनाया का उपयोग कर रहे हैं. KalTA4, Gal4 transcriptional उत्प्रेरक का एक zebrafish अनुकूलित संस्करण, और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन, mCherry: ट्रांसजेनिक डालने दो कोडन दृश्यों शामिल है. बढ़ाने ट्रांसजेनिक zebrafish के जाल विधि पैदावार लाइनों है कि एक अंतर्जात बढ़ाने के अनुक्रम के नियंत्रण के तहत इस ट्रांसजेनिक कैसेट व्यक्त. इस प्रकार, विशिष्ट बढ़ाने अनुक्रम की पहचान के आधार पर, दोनों KalTA4 और mCherry की अभिव्यक्ति विकासशील मस्तिष्क के विशिष्ट क्षेत्रों के लिए स्थानीय है. एट (: Gal4TA4, यूएएस: zic4 mCherry) hzm5 लाइन है कि हम यहाँ का उपयोग कर रहे हैं, अभिव्यक्ति hindbrain, अग्रमस्तिष्क में कई साइटों के लिए स्थानीय है और यहाँ विशेष महत्व का है, घ्राण बल्ब 8 (भी चित्र 1 देखें .) . अभिव्यक्ति के इस पैटर्न, और जीनोम के भीतर कैसेट के स्थानीयकरण को देखते हुए, transgenes zic4 8 प्रमोटर के नियंत्रण के तहत होने की भविष्यवाणी कर रहे हैं (देख भी http://www.helmholtz-muenchen.de/en/idg/groups/ न्यूरोइमेजिंग / / lines_distel मुख्य )..
- वयस्क (: Gal4TA4, यूएएस: zic4 mCherry) एट hzm5 विषमयुग्मजी मछली ट्रांसजेनिक डालने के लिए आम तौर पर WT मछली (एबी) के साथ mated रहे हैं, लगभग 50% ट्रांसजेनिक वंश करने के लिए अग्रणी. (ट्रांसजेनिक वंश के एक उच्च प्रतिशत के लिए, दो heterozygotes सकता है. Mated कर सकते हैं)
- आदेश में रंगद्रव्य गठन ब्लॉक और फ्लोरोसेंट इमेजिंग की सुविधा, 100 एन phenylthiourea सुक्ष्ममापी 6-8 HPF शुरुआत में (PTU) के साथ ट्रांसजेनिक भ्रूण का इलाज.
2. बढ़ते भ्रूण
- 24-28 HPF, PTU बिना अंडे पानी के लिए भ्रूण स्थानांतरण. एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन का उपयोग mCherry की अभिव्यक्ति के द्वारा ट्रांसजेनिक भ्रूण को पहचानें. ट्रांसजेनिक ठीक संदंश का उपयोग भ्रूण से कोरियोनिक झिल्ली निकालें. स्थानांतरण भ्रूण उनके chorion 4: से एक पेट्री electroporation बफर प्लस 0.02% tricaine NaCl [180 मिमी, 5 मिमी KCl, 1.8 मिमी 2 CaCl, 5 मिमी HEPES, 7.2 पीएच electroporation बफर] युक्त डिश के लिए मुक्त. चतनाशून्य करनेवाली औषधि के लिए 2 मिनट के बढ़ते कदम को आगे बढ़ने से से पहले प्रभाव लेने के लिए अनुमति दें.
- Microwaving समाधान, और फिर एक 34-37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में समाधान रखने electroporation बफर प्लस tricaine में कम पिघलने बिंदु agarose के एक 0.5% समाधान तैयार करें. एक बार agarose समाधान के तापमान equilibrated है, agarose समाधान के एक 60 मिमी पेट्री डिश के केंद्र के लिए एक बड़ी गिरावट (~ 500 μl) जगह है. Agarose के इस बूंद के लिए 6-8 anesthetized भ्रूण जोड़ें.
- स्थिति ठीक संदंश (या कटौती microloader pipet सुझावों के ठीक समाप्त होता है) का उपयोग करना, जैसे कि वे सभी एक ही दिशा में सामना कर रहे हैं और एक ऊर्ध्वाधर पंक्ति में गठबंधन भ्रूण. Agarose जमना, और स्थिति में भ्रूण का जाल, एक बड़ा पेट्री डिश पर बर्फ के 2-3 मिमी के साथ पकवान जगह है.
- एक बार agarose जम गया है, electroporation बफर प्लस tricaine के साथ पकवान बाढ़, सुनिश्चित करना है कि समाधान पूरी तरह से जम agarose ड्रॉप शामिल है.
3. डीएनए प्लाज्मिड अभिव्यक्ति की माइक्रो इंजेक्शन
- GFP प्लाज्मिड अभिव्यक्ति midi या मैक्सी - प्रस्तुत करने का प्लाज्मिड अलगाव किट (जैसे Qiagen) का उपयोग कर तैयार है. 0.5 μg / बाँझ पानी में μl प्लस 0.03% phenol के लाल का अंतिम एकाग्रता के लिए प्लाज्मिड निलंबित. घ्राण बल्ब प्रयोग लक्ष्यीकरण के लिए यहाँ वर्णित है, हम एकाधिक Gal4 बाध्यकारी साइटों (14 अग्रानुक्रम यूएएस दृश्यों और बेसल मछली प्रमोटर, E1B) के नियंत्रण के तहत EGFP के कोडन अनुक्रम के साथ एक प्लाज्मिड अभिव्यक्ति का उपयोग कर रहे हैं. इस प्लाज्मिड, केवल transgenically KalTA4 प्रतिलेखन कारक व्यक्त कोशिकाओं का प्रयोग GFP व्यक्त करने में सक्षम हो जाएगा, इस प्रकार, GFP के लक्षित अभिव्यक्ति mediating.
नोट: यहाँ हम डीएनए इंजेक्शन, जो विकासशील मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए लागू किया जाना चाहिए के दृश्य के लिए phenol के लाल का उपयोग कर रहे हैं, के रूप में लंबे समय से क्षेत्र निलय से पहुँचा जा सकता है. अन्य कोशिका प्रकार है कि फ्लोरोसेंट दृश्य की आवश्यकता के लक्ष्यीकरण के लिए, Bodipy या Quantam डॉट रंजक संभावित करने के लिए फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत इंजेक्शन कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. - Microinjection pipettes या तो क्षैतिज या अनुलंब विंदुक खींचने का उपयोग कर निर्मित किया जा सकता है. हीट और पुल शक्ति सेटिंग्स चालक, हीटिंग तत्व के प्रकार के प्रकार के आधार पर भिन्न होगा, और गिलास केशिका ट्यूब के प्रकार.
Sutter पी 30 ऊर्ध्वाधर खींचने का प्रयोग, 980 के एक गर्मी की स्थापना और 960 के पुल बल का उपयोग करने के लिए पतली दीवारों filaments के साथ borosilicate केशिका गिलास से लंबा, पतला, तेज pipettes [Sutter साधन # BF100-78-10]. इन सेटिंग्स के साथ खींच Microinjetion pipettes सील कर रहे हैं और वापस इंजेक्शन से पहले टूट जाना चाहिए. - Microloader विंदुक टिप का उपयोग करें इंजेक्शन विंदुक डीएनए प्लाज्मिड समाधान के 1-2 μl जोड़ने के लिए.
- पर्वत औरदबाव इंजेक्शन प्रणाली विंदुक धारक में लोड विंदुक सुरक्षित.
- वापस ठीक संदंश के साथ भरी हुई विंदुक तोड़ जब तक दबाव दालों लाल डीएनए समाधान के ख़ुदपसंद रिलीज उत्पादन. वैकल्पिक रूप से, सुझावों जल्दी से एक जलमग्न, तह प्रयोगशाला Kimwipe मर्मज्ञ द्वारा वापस टूट सकता है.
नोट: क्योंकि इंजेक्शन pipettes शुरू और बंद कर रहे मैन्युअल वापस टूटी हुई चाहिए, टिप आकार और इंजेक्शन की मात्रा चर रहे हैं. आदर्श इंजेक्शन pipettes 3-5 इंजेक्शन दालों की आवश्यकता के लिए पूरी तरह से 24 HPF भ्रूण (40 साई पर 100 एमएस इंजेक्शन दालों) के विकास के अग्रमस्तिष्क वेंट्रिकल को भरने चाहिए. - विकासशील मस्तिष्क के ventricles में प्लास्मिड डीएनए समाधान है कि ऐसे डीएनए इंजेक्षन करने के लिए आसन्न मजबूर है, और में, घ्राण बल्ब के रूप में किस्मत मस्तिष्क के क्षेत्र intercalated. घ्राण बल्ब अग्रमस्तिष्क वेंट्रिकल की सबसे पूर्वकाल दीवार में कोशिकाओं से व्युत्पन्न है. इस प्रकार, जैसे कि विंदुक विकासशील मस्तिष्क के पूर्वकाल अंत की ओर इशारा कर रहा है ventricles में इंजेक्शन विंदुक डालने द्वारा, दबाव इंजेक्शन डीएनए में और भावी घ्राण बल्ब निकट बलों. डीएनए इंजेक्षन तक लाल डाई अग्रमस्तिष्क वेंट्रिकल की पूर्वकाल अंत में स्पष्ट रूप से दिखाई देता है. क्योंकि डीएनए को तुरंत फैलाना, डीएनए गिराए शुरू होता है, यह महत्वपूर्ण है इंजेक्शन के बाद electroporation कदम जितनी जल्दी हो सके (उदाहरण के लिए, 10 सेकंड के भीतर) करने के लिए आगे बढ़ना.
4. Electroporation
- Electroporation बाहर आत्म निर्माण घास प्लैटिनम subdermal इलेक्ट्रोड (घास प्रौद्योगिकी # E2) से बनाया इलेक्ट्रोड का उपयोग किया जाता है. इलेक्ट्रोड एक हाथ से आयोजित की जांच से जुड़े होते हैं, और प्लैटिनम इलेक्ट्रोड के बीच अंतिम दूरी 1 मिमी (निर्माण पर जानकारी के लिए 9 देखें) किया जाना चाहिए . स्क्वायर लहर electroporation दालों एक घास उत्तेजक औधधि एसडी-9 (घास प्रौद्योगिकी, मॉडल एसडी 9) के लिए इलेक्ट्रोड को जोड़ने के द्वारा उत्पादित कर रहे हैं.
- उत्तेजक औधधि एसडी 9 सेट करने के लिए 70 वोल्ट पर एकल, 5 एमएस electroporation दालों का उत्पादन. स्थिति ऐसी है कि सकारात्मक इलेक्ट्रोड भ्रूण के पूर्वकाल अंत निकट तैनात है, जबकि नकारात्मक इलेक्ट्रोड भ्रूण सिर के पीछे है इलेक्ट्रोड. मैन्युअल ~ 7-8 electroporation एसडी 9-उत्तेजक औधधि के एकल मोड स्विच का उपयोग दालों आरंभ ~ 1 सेकंड द्वारा प्रत्येक नाड़ी अलग. उचित voltages के भ्रूण की उम्र और वोल्टेज स्रोत इस्तेमाल किया पर निर्भर करता है अलग अलग होंगे. युवा भ्रूण कम voltages भ्रूण नुकसान से बचने के लिए आवश्यकता होती है, जबकि पुराने भ्रूण उच्च voltages की आवश्यकता 7 electroporation आरंभ .
- भ्रूण electroporation के बाद कम से कम 10 मिनट के लिए उन्हें agarose से मुक्त करने से पहले ठीक करने के लिए अनुमति दें.
- ठीक संदंश का प्रयोग, धीरे से भ्रूण की रूपरेखा अनुरेखण जबकि खुद भ्रूण के साथ वास्तविक संपर्क से बचने के द्वारा agarose से भ्रूण मुफ्त.
- एक बार मुक्त, अंडे पानी के लिए भ्रूण वापसी (PTU साथ अगर जरूरी हो). उन्हें 28 पर रखें डिग्री सेल्सियस जब तक वे GFP अभिव्यक्ति के लिए imaged किया जा रहे हैं.
5. इमेजिंग के लिए बढ़ते भ्रूण
- अंडे पानी प्लस PTU से अंडे पानी से अधिक 0.02% tricaine भ्रूण स्थानांतरण. चतनाशून्य करनेवाली औषधि के लिए कई मिनट के बढ़ते कदम को आगे बढ़ने से से पहले प्रभाव लेने के लिए अनुमति दें.
- Microwaving समाधान, और फिर एक 34-37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में समाधान रखने से अंडे पानी प्लस tricaine में कम पिघलने बिंदु agarose के 0.5% समाधान तैयार करें. एक बार agarose समाधान के तापमान equilibrated है, agarose समाधान के एक 35 मिमी पेट्री डिश के केंद्र के लिए एक बड़ी गिरावट (~ 300 μl) जगह है. Agarose के इस बूंद के लिए एक anesthetized भ्रूण जोड़ें.
- ठीक संदंश (या कटौती microloader pipet सुझावों के ठीक समाप्त होता है) का उपयोग करना, स्थिति ऐसी है कि वे ईमानदार रहे हैं, एक ईमानदार माइक्रोस्कोप (उल्टे scopes के एक अलग भ्रूण ज्यामिति की आवश्यकता होगी के साथ विकासशील मस्तिष्क के एक पृष्ठीय दृश्य की कल्पना करने के लिए यह संभव बना, भ्रूण और एक अलग नीचे से दृश्य की अनुमति पकवान, 12 देखें) . बर्फ के 2-3 मिमी के साथ एक बड़े पेट्री डिश पर पकवान रखकर agarose का जमना. ठीक संदंश के साथ पुन उन्मुखीकरण की संभावना solidification के दौरान की आवश्यकता होगी करने के लिए सुनिश्चित करें कि भ्रूण पर अपने पक्ष पर गिर नहीं करता है.
- एक बार agarose जम गया है, बाढ़ अंडे पानी से अधिक tricaine के साथ पकवान सुनिश्चित करना है कि समाधान पूरी तरह से जम agarose ड्रॉप शामिल हैं.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
हालांकि GFP अभिव्यक्ति electroporation के बाद 6 घंटे के रूप में जल्दी के रूप में मनाया जा सकता है है, यहाँ हम 4 दिनों ऐसी है कि लक्षित कोशिकाओं के neurite संरचना पर्याप्त विकसित की है electroporation के बाद एक भ्रूण से छवियों को दिखा रहे हैं. एट (zic4: Gal4TA4, यूएएस: mCherry) hzm5 ट्रांसजेनिक बढ़ाने जाल लाइन hindbrain में mCherry के विधान अभिव्यक्ति (और KalTA4) प्रदर्शित करता है, सेरिबैलम, अग्रमस्तिष्क, और 5 दिन (के बाद निषेचन भ्रूण में घ्राण बल्ब छवि 1A और 1C). भ्रूण कि एक यूएएस GFP प्लाज्मिड अभिव्यक्ति लक्षित electroporation (जैसा ऊपर वर्णित), शो GFP अभिव्यक्ति है कि विकासशील घ्राण बल्ब की कोशिकाओं (छवि 1B, 1D, और 1E) के लिए प्रतिबंधित है के द्वारा शामिल किया है. केवल कोशिकाओं transgenically व्यक्त KalTA4 प्रतिलेखन कारक इस यूएएस GFP प्लाज्मिड से अभिव्यक्ति को सक्रिय करने में सक्षम हैं. गैर ट्रांसजेनिक भ्रूण में प्लाज्मिड इस के निगमन किसी भी detectable GFP अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व नहीं करता है. इस प्रकार, यह यूएएस GFP और KalTA4 ड्राइवर कि विकासशील घ्राण बल्ब की कोशिकाओं में GFP के अनन्य अभिव्यक्ति की ओर जाता है के स्थानीयकृत ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के लक्षित electroporation की संयुक्त कार्रवाई है. GFP-व्यक्त कोशिकाओं घ्राण बल्ब mitral कोशिकाओं (छवि 1B और 1D) 10 के विशिष्ट axonal अनुमानों दिखाने. आदेश में अक्षतंतु अनुमानों कल्पना करने के लिए, आंकड़ा 1B और 1D में छवियों के लिए उच्च स्तर पर ऐसी है कि सेल शरीर के क्षेत्र में अच्छी तरह से थे, पर उजागर उजागर किया था. जोखिम के एक निचले स्तर (छवि 1E) से पता चलता है कि वास्तव में सेल निकायों व्यक्त GFP घ्राण बल्ब (चित्र 1C और 1E तुलना. ग्रे लाइन घ्राण बल्ब की सीमा के निशान) के लिए स्थानीयकृत रहे हैं.
चित्रा 1 5 DPF zebrafish भ्रूण की घ्राण बल्ब में GFP अभिव्यक्ति लक्षित है . (: Gal4TA4, यूएएस: zic4 mCherry) एट hzm5 ट्रांसजेनिक बढ़ाने जाल लाइन, hindbrain, सेरिबैलम, अग्रमस्तिष्क, और घ्राण बल्ब (ए और सी, mCherry प्रतिदीप्ति लाल रंग में दिखाया गया है) में mCherry के विधान अभिव्यक्ति को प्रदर्शित करता है . MCherry की यह अभिव्यक्ति ट्रांसजेनिक Gal4 अभिव्यक्ति द्वारा मध्यस्थता है. भ्रूण कि 28 HPF पर अभिव्यक्ति यूएएस GFP सदिश के साथ electroporated किया गया है, के रूप में एक में लक्षित GFP अभिव्यक्ति के 5 दिन बाद निषेचन पर घ्राण बल्ब (बी, डी, और ई, GFP प्रतिदीप्ति हरे रंग में दिखाया समान भ्रूण प्रदर्शन और सी). तल पर एक कम जोखिम छवि (ई) से पता चलता है कि GFP अभिव्यक्ति घ्राण बल्ब की सेल निकायों के लिए सीमित है. ग्रे लाइन घ्राण बल्ब की बॉर्डर इंगित करता है. उज्ज्वल क्षेत्र (ग्रे स्केल), हरी प्रतिदीप्ति (हरा), और लाल प्रतिदीप्ति छवियों (लाल) सभी एक ओलिंप BX60 प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के साथ ले रहे थे.
Discussion
यहाँ हम zebrafish कि बढ़ाने जाल Gal4 ट्रांसजेनिक लाइन विकासशील घ्राण बल्ब में कक्षों की विशिष्ट जनसंख्या को electroporated transgene की अभिव्यक्ति लक्ष्य इस्तेमाल में vivo electroporation विधि में वर्णित है. इस दृष्टिकोण 7 electroporation vivo में सेल प्रकार विशिष्ट बढ़ाने जाल ट्रांसजेनिक 8 लाइनों द्वारा मध्यस्थता अभिव्यक्ति के साथ उत्कृष्ट के अस्थायी समाधान को जोड़ती है. यहाँ हालांकि हम घ्राण बल्ब के लक्ष्यीकरण का वर्णन किया है, vivo electroporation में विकासशील तंत्रिका प्रणाली 2-7 के अन्य क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और बढ़ाने जाल लाइनों Gal4 के कई अलग अलग विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं या ऊतकों में लक्षित अभिव्यक्ति के साथ उपलब्ध हैं 8, 11. बेशक, इस electroporation तकनीक भी LexA या Tet प्रणालियों 13, 14, 15 जैसे अन्य combinatioral आनुवंशिक दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त होना चाहिए . Electroporation की एक प्रमुख लाभ यह है कि वहाँ अतिरिक्त ट्रांसजेनिक दिया है कि एक उपयुक्त Gal4 लाइन उपलब्ध है लाइनों बनाने की जरूरत नहीं है. यह छह महीने बचाता है.
Vivo electroporation में न्यूरॉन्स और उनके पूर्ववर्ती जो कुछ नर्वस सिस्टम के विकास के विशिष्ट चरण 7 ब्याज की है में oligonucleotides के समावेश के लिए अनुमति देता है . यह अस्थायी समाधान विशेष रूप से नुकसान के समारोह के विश्लेषण के लिए फायदेमंद है क्योंकि यह जीन है कि पहले विकास के चरणों में आवश्यक कार्य किया है लक्ष्यीकरण के साथ समस्याओं को दरकिनार कर सकते हैं. विधि हम यहाँ का वर्णन भी आरएनएआई oligonucleotides या constructs और morpholino विरोधी भावना 4 oligonucleotides, 7 सहित हानि के समारोह अभिकर्मकों को शामिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जैसे प्रमुख नकारात्मक प्रोटीन अभिव्यक्ति plasmids या छोटी सड़क के ढालवाँ आरएनएआई plasmids प्लाज्मिड संचालित अभिकर्मकों भी एक Gal4 यूएएस के नियंत्रण के अधीन रखा जा सकता है, सटीक सेल प्रकार के विशिष्ट अभिव्यक्ति हम यहाँ GFP की अभिव्यक्ति के लिए दिखाया गया है के लिए अनुमति देता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम एक NIH R15 क्षेत्र अनुदान के माध्यम से जॉन हॉर्न (; R15MH083221 NIMH) के लिए वित्त पोषित किया गया था.
Materials
Reagents:
Equipment:
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