Summary
1) (intracerebroventricular) मस्तिष्क और 2) प्रणालीगत (नसों में) में नवजात चूहों के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में चिकित्सीय एजेंट परिचय: यह लेख इंजेक्शन के दो बहुत अलग तरीकों को दर्शाता है.
Abstract
सुरक्षात्मक भूमिका है कि रक्त मस्तिष्क बाधा मस्तिष्क परिरक्षण में खेलता है के बावजूद, यह केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) के लिए उपयोग की सीमा जो संभावित neurodegenerative विकारों 1,2 के लिए डिज़ाइन चिकित्सा विज्ञान की विफलता में सबसे अक्सर परिणाम है. रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष (SMA) जैसे neurodegenerative रोगों, जिसमें कम मोटर न्यूरॉन्स को प्रभावित कर रहे हैं, बहुत सीएनएस में चिकित्सीय एजेंट को शुरू करने से लाभ प्राप्त कर सकते हैं. इस वीडियो के उद्देश्य के लिए दो अलग इंजेक्शन मानदंड प्रदर्शित नवजात चूहों में चिकित्सीय सामग्री देने के जन्म के बाद जल्दी ही है. इन तरीकों में से एक पार्श्व प्रमस्तिष्क (Intracerebroventricular) निलय सामग्री के मस्तिष्कमेरु द्रव 3,4 के माध्यम से सीएनएस में प्रसव में जो परिणाम में सीधे इंजेक्शन है. दूसरी विधि में एक अस्थायी नस (अंतःशिरा इंजेक्शन) कि संचार प्रणाली में विभिन्न चिकित्सा विज्ञान का परिचय, 5 सीएनएस सहित प्रणालीगत प्रसव के लिए अग्रणी कर सकते हैं. सीएनएस की फैली हुई पारगमन प्राप्त है अगर एक उपयुक्त वायरल सदिश और वायरल सीरोटाइप उपयोग किया जाता है. विज़ुअलाइज़ेशन और इंजेक्शन के लिए अस्थायी नस उपयोग प्रसवोत्तर 6 दिन के लिए संभव है. हालांकि, अगर वितरित सामग्री CNS तक पहुँचने का इरादा है, इन इंजेक्शनों जगह ले जबकि रक्त मस्तिष्क बाधा की वजह से अपनी अपरिपक्व स्थिति पारगम्य है चाहिए, अधिमानतः प्रसव के बाद दो दिन से पहले. पूरी तरह से विकसित रक्त मस्तिष्क बाधा बहुत नसों में प्रसव के प्रभाव को सीमित है. दोनों वितरण प्रणाली को सरल और प्रभावी रहे हैं एक बार शल्य चिकित्सा योग्यता हासिल की है. वे किसी भी व्यापक शल्य चिकित्सा उपकरणों की आवश्यकता नहीं है और एक ही व्यक्ति द्वारा किया जा सकता है है. हालांकि, इन तकनीकों चुनौतियों के बिना नहीं कर रहे हैं. प्रसव के बाद दो दिन पिल्ले और बाद में छोटे लक्ष्य क्षेत्रों के छोटे आकार के इंजेक्शन मुश्किल प्रदर्शन करने और शुरू चुनौतीपूर्ण को दोहराने कर सकते हैं.
Protocol
1. Intracerebroventricular इंजेक्शन
- पहला कदम इंजेक्शन स्टॉक समाधान की तैयारी है, इन समाधानों वायरल वेक्टर, प्लास्मिड डीएनए, दवाओं, और बाँझ शर्तों के तहत इंजेक्शन होना चाहिए.
- वायरल सदिश (5-7 μL कुल) के एक वांछित अनुमापांक 0.05% इंजेक्शन साइट के दृश्य के लिए w / ध् पीबीएस में trypan नीले के साथ मिक्स.
- प्लास्मिड डीएनए समाधान (5 एल μL कुल) डी (+) 20% (w / v) (1 μL) ग्लूकोज, trypan (0.05%) नीले पीबीएस (1 μL), प्लाज्मिड (5 ~ ~ जी ~ / एल शामिल 2) (~), एल, और 2.5 रैखिक पी (150 मिमी) homopolymer केडीए (1 ~ एल).
- 1-2 मिनट के लिए क्रायो - संज्ञाहरण के माध्यम से PND 2 नवजात शिशुओं स्थिर.
- इस इंजेक्शन के लिए प्रयोग किया जाता सुई एक माइक्रो लीटर कैलिब्रेटेड निष्फल कांच micropipette कि एक लंबी ट्यूब के माध्यम से एक 3ml 3 एमएल हैमिल्टन सिरिंज से जुड़ा हुआ है है.
- सुई (रंग के साथ) 2 मिमी खोपड़ी में प्रवेश के लिए समायोजित करने की नोक तोड़ो. Microcentrifuge इंजेक्शन समाधान युक्त ट्यूब में सुई तिरछे प्लेस. सुई में सावधानी सिरिंज के सवार खींच द्वारा इंजेक्शन समाधान लोड.
- समाधान के तेज के बाद, ट्यूब से सिरिंज अलग सवार खींच आगे और फिर सुई के लिए फिर से संलग्न.
- अंगूठे और तर्जनी के बीच दाहिने हाथ में सुई पकड़ो और दाहिने हाथ की हथेली को छू सवार के साथ मध्यम और अंगूठी उंगलियों के बीच सिरिंज जगह.
- मजबूती से एक फाइबर ऑप्टिक प्रकाश पर बाएं हाथ और जगह का उपयोग करने के लिए प्रासंगिक शारीरिक संरचनाओं कि एक गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता रोशन के सिर के पीछे त्वचा द्वारा immobilized माउस मुट्ठी.
- सुई दो गहरे मिमी, सीधा सम्मिलित खोपड़ी की सतह के लिए एक स्थान 0.25 लगभग बाण के समान सिवनी के लिए पार्श्व मिमी और 0.50-0.75 मिमी नवजात कोरोनरी सिवनी (चित्रा 1 ए) के लिए विजय - स्तम्भ पर फिर धक्का सवार की हथेली का उपयोग सही हाथ बहुत धीरे से और ध्यान. उठी वाहिकाओं या चेहरे की सूजन के लिए मॉनिटर.
- सवार के लिए backflow को रोकने के आंदोलन के विच्छेदन के बाद सुई 15 सेकंड निकालें.
- ठीक हो, एक गर्म कंटेनर में 5-10 मिनट के लिए चूहों रखने के लिए जब तक आंदोलन और सामान्य जवाबदेही बहाल है.
2. लौकिक / चेहरे की नस के माध्यम से अंतःशिरा इंजेक्शन
- इंजेक्शन जा समाधान तैयार किया जाना चाहिए फ़िल्टर्ड हरी भोजन डाई के साथ पूरक 1:100 कमजोर पड़ने पर और बाँझ की शर्तों के तहत इंजेक्शन.
- एक 100 μL कांच हैमिल्टन सिरिंज के अंत करने के लिए एक छोटे से प्लास्टिक luer संलग्न. Luer करने के लिए, एक 33 गेज 0.25 इंच चमड़े के नीचे सुई देते हैं. बीमा है कि सभी भागों सुरक्षित से जुड़े हुए हैं.
- मात्रा के साथ इंजेक्शन जा सिरिंज लोड, सुनिश्चित करना है कि वहाँ हवा के पोत में इंजेक्शन के रूप में सिरिंज में कोई हवा नहीं है घातक है. यह अक्सर parafilm का एक टुकड़ा पर्यत इंजेक्शन जा मात्रा pipet के लिए उपयोगी है. इस सिरिंज में समाधान की तेज स्पष्ट दृश्य के लिए अनुमति देता है.
- एक मूत दृष्टि Transilluminator आसानी से सतही नस लौकिक, या नवजात शिशु में चेहरे की नस (2A चित्रा) कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इंजेक्शन से पहले, शल्य चिकित्सा टेप का उपयोग transilluminator नवजात शिशु सुरक्षित. धुंध नवजात शिशु और टेप करने के लिए जानवर की त्वचा को नुकसान पहुँचाए से टेप को रोकने के बीच रखा जाना चाहिए. अपने पक्ष पर transilluminator करने के लिए पशु सुरक्षित, सुनिश्चित करना है कि टेप श्वसन को रोकने नहीं करता है. नवजात शिशु गर्दन धीरे हो सकते हैं, इसलिए दिया जाना चाहिए कि चेहरे नस आसानी से दिखाई देता है और नाक के लिए सिर को स्थिर करने के लिए टेप किया जाना चाहिए.
- 2.25X हेडबैंड ताल का उपयोग करने के लिए आसान दृश्य के लिए अनुमति देते हैं, धीरे धीरे नस में सुई डालने. नस बहुत सतही है तो सुई त्वचा के नीचे दिखाई रहना चाहिए.
- धीरे - नस में समाधान की मात्रा दिखे. हरे रंग इंजेक्शन की आसान दृश्य के लिए अनुमति देता है.
- पहले सुई को हटाने के रूप में वहाँ पूरी तरह से सिरिंज और शेष अत्यंत संकीर्ण सुई बोर के कारण समाधान के निष्कासन के सवार निराशाजनक के बीच एक अंतराल है 15 सेकंड रुको.
- सुई को हटाने के बाद धुंध का उपयोग इंजेक्शन साइट के लिए दबाव लागू जब तक खून बह रहा है रहता है.
- संकट के संकेत के लिए नवजात शिशु मॉनिटर. एक उचित इंजेक्शन के बाद, कोई प्रकट संकट मनाया जाना चाहिए. नवजात शिशु लगभग 5 मिनट ठीक करने के पहले यह पिंजरे में लौट रहा है दी जानी चाहिए.
- फ्लश इंजेक्शन के बीच में पीबीएस के साथ यूनिट / सुई और सिरिंज सुई में रक्त के रूप में जल्दी से इसे छोटे बोर की वजह से रोकना होगा.
3. प्रतिनिधि परिणाम:
ICV इंजेक्शन: मस्तिष्क अलग समय अंक के बाद इंजेक्शन पर काटा जा सकता है और सफल इंजेक्शन तकनीक का प्रदर्शन visualized . यदि डाई इंजेक्शन समाधान नहीं जोड़ा है, यह मुश्किल हो सकता है में की सटीकता के लिए जाँच करेगाjection. एक निलय के समुचित इंजेक्शन मस्तिष्क के इंजेक्शन तरफ trypan नीले के वितरण की अनुमति देगा लगभग 10-15 मिनट के पोस्ट इंजेक्शन (चित्रा 1 बी) . दोनों सही और बाएँ मस्तिष्क गोलार्द्धों और घ्राण बल्ब में एक trypan नीले रंग के समान वितरण दिखाई लगभग 60 मिनट के पोस्ट इंजेक्शन (चित्र 1C) हो जाएगा . यह मस्तिष्क ventricles कि आसन्न वेंट्रिकल नीले रंग की डाई के प्रसार की अनुमति देगा की कनेक्टिविटी की वजह से है. सटीक इंजेक्शन भी चोंच पर का लगभग 12 घंटे पोस्ट इंजेक्शन (चित्रा 1D) के भीतर केंद्रीय स्पाइनल कैनाल में नीले रंग की डाई के प्रसार के द्वारा visualized किया जा सकता है. गलत इंजेक्शन मस्तिष्क गोलार्द्धों में नीले रंग की कमी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. इस मामले में, सुई की गहराई के लिए पर्याप्त नहीं है और इंजेक्शन समाधान शायद त्वचा के तहत वितरित की है. एक वैकल्पिक संभावना है कि सुई भी मस्तिष्क में गहरी penetrated, जिससे वेंट्रिकल और समाधान मस्तिष्क ventricles के नीचे खाली कर दिया है परे गुजर.
चतुर्थ इंजेक्शन: सटीक और कुशल लौकिक / चेहरे की नस इंजेक्शन इंजेक्शन के बाद तुरंत कल्पना कर सकते हैं. समाधान के रूप में इंजेक्शन है, हरे रंग में प्रवेश और चेहरे शिरा (चित्रा 2A) के माध्यम से बह समाधान के दृश्य के लिए अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त, माउस के बदल त्वचा का रंग निम्नलिखित इंजेक्शन मनाया जाएगा. नवजात शिशु के सामान्य गुलाबी रंग हरे रंग के लिए बदल जाती है, इंजेक्शन समाधान में हरी भोजन डाई (चित्रा 2B) की उपस्थिति के कारण. हरे रंग नवजात शिशु में मनाया परिवर्तन की हद तक इस्तेमाल किया डाई की एकाग्रता पर निर्भर है. इंजेक्शन और एक अभ्यास की अवधि के दौरान साधारण दृश्य के लिए, एक 1:50 कमजोर पड़ने की सिफारिश की है. हालांकि, नाटकीय रूप से बदल त्वचा टोन अक्सर माँ द्वारा पिल्ला अस्वीकार कर दिया जा रहा है और इसलिए, डाई या एक काफी कम एकाग्रता के हटाने प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान विचार किया जाना चाहिए में परिणाम है. एक गलत इंजेक्शन इंजेक्शन के स्थल पर त्वचा के नीचे हरे रंग के संचय में परिणाम देगा. अधूरा इंजेक्शन, जो तब होता है जब सुई के उद्घाटन के नस के भीतर पूरी तरह से नहीं डाला जाता है देखा जाता है जब कुछ समाधान नस में बहती है और कुछ त्वचा के नीचे जमा है. यदि यह मनाया जाता है, सुई पोत में आगे डाला चाहिए.
चित्रा 1 PDN2 चूहों में सफल ICV इंजेक्शन के प्रदर्शन. ए) इंजेक्शन ventricles में ICV इंजेक्शन में उपयोग साइटों की योजनाबद्ध). बी ICV से ब्रेन के बाएं वेंट्रिकल पर पीबीएस में trypan नीले रंग के साथ पिल्ला इंजेक्शन, फोटो 15 मिनट के बाद इंजेक्शन लिया सी ICV से) ब्रेन पीबीएस में trypan नीले रंग के साथ बाएं वेंट्रिकल पर पिल्ला इंजेक्शन लिया तस्वीर 60 मिनट के बाद इंजेक्शन डी) विजय - स्तम्भ केंद्रीय स्पाइनल कैनाल ICV में दिखाया गया है पीबीएस में trypan नीले रंग के साथ बाएं वेंट्रिकल पर पिल्ला इंजेक्शन, 12 घंटे पोस्ट इंजेक्शन लिया फोटो .
चित्रा 2 PDN2 चूहों में सफल चतुर्थ इंजेक्शन के प्रदर्शन. ए) चेहरे चतुर्थ इंजेक्शन के लिए उपयोग नस के योजनाबद्ध). बी पीबीएस में हरे रंग के साथ पिल्ला इंजेक्शन चतुर्थ संयुक्त राष्ट्र इंजेक्शन littermate की तुलना में, फोटो तुरंत पद इंजेक्शन लिया.
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Discussion
अनुसंधान रोग के माउस मॉडल का उपयोग अक्सर नवजात शिशुओं के लिए दवाओं या अन्य पदार्थों के प्रशासन की आवश्यकता है. इस वीडियो में, हम का प्रदर्शन कदम दर कदम प्रक्रियाओं को शामिल इंजेक्शन रणनीतियों के दो प्रकार है कि CNS के लक्ष्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: 1) intracerebroventricular इंजेक्शन (ICV) का उपयोग सीएनएस में प्रत्यक्ष इंजेक्शन, या 2) चतुर्थ लौकिक / लक्ष्यीकरण इंजेक्शन चेहरे की नस. इन इंजेक्शनों के समय काफी महत्व की है है. चूंकि ICV इंजेक्शन मुक्तहस्त हैं, खोपड़ी अपेक्षाकृत नरम होना चाहिए. इंजेक्शन के इस प्रकार केवल जीवन के पहले सप्ताह के माध्यम से संभव है, और तेजी से और अधिक चुनौतीपूर्ण और पशुओं उम्र के रूप में पशुओं के लिए हानिकारक हो जाता है. हालांकि, प्राथमिक लाभ यह है कि सीएनएस के लिए प्रत्यक्ष वितरण हासिल की है, प्रभावी रूप से रक्त मस्तिष्क बाधा को दरकिनार. इसलिए, अगर एक अन्वेषक सीएनएस चिकित्सा विकसित कर रहा है, यह यौगिकों कि पूरी तरह से रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता के रूप में दवा की तरह गुणों के लिए अनुकूलित नहीं कर रहे हैं का विश्लेषण संभव है, तथापि, यौगिक गतिविधि रोग प्रासंगिक ऊतकों में मापा जा सकता है. लौकिक नस के जीवन के पहले कुछ दिनों के दौरान प्रयोग करें मूल्यवान साबित हो गया है के रूप में यह सामान्य चतुर्थ प्रशासन के लिए एक अपेक्षाकृत गैर इनवेसिव तकनीक है. इस विकास के चरण में, कोई अतिरिक्त नसों पूंछ नस जो 5 जीवन के दूसरे सप्ताह के दौरान और अधिक सुलभ हो जाता है जैसे आसानी से सुलभ, कर रहे हैं. दोनों इंजेक्शन तकनीक सुरक्षित हैं और मुक्तहस्त किया जा सकता है किसी भी हानिकारक दुष्प्रभावों के बिना इंजेक्शन के बाद शीघ्र ही ठीक चूहों के साथ. दोनों तकनीकों के समय की एक छोटी अवधि में पशुओं के एक समूह के तेजी से इंजेक्शन के लिए उपयुक्त हैं. वे लक्षित क्षेत्र के समुचित दृश्य को सुनिश्चित करने के लिए एक सफल इंजेक्शन की आवश्यकता होती है. यह transilluminator और चतुर्थ इंजेक्शन में आवर्धक हेडबैंड (1 टेबल) और ICV इंजेक्शन में एक फाइबर ऑप्टिक प्रकाश द्वारा प्रदान की गई है.
चतुर्थ इंजेक्शन के फायदे में से एक है कि एक बड़ी मात्रा में (100 ∞ करूँगा) ~ 90% सफलता दर 6 के इंजेक्शन के साथ किया जा सकता है है. जबकि चतुर्थ तकनीक सीखने का सामना करना पड़ा आम समस्याओं सुई उपचर्म इंजेक्शन और / या अधूरा इंजेक्शन में जिसके परिणामस्वरूप misplacement शामिल हैं. इन समस्याओं को सुनिश्चित करना है सुई के बेवल को अच्छी तरह से पोत के माध्यम से लड़ी पिरोया है द्वारा मुकाबला किया जा सकता है है. सुई पोत में डाला जाना चाहिए है अभी तक पर्याप्त है कि सुई के बेवल पूरी तरह से पोत द्वारा घिरा हुआ है. इसके अतिरिक्त, पोत बेहद सतही है, इस प्रकार सुई लगानेवाला सुनिश्चित करना चाहिए कि सुई के बर्तन में है और इसे नीचे नहीं. जांच अगर सुई बर्तन में है, नियुक्ति के बाद सुई धीरे की ओर से किया जाना चाहिए ओर ले जाया गया. यदि सुई पोत प्रवेश कर गया है, बर्तन के साथ सुई के साथ कदम होगा. यदि पोत कदम नहीं करता है, सुई ठीक से नहीं डाला जाता है. इंजेक्शन से पहले इस चेक का निष्पादन सफल इंजेक्शन की संख्या में वृद्धि होगी. AAV9 वैक्टर नवजात डिलीवरी हाल ही में मोटर न्यूरॉन्स 7,8 SMA चूहों में पुनः संयोजक AAV वैक्टर का उपयोग करने के लिए सफलतापूर्वक एक उच्च प्रतिशत transduce का उपयोग किया गया है.
ICV इंजेक्शन के दौरान सबसे महत्वपूर्ण विचार सुई टिप की लंबाई शामिल है. टिप ऐसे लंबे समय पर्याप्त है कि यह खोपड़ी में कम से कम 2 मिमी घुसना कर सकते हैं होना चाहिए. यदि टिप लंबे समय पर्याप्त नहीं है, सुई कुशलतापूर्वक ventricles में प्रवेश करने में सक्षम नहीं होगा. वैकल्पिक रूप से, अगर टिप बहुत लंबा है, यह इंजेक्शन जा समाधान की तेज hinders और यह भी एक नाजुक टिप है कि खोपड़ी के माध्यम से सही ढंग से मार्गदर्शन करने के लिए मुश्किल है बनाता है. सुई के कोण महत्वपूर्ण है वेंट्रिकल में यह सीधा बाण के समान सीवन ओर टिप के साथ खोपड़ी को पकड़ कर सही पहुंच सुनिश्चित करने के लिए. ICV इंजेक्शन कई अध्ययनों में उपयोग किया गया है रोगग्रस्त चूहों 4,9-17 मॉडल के सीएनएस में यौगिकों, दवाओं, चिकित्सीय RNAs, प्लाज्मिड DNAs, और वायरल vectors परिचय. हालांकि, ICV इंजेक्शन में सीमित कारक नवजात चूहों में मस्तिष्क वेंट्रिकल है कि चिकित्सीय एजेंटों के एक वांछित मात्रा के प्रवेश की अनुमति नहीं हो सकती के छोटे क्षमता है. इसलिए, चिकित्सकीय अभिव्यक्ति समय की एक छोटी अवधि में एक कम वेक्टर खुराक का उपयोग करने के स्तर तक पहुँचने की क्षमता विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जहां प्रसव की मात्रा सीमित है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए इस परियोजना के प्रारंभिक चरणों में विशेषज्ञ पशुपालन और डॉ. मार्को ए Passini के लिए जॉन Marston तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं. यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य के CLL संस्थान (; R01HD054413 R01NS41584) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Green Food Dye | McCormick & Co. | n/a | Must be filtered |
| Hamilton Glass Syringe (100 μL) | Sigma-Aldrich | 20702 | |
| LuerMxF Thread Style White Nylon | Small Parts, Inc. | VPLF-LC78-1-25 | |
| Fine gauge Hypodermic Needles | Popper & Sons, Inc. | 7111 | Size: 33(SWG) x ¼" (6.35 MM) |
| Wee Sight Transilluminator | Respironics | 1017920 | |
| 2.25X Headband Magnifier | MagEyes | Model No. 5 | Select magnification to fit individual preferences |
References
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