Summary
Dieser Artikel zeigt zwei sehr unterschiedliche Methoden der Injektion: 1) in das Gehirn (intracerebroventrikuläre) und 2) systemischen (intravenösen), um die therapeutischen Wirkstoffe in das zentrale Nervensystem von neugeborenen Mäusen einzuführen.
Abstract
Trotz der schützenden Rolle, die Blut-Hirn-Schranke spielt in Abschirmung des Gehirns, schränkt den Zugriff auf das zentrale Nervensystem (ZNS), die am häufigsten Ergebnisse in Ausfall potenzieller Therapeutika für neurodegenerative Erkrankungen 1,2 ausgelegt. Neurodegenerative Erkrankungen wie Spinale Muskelatrophie (SMA), in denen die unteren motorischen Neuronen betroffen sind, können großen Nutzen aus der Einführung der Therapeutika in das ZNS. Der Zweck dieses Videos ist es, zwei verschiedene Injektions-Paradigmen demonstrieren, um therapeutische Materialien in neugeborenen Mäusen bald nach der Geburt zu liefern. Eine dieser Methoden ist direktes Einspritzen in zerebralen Seitenventrikel (intracerebroventrikuläre), die im Lieferumfang von Materialien in das ZNS durch die Liquor 3,4 ergibt. Die zweite Methode ist eine zeitliche Vene Injektion (iv) dass verschiedene Therapeutika in das Kreislaufsystem einführen können, was zu einer systematischen Lieferung einschließlich des ZNS 5. Die weit verbreitete Transduktion des ZNS ist erreichbar, wenn eine entsprechende viralen Vektors und virale Serotyp genutzt wird. Visualisierung und Nutzung der V. temporalis zur Injektion ist möglich bis zu postnatalen Tag 6. Allerdings, wenn die gelieferte Material soll das ZNS zu erreichen, sollten diese Injektionen stattfinden, während die Blut-Hirn-Schranke durchlässiger ist wegen seiner unreifen Status, vorzugsweise vor der postnatalen Tag 2. Die ausgereifte Blut-Hirn-Schranke schränkt die Wirksamkeit der intravenösen Lieferung. Beide Delivery-Systeme sind einfach und wirksam, wenn die chirurgische Eignung erreicht wird. Sie benötigen keine umfangreiche chirurgische Geräte und kann von einer einzigen Person durchgeführt werden. Allerdings sind diese Techniken nicht ohne Herausforderungen. Die geringe Größe der postnatalen Tag 2 Welpen und der anschließenden kleinen Zielgebieten können die Injektionen schwierig durchzuführen und zunächst schwierig zu replizieren.
Protocol
1. Intrazerebroventrikuläre Injektion
- Der erste Schritt ist die Vorbereitung der Injektion Stammlösungen; diese Lösungen sind viralen Vektor, Plasmid-DNA, Drogen, und sollte unter sterilen Bedingungen injiziert werden.
- Mix eine gewünschte Titer der viralen Vektor (5-7 ul insgesamt) mit 0,05% w / v Trypanblau in PBS zur Visualisierung der Injektionsstelle.
- Plasmid-DNA-Lösung (5 l ul total) enthält D-(+)-Glucose 20% (w / v) (1 mL), Trypanblau (0,05%) PBS (1 mL), Plasmid (~ 5 ~ g / ~ L ) (2 ~ L) und 2,5 kDa linear PEI-Homopolymer (150 mM) (1 ~ L).
- Immobilisierung der PND 2 Neugeborenen über Cryo-Anästhesie für 1-2 Minuten.
- Die Nadel für diese Einspritzung verwendet wird, ein Mikro-Liter geeicht sterilisiert Glasmikropipette, die zu einer 3ml 3 ml Hamilton-Spritze durch ein langes Rohr befestigt ist.
- Break the Spitze der Nadel (mit Spachtel), für 2 mm Eindringen in den Schädel passen. Stecken Sie die Nadel schräg in die Mikrozentrifugenröhrchen mit der Injektionslösung. Laden Sie die Injektionslösung in die Nadel durch vorsichtiges Ziehen Sie den Kolben der Spritze.
- Nach der Aufnahme der Lösung, distanzieren Sie die Spritze aus der Tube, ziehen Sie den Kolben bis weitere und dann die Nadel wieder befestigen.
- Halten Sie die Nadel in der rechten Hand zwischen Daumen und Zeigefinger und legen Sie die Spritze zwischen dem Mittel-und Ringfinger mit dem Kolben berühren die Handfläche der rechten Hand.
- Fassen Sie die immobilisierten Maus fest an der Haut hinter dem Kopf mit der linken Hand und auf einem Glasfaser-Licht relevanten anatomischen Strukturen, die als Leitfaden genutzt werden kann erhellen.
- Führen Sie die Nadel 2 mm tief, senkrecht zur Kopfoberfläche, an einer Stelle etwa 0,25 mm lateral der Pfeilnaht und 0,50-0,75 mm rostral des Neugeborenen Kranznaht (Abbildung 1A). Dann drücken Sie den Kolben mit der Handfläche des rechten Hand sehr langsam und vorsichtig. Monitor für geplatzten Gefäße oder Schwellungen im Gesicht.
- Entfernen Sie die Nadel 15 Sekunden nach Beendigung der Kolbenbewegung, um den Rückfluss zu verhindern.
- Sich zu erholen, halten die Mäuse für 5-10 Minuten in einer vorgewärmten Behälter, bis Bewegung und allgemeine Reaktionsfähigkeit wiederhergestellt ist.
2. Die intravenöse Injektion über die zeitliche / V. facialis
- Die Lösung injiziert werden sollten darauf vorbereitet sein und ergänzt werden mit gefilterter grüne Lebensmittelfarbe in 1:100 Verdünnung injiziert und unter sterilen Bedingungen.
- Bringen Sie eine kleine Kunststoff-Luer, um das Ende einer 100 ul Glas Hamilton-Spritze. Um den Luer, legen eine 33 gauge 0,25 Zoll Injektionsnadel. Versichern, dass alle Teile richtig angeschlossen sind.
- Legen Sie die Spritze mit dem Volumen injiziert werden, sicherzustellen, dass keine Luft in die Spritze, wie Einblasen von Luft in den Behälter ist tödlich. Es ist oft hilfreich, pipet die Lautstärke zu einem Stück Parafilm injiziert werden. Dies ermöglicht die übersichtliche Visualisierung der Aufnahme der Lösung in die Spritze.
- A Wee Sight Transilluminator wird verwendet, um einfach visualisieren die oberflächliche temporale Vene oder Vena facialis, beim Neugeborenen (Abbildung 2A). Vor der Injektion sicher das Neugeborene den Transilluminator mit chirurgischen Band. Gaze sollte zwischen dem Neugeborenen und das Band, das Band aus Beschädigung der Haut des Tieres zu verhindern platziert werden. Sichern Sie das Tier auf dem Transilluminator auf seiner Seite, dass das Band nicht verhindern Atmung. Das Neugeborene Hals sollte vorsichtig gedreht werden, so dass die Vena facialis gut sichtbar ist und die Nase sollte mit Klebeband an den Kopf zu stabilisieren.
- Mit einem 2.25X Kopfbandlupe, um eine einfachere Visualisierung zu ermöglichen, langsam die Nadel in die Vene. Die Vene ist sehr oberflächlich, so sollte die Nadel bleibt unter der Haut sichtbar.
- Langsam ziehen die Menge der Lösung in die Vene. Der grüne Farbstoff ermöglicht eine einfache Visualisierung der Injektion.
- Warten Sie 15 Sekunden vor dem Entfernen der Nadel, da es eine Verzögerung zwischen voll deprimierend den Kolben der Spritze und der Vertreibung der restlichen Lösung aufgrund der extrem schmalen Nadelbohrung.
- Nach dem Entfernen der Nadel, verwenden Gaze, um Druck auf die Injektionsstelle gelten, bis die Blutung aufhört.
- Überwachen Sie die Neugeborenen für Anzeichen von Leiden. Nach einer korrekten Injektion, sollte keine offenen Not beobachtet werden. Das Neugeborene sollte etwa 5 Minuten zu erholen, bevor es in den Käfig zurück gegeben werden.
- Spülen Sie die Nadel / Spritze Einheit mit PBS in zwischen den Injektionen wie Blut in die Nadel schnell verstopfen wird es durch kleine Bohrung.
3. Repräsentative Ergebnisse:
ICV-Injektion: Das Gehirn kann zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion geerntet und visualisiert werden, um erfolgreich Injektionstechnik zu demonstrieren. Wenn der Farbstoff nicht zu der Injektionslösung gegeben, wird es schwierig sein, für die Richtigkeit der in Prüfungjection. Proper Injektion einer der Herzkammern wird Verteilung der Trypanblau auf das injizierte Seite des Gehirns ermöglichen ca. 10-15 Minuten nach der Injektion (Abbildung 1B). Eine gleichmäßige Verteilung der Trypanblau in der rechten und linken Gehirnhälften und Riechkolben sichtbar sein wird etwa 60 Minuten nach der Injektion (Abbildung 1C). Dies ist darauf zurückzuführen, um die Konnektivität der Hirnventrikel, dass die Verbreitung des blauen Farbstoffs zu den angrenzenden Ventrikel erlauben. Präzise Injektionen können auch visualisiert werden Zerstreuung der blaue Farbstoff in der rostralen zentralen Wirbelkanal etwa innerhalb von 12 Stunden nach der Injektion (Abbildung 1D). Ungenaue Injektionen können durch das Fehlen der blauen Farbe in Hemisphären unterscheiden. In diesem Fall wurde die Tiefe der Nadel nicht ausreichend und der Injektionslösung hat wahrscheinlich unter der Haut verteilt. Eine alternative Möglichkeit ist, dass die Nadel zu tief in das Gehirn eingedrungen, wodurch vorbei über die Ventrikel und die Lösung wird unter dem Hirnventrikel geleert.
Iv Injektion: Präzise und effiziente zeitliche / V. facialis Injektion sofort visualisiert werden nach der Injektion. Da die Lösung injiziert wird, kann der grüne Farbstoff für die Visualisierung der Lösung eingeben und fließt durch die Vena facialis (Abbildung 2A). Darüber hinaus wird verändert die Hautfarbe der Maus nach Injektion beobachtet werden. Das Neugeborene ist normal rosa Farbe auf grün umgewandelt, aufgrund des Vorhandenseins von grünen Lebensmittelfarbe in der Injektionslösung (Abbildung 2B). Das Ausmaß der grünen Farbe ändern bei Neugeborenen beobachtet ist abhängig von der Konzentration an Farbstoff verwendet. Für eine einfache Visualisierung der Injektion und während einer Praxis Frist eine 1:50-Verdünnung empfohlen. Doch die dramatisch verändert Hautton führt oft zu der Welpe von der Mutter abgelehnt und damit die Entfernung der Farbstoff oder eine deutlich reduzierte Konzentration sollte während der experimentellen Verfahren in Betracht gezogen werden. Eine ungenaue Injektion wird in der Anhäufung von grünem Farbstoff unter die Haut an der Injektionsstelle führen. Unvollständige Injektion, die bei der Öffnung der Nadel ist nicht vollständig in die Vene eingeführt auftritt, wird gesehen, wenn eine Lösung in die Vene fließt und einige sammelt sich unter der Haut. Wenn dies beachtet, sollte die Nadel weiter in das Gefäß eingeführt werden.
Abbildung 1. Demonstration erfolgreicher ICV-Injektionen in PDN2 Mäusen. A) Schematische Darstellung der Injektionsstellen in ICV-Injektionen in die Ventrikel eingesetzt. B) Brain von ICV injiziert Pup mit Trypanblau in PBS auf der linken Herzkammer, Foto 15 Minuten nach der Injektion entnommen. C ) Brain von ICV injiziert mit Trypanblau in PBS Pup auf der linken Herzkammer, Foto aufgenommen 60 Minuten nach der Injektion. D) Rostral zentralen Wirbelkanal in ICV gezeigt injiziert wird mit Trypanblau in PBS pup am linken Ventrikels, Foto aufgenommen 12 Stunden nach der Injektion.
Abbildung 2. Demonstration erfolgreicher IV-Injektionen in PDN2 Mäusen. A) Schematische Darstellung der Vena facialis für IV-Injektionen genutzt. B) Pup injiziert IV mit grünem Farbstoff in PBS zu un-injiziert Wurfgeschwister verglichen, Foto sofort nach der Injektion entnommen.
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Discussion
Forschung mit Maus-Modellen der Erkrankung erfordert oft die Verabreichung von Medikamenten oder anderen Substanzen bei Neugeborenen. In diesem Video zeigen wir den Schritt-für Schritt-Verfahren mit zwei Arten der Injektion Strategien, die verwendet werden, um das ZNS Ziel kann sein: 1) direkte Injektion in das ZNS Nutzung intracerebroventrikuläre (ICV) Injektion, oder 2) iv Injektion gezielt die zeitliche / Vena facialis. Das Timing dieser Injektionen ist von großer Bedeutung. Da die ICV-Injektionen Freihand sind, muss der Schädel relativ formbar. Diese Art der Injektion ist nur durch die erste Woche des Lebens möglich ist, und wird zunehmend schwieriger und schädlich für die Tiere, wie die Tiere alt. Allerdings ist der Hauptvorteil, dass die direkte Lieferung an das ZNS erreicht wird, effektiv unter Umgehung der Blut-Hirn-Schranke. Deshalb, wenn ein Ermittler entwickelnden ZNS-Therapeutika, ist es möglich, Verbindungen, die nicht vollständig für Drogen-ähnliche Eigenschaften wie Blut-Hirn-Schranken-Permeabilität optimiert zu analysieren, kann jedoch Verbindung Aktivität in krankheits-relevanten Gewebe gemessen werden. Die Nutzung der V. temporalis in den ersten Tagen des Lebens hat sich bewährt, da dies ein relativ nicht-invasive Technik für allgemeine IV Verwaltung. In diesem Entwicklungsstadium sind keine zusätzlichen Adern leicht zugänglich, wie die Schwanzvene die leichter zugänglich während der zweiten Woche des Lebens 5 wird. Beide Injektionstechniken sind sicher und können durchgeführt werden freihändig, mit Mäusen erholt kurz nach der Injektion ohne schädliche Nebenwirkungen. Beide Techniken eignen sich für schnelle Injektion von einer Gruppe von Tieren in einem kurzen Zeitraum. Sie erfordern angemessene Visualisierung der Zielbereich für eine erfolgreiche Injektion zu gewährleisten. Dies wird durch die Transilluminator und Vergrößerungsspiegel Stirnband in IV-Injektion (Tabelle 1) und eines faseroptischen Licht in ICV Injektion zur Verfügung gestellt.
Einer der Vorteile der intravenösen Injektion ist, dass ein größeres Volumen (100 ∞ Ll) mit ~ 90% Erfolgsquote 6 kann injiziert werden. Häufige Probleme beim Lernen der IV-Technik begegnet sind Nadel Abhandenkommen was zu subkutanen Injektionen und / oder unvollständiger Injektionen. Diese Probleme können durch die Gewährleistung der Abschrägung der Nadel gründlich durch das Gefäß threaded begegnet werden. Die Nadel wird in das Gefäß eingeführt weit genug, dass die Abschrägung der Nadel vollständig durch das Schiff umgeben sein. Zusätzlich das Schiff extrem oberflächlich ist, damit der Injektor muss sicherstellen, dass die Nadel in das Gefäß und nicht darunter. Um zu überprüfen, ob die Nadel in das Gefäß, nach der Platzierung der Nadel sollte vorsichtig bewegt werden hin und her. Wenn die Nadel des Schiffes eingedrungen ist, wird das Schiff bewegen sich mit der Nadel. Wenn das Schiff nicht bewegt, wird die Nadel nicht richtig eingesetzt. Die Durchführung dieser Prüfung vor der Injektion wird die Zahl der erfolgreichen Injektionen. Neonatal Lieferung von AAV9 Vektoren wurde kürzlich genutzt, um erfolgreich zu transduzieren einen hohen Anteil von Motoneuronen mit rekombinanten AAV-Vektoren in SMA-Mäusen 7,8.
Die wichtigste Überlegung bei der ICV Injektion umfasst die Länge der Nadelspitze. Die Spitze muss lang genug, so dass sie mindestens 2 mm in den Schädel eindringen können. Wenn die Spitze nicht lang genug ist, wird die Nadel nicht in der Lage sein, effizient in die Ventrikel ein. Alternativ, wenn die Spitze zu lang ist, hindert dies die Akzeptanz der Lösung injiziert werden und schafft auch eine fragile Spitze, die schwierig zu korrekt Führer durch die Schädel ist. Der Winkel der Nadel ist wichtig, genau das Eindringen in die Ventrikel zu gewährleisten, indem sie senkrecht auf den Schädel mit der Spitze in Richtung der Pfeilnaht. ICV-Injektionen wurden in zahlreichen Studien verwendet worden, um Verbindungen, Drogen, therapeutische RNAs, Plasmid-DNA und virale Vektoren in das ZNS der erkrankten Mäuse Modelle 4,9-17 einzuführen. Allerdings ist der limitierende Faktor in ICV Injektion der geringen Kapazität der Hirnventrikel bei neugeborenen Mäusen, die nicht zulassen, kann das Eindringen eines gewünschten Volumens der Therapeutika. Daher ist die Fähigkeit, therapeutische Expression mit einer niedrigeren Dosis Vektor in kurzer Zeit zu erreichen besonders wichtig, wenn das Fördervolumen beschränkt ist.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei John Marston für Experten der Tierhaltung und Dr. Marco A. Passini danken für die technische Unterstützung in der Anfangsphase dieses Projekts. Diese Arbeit wurde durch Zuschuss von der National Institutes of Health zur CLL (; R01HD054413 R01NS41584) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Green Food Dye | McCormick & Co. | n/a | Must be filtered |
| Hamilton Glass Syringe (100 μL) | Sigma-Aldrich | 20702 | |
| LuerMxF Thread Style White Nylon | Small Parts, Inc. | VPLF-LC78-1-25 | |
| Fine gauge Hypodermic Needles | Popper & Sons, Inc. | 7111 | Size: 33(SWG) x ¼" (6.35 MM) |
| Wee Sight Transilluminator | Respironics | 1017920 | |
| 2.25X Headband Magnifier | MagEyes | Model No. 5 | Select magnification to fit individual preferences |
References
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