Summary
Het hoornvlies is uniek omdat het ontbreekt vaatweefsel. Echter, robuuste groei van bloedvaten en overleving worden geïnduceerd in het hoornvlies door de krachtige angiogene factoren. Daarom kan het hoornvlies te voorzien van ons een waardevol hulpmiddel voor angiogene studies. Dit protocol laat zien hoe u de muis-model van het hoornvlies pocket test en hoe de angiogenese veroorzaakt door angiogene factoren het gebruik van dit model te beoordelen.
Abstract
Een normale hoornvlies is duidelijk van vasculaire weefsels. Echter, de bloedvaten worden geïnduceerd om te groeien en te overleven in het hoornvlies bij de potente angiogene factoren zijn een toegediend. Deze uniciteit heeft het hoornvlies zak test een van de meest gebruikte modellen voor angiogenese studies. Het hoornvlies componeert meerdere lagen van cellen. Het is dus mogelijk om in te sluiten een pellet met de angiogene factor van belang in het hoornvlies om de angiogene effect 2,3 onderzoeken. Hier bieden wij een stap voor stap demonstratie van hoe (I) te produceren van de angiogene factor-bevattende pellet (II) inbedden van de pellet in het hoornvlies (III) het analyseren van de angiogenese geïnduceerd door de angiogene factor van belang. Omdat de basis-fibroblast groeifactor (bFGF) is bekend als een van de meest potente angiogene factoren 4, wordt het hier gebruikt om angiogenese te induceren in het hoornvlies.
Protocol
Alle apparatuur en reagentia die worden gebruikt zijn steriel. Het protocol werd goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite (ACUC) op het NEI / NIH (dierlijke studie protocol NEI-553), en werd uitgevoerd volgens de NIH richtlijnen en regelgeving.
1. De productie van de angiogene factor-bevattende pellets
In dit deel worden de pellets met de angiogene factor van belang voorbereid.
- Maak 10% (w / v) sucralfaat oplossing met PBS. Bewaar bij kamertemperatuur.
- Maak 12% (w / v) poly-HEMA met absolute ethanol. Bewaar bij kamertemperatuur.
- Maak 1 ug / ul bFGF oplossing. Bewaren in -80 ° C.
- Om 50 pellets, mix 5 ul van poly-HEMA, 1μl van sucralfaat en 4 pl van bFGF voorraadoplossing, vortex grondig.
- Leg een stukje schone parafilm in een petrischaal, bloot onder UV-licht gedurende 15 minuten in een weefselkweek kap. Druppel 0,2 ul van de oplossing mengsel op de parafilm voor een pellet. Zo zou 10 ul van de oplossing mengsel opbrengst 50 pellets. Laat de korrels drogen bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur. De gedroogde pellets kan worden opgeslagen in 4 oC gedurende meerdere dagen, of -80 ° C voor enkele maanden.
- Bij het gebruik, wrik en pak de pellets met de uiteinden van een pincet. Wees uiterst voorzichtig om hen niet te breken of maken ze het voorjaar weg.
2. Het uitvoeren van de muis hoornvlies pocket-test
In dit deel zullen we laten zien hoe je een zak in de muis hoornvlies te maken, en hoe je een pellet in te voegen in de zak. De angiogene factor in de pellet zal geleidelijk worden vrijgegeven aan de omgeving van het hoornvlies (afb. 1). In deze demonstratie maken we gebruik van 8-week vrouwelijke C57/Bl6 muizen.
- De muis is zeer systematisch verdoofd met het mengsel van ketamine (75 mg / kg) en xylazine (5mg/kg, ip injectie). Dit zorgt ervoor dat de muis onder een verdoving staat gedurende 30-60 minuten. Plaatselijke verdoving (0,5% proparacaine HCl) wordt toegepast op het hoornvlies. Na 5 min, fix een oog onder een dissectie microscoop.
- Een zeer zachte snede is gemaakt in het midden van het hoornvlies 1,2 -1,4 mm van de corneale limbus (zoals geïllustreerd in figuur 1) met een von Graefe cataract mes. Wees uiterst voorzichtig te snijden door het hoornvlies.
- Een pocket is gemaakt onder het epitheel laagje van het hoornvlies door horizontaal plaatsen van het mes in het midden van het hoornvlies en de uitbreiding van het mes in de richting van de limbus voorzichtig (Fig.1). De grootte van de zak moet groot genoeg zijn om een angiogene factor-bevattende pellet tegemoet te komen. Wees uiterst voorzichtig niet te doorboren door de cornea.
- Plaats een pellet met een pincet in de zak langzaam. Probeer de pellet zo plat mogelijk maken.
- Na implantatie van de pellet, is een oogdruppel antibiotische zalf toegepast op het oog. Instrumenten worden afgeveegd met 70% alcohol pads tussen de dieren.
- Beweeg de muis naar een warme en droge gebied en bewaken, totdat het in staat is om een rechte houding vervolgens te behouden en terug te sturen naar haar kooi. Systemische analgetica (bijv. buprenorfine, 2 mg / kg, ip injectie) en actueel antibiotische zalf (bijv. gentamicine) worden twee keer per dag gegeven gedurende 2 dagen na de operatie en de muis is nauwlettend gevolgd gedurende 3 dagen. Genezing zal naar verwachting volledig binnen de eerste 48 uur na de operatie. Het oog met de pocket zal worden onderzocht onder een spleetlamp biomicro ruimte tussen de 40-10 dagen na de pellet implantatie.
3. Representatieve resultaten
- Zeven dagen na de pellet implantatie, de muis is verdoofd systemisch en topicaal zoals beschreven in 2.1.
- Let op de bloedvaten in het hoornvlies veroorzaakt door de angiogene factor die een dissectie microscoop. In het hoornvlies worden behandeld met het voertuig, kan er geen groei van bloedvaten worden waargenomen (Fig. 2A, voertuig-behandelde hoornvlies). In het hoornvlies behandeld met bFGF, kan robuuste angiogenese te zien (Fig. 2B). De groei van bloedvaten kan worden beoordeeld aan de hand van de maximale lengte van de bloedvaten (van de normale limbale schepen naar de top van de nieuwe schepen), en de totale bloedvat gebieden (Fig. 2B, afgebakend met een rode stippellijn in de bFGF hoornvlies behandeld). Andere kwantificeringsmethoden zijn ook beschreven 2,5.
Figuur 1. Een. Normale hoornvlies met H & E kleuring. Geen bloedvat bestaat in een normale hoornvlies. B. Maak een zak onder het epitheel laagje van het hoornvlies. C. Voeg een pellet in de zak. D. Het angiogene factor is vrijgelaten uit de korrel, en de nieuwe bloedvaten groeien van de normale limbale schepen.
Figuur 2. Vertegenwoordiger resultaat vijf dagen na implantage van de pellet. A. Hoornvlies met een pellet met de auto alleen. Geen vorming van nieuwe bloedvaten in het hoornvlies. Alleen de reeds bestaande normale limbale schepen zijn zichtbaar. B. Hoornvlies met een pellet met bFGF. Robuuste nieuwe bloedvaten (dot-lined) steeg van de reeds bestaande normale limbale schepen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De muis hoornvlies pocket test model werd voor het eerst beschreven in 1979 door Muthukkaruppan VR en Auerbach R 6. Gedetailleerde protocollen zijn gepubliceerd door de verschillende laboratoria 2,3,7,8. Ons laboratorium heeft gewijzigd en gebruikt deze methode in ons onderzoek al vele jaren 4. De muis hoornvlies pocket-test is een relatief eenvoudig model met grote reproduceerbaarheid. Een ander voordeel van dit model is dat sinds het hoornvlies normaal ontbreekt bloedvaten, is er minimale hoeveelheid van de achtergrond in deze test. Daarom wordt dit model veel gebruikt door het veld om de angiogene effect van verschillende factoren en moleculen te bestuderen. Vergeleken met de ogen van een aantal grotere dieren, zoals ratten en konijnen, de muis ogen zijn kleiner en moeilijk te hanteren. Speciale aandacht is daarom vereist bij het uitvoeren van dit model, vooral tijdens de processen van het maken van de pocket in het hoornvlies en het plaatsen van de pellet. Het mes moet worden behandeld in een nauwkeurig gecontroleerde manier, zodat het niet zal doorboren het hoornvlies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Ons onderzoek wordt ondersteund door de Intramurale Research Program van de NIH, National Eye Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Von Graefe cataract knife (1.5x25mm blade, flat) | Ambler Surgical | 3401E | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Slit lamp | Carl Zeiss, Inc. | 30 SL-M | |
| Table 1. Equipments | |||
| bFGF (basic fibroblast growth factor) | PeproTech Inc | 100-18B | |
| Sucralfate (Sucrose octasulfate—aluminum complex) | Sigma-Aldrich | S0652 | 10% in PBS |
| poly-HEMA (Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)) | Sigma-Aldrich | P3932 | 12% in Ethanol |
| Table 2. Reagents and materials | |||
References
- Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor. The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nature. 2, 2545-2550 (2007).
- Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs. Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).
- Zhang, F. VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).
- Tong, S., Yuan, F. Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations. Microvascular research. 75, 10-15 (2008).
- Muthukkaruppan, V., Auerbach, R.
- Ziche, M.
- Ziche, M., Morbidelli, L.
