Summary
Die Hornhaut ist einzigartig, es fehlt Gefäßgewebe. Allerdings kann robuste Wachstum der Blutgefäße und das Überleben in der Hornhaut durch potente angiogenen Faktoren ausgelöst werden. Daher kann die Hornhaut mit uns ein wertvolles Instrument für die angiogenen Studien. Dieses Protokoll zeigt, wie die Maus-Modell der Hornhaut Tasche Test und wie die Angiogenese durch angiogene Faktoren mit diesem Modell induziert Beurteilung durchzuführen.
Abstract
Eine normale Hornhaut ist klar, der vaskulären Gewebe. Allerdings kann die Blutgefäße induziert, zu wachsen und in der Hornhaut, wenn potente angiogene Faktoren 1 verabreicht werden überleben. Diese Einzigartigkeit hat die Hornhaut Tasche Assay eine der am häufigsten verwendeten Modelle zur Angiogenese-Studien. Die Hornhaut komponiert mehrere Schichten von Zellen. Es ist daher möglich, ein Pellet mit der angiogenen Faktor des Interesses an der Hornhaut, um seine angiogene Wirkung 2,3 untersuchen einbinden. Hier bieten wir Ihnen eine Schritt für Schritt Demonstration, wie man (I) produzieren die angiogenen Faktor-haltige Pellet (II) betten die Pellets in die Hornhaut (III) eine Analyse der Angiogenese durch den angiogenen Faktor von Interesse induziert. Da die basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) als einer der stärksten angiogenen Faktoren 4 bekannt ist, ist es hier, die Angiogenese in der Hornhaut zu induzieren.
Protocol
Alle Geräte und Reagenzien sind steril. Das Protokoll wurde von der Animal Care genehmigt und Verwenden Committee (ACUC) an der NEI / NIH (Tier Studienprotokoll NEI-553), und wurde nach den NIH-Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.
1. Die Herstellung der angiogenen Faktor-haltigen Pellets
In diesem Teil werden die Pellets mit dem angiogenen Faktor des Interesses vorbereitet.
- Machen Sie 10% (w / v) Sucralfat Lösung mit PBS. Shop unter Raumtemperatur.
- Machen Sie 12% (w / v) Poly-HEMA mit absolutem Ethanol. Shop unter Raumtemperatur.
- Machen Sie 1 ug / ul bFGF-Lösung. Shop in -80 ° C.
- Um machen 50 Pellets, mix 5 ul der Poly-HEMA, 1μl von Sucralfat und 4 ul bFGF Stammlösung, gründlich vortexen.
- Legen Sie ein Stück sauberer Parafilm in einer Petri-Schale, setzen Sie es unter UV-Licht für 15 min in einer Gewebekultur Kapuze. Drop 0,2 ul der Lösung Mischung auf dem Parafilm für ein Pellet. So sollten 10 ul der Lösung Mischung Ausbeute 50 Pellets. Lassen Sie die Pellets trocken und bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden. Die getrockneten Pellets können in 4 ° C mehrere Tage oder -80 ° C für mehrere Monate gelagert werden.
- Nach Gebrauch, hebeln und holen die Pellets mit den Spitzen einer Pinzette. Seien Sie besonders vorsichtig, sie nicht zu brechen oder machen sie Frühjahr entfernt.
2. Durchführen der Maus Hornhaut Tasche Test
In diesem Teil werden wir demonstrieren, wie man eine Tasche in der Maus Hornhaut zu machen, und wie man ein Pellet in die Tasche legen. Die angiogenen Faktor im Pellet wird nach und nach in die Umgebung der Hornhaut (Abb. 1) freigesetzt werden. In dieser Demonstration verwenden wir 8-wöchigen weiblichen C57/BL6-Mäusen.
- Die Maus ist sehr systematisch betäubt mit der Mischung aus Ketamin (75 mg / kg) und Xylazin (5mg/kg, ip-Injektion). Dies wird mit der Maus unter Narkose Zustand zu halten für 30-60 min. Lokalanästhetikum (0,5% Proparacain HCl) ist die Hornhaut aufgetragen. Nach 5 min, fix ein Auge unter einem Binokular.
- Eine sehr sanfte Schnitt ist in der Mitte der Hornhaut 1,2 -1,4 mm vom Limbus corneae (wie in Abbildung 1 dargestellt) mit einem von Graefe Staarmesser gemacht. Seien Sie besonders vorsichtig, um nicht durch die Hornhaut geschnitten.
- Eine Tasche ist unter dem Epithel der Hornhaut durch horizontal Einsetzen des Messers in die Mitte der Hornhaut und zur Verlängerung der Messer gegen den Limbus sorgfältig (Abb. 1) hergestellt. Die Größe der Tasche hat, um groß genug sein, zu einer angiogenen Faktor-haltigen Pellets unterzubringen. Seien Sie äußerst vorsichtig, um die Punktion durch die Hornhaut.
- Legen Sie eine Tablette mit einer Pinzette in die Tasche langsam. Versuchen Sie, das Pellet so flach wie möglich zu machen.
- Nach der Implantation des Pellets, ist eine topische ophthalmologische antibiotische Salbe auf das Auge angewendet. Die Geräte sind mit 70% Alkohol-Pads zwischen Tieren vernichtet.
- Bewegen Sie die Maus an einen warmen und trockenen Ort und überwachen sie, bis sie in der Lage, eine aufrechte Haltung zu bewahren und dann wieder in seine Heimat Käfig ist. Systemische Analgetika (z. B. Buprenorphin, 2 mg / kg, ip-Injektion) und topische Antibiotika-Salbe (zB Gentamicin) werden zweimal täglich für 2 Tage nach der Operation gegeben und die Maus ist eng für 3 Tage überwacht. Healing wird voraussichtlich innerhalb der ersten 48 Stunden nach der Operation abgeschlossen ist. Das Auge mit der Tasche unter einer Spaltlampe BioMicro Umfang zwischen den Tagen 4-10 nach Pellet-Implantation untersucht werden.
3. Repräsentative Ergebnisse
- Sieben Tage nach der Pellet-Implantation, wird die Maus narkotisiert systemisch und topisch, wie in 2.1 beschrieben.
- Beachten Sie die Blutgefäße in der Hornhaut von der angiogenen Faktor unter einem Binokular induziert. In der Hornhaut mit Vehikel behandelt, kann kein Wachstum von Blutgefäßen beobachtet (Abb. 2A, Vehikel-behandelten Hornhaut) werden. In der Hornhaut mit bFGF behandelt wird, kann robust Angiogenese beobachtet (Abb. 2B). Das Wachstum von Blutgefäßen, kann unter Verwendung der maximalen Länge der Blutgefäße (von der normalen Limbus Schiffe an die Spitze der neuen Schiffe), und die gesamte Blutgefäß Bereiche (Abb. 2B, abgegrenzt mit einem roten gestrichelten Linie in der bFGF werden Hornhaut)-behandelt. Andere Quantifizierungsmethoden wurden ebenfalls 2,5 beschrieben.
Abbildung 1. A. Normale Hornhaut mit H & E Färbung. Kein Blutgefäß besteht in einer normalen Hornhaut. B. Machen Sie eine Tasche unter dem Epithel der Hornhaut. C. Embed ein Pellet in die Tasche. D. Die angiogenen Faktor ist aus dem Pellet freigesetzt und neue Blutgefäße wachsen von der normalen Limbus Schiffe.
Abbildung 2. Repräsentatives Ergebnis fünf Tage nach imPlantage des Pellets. A. Cornea mit einem Pellet das Fahrzeug nur. Keine Bildung neuer Blutgefässe in der Hornhaut. Nur die bereits vorhandenen normalen Limbus Schiffe zu sehen sind. B. Cornea mit einem Pellet bFGF. Robust neuer Blutgefäße (dot gesäumten) wuchs von den bereits bestehenden normalen Limbus Schiffe.
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Discussion
Die Maus Hornhaut Tasche Test-Modell wurde erstmals 1979 von Muthukkaruppan VR und Auerbach R 6 beschrieben. Detaillierte Protokolle wurden von verschiedenen Labors 2,3,7,8 veröffentlicht worden. Unser Labor hat modifiziert und verwendet diese Methode in unsere Studien seit vielen Jahren 4. Die Maus Hornhaut pocket-Assay ist ein relativ einfaches Modell mit großer Reproduzierbarkeit. Ein weiterer Vorteil dieses Modells ist, dass da die Hornhaut in der Regel fehlt Blutgefäße, gibt es minimale Hintergrund in diesem Test. Daher ist dieses Modell allgemein durch das Feld der angiogenen Wirkung von verschiedenen Faktoren und Moleküle Studie verwendet. Verglichen mit den Augen einiger größerer Tiere wie Ratten und Kaninchen, die Maus Augen kleiner und schwieriger zu handhaben. Besondere Vorsicht ist daher erforderlich, bei der Durchführung dieses Modell, vor allem während der Prozesse der Herstellung der Tasche in die Hornhaut und das Einsetzen der Pellets. Das Messer muss in einer genau kontrollierten Art und Weise behandelt werden, so dass es keine Löcher in die Hornhaut.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Unsere Forschung wird durch die Interne Research Program des NIH, National Eye Institute unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| Von Graefe cataract knife (1.5x25mm blade, flat) | Ambler Surgical | 3401E | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| Slit lamp | Carl Zeiss, Inc. | 30 SL-M | |
| Table 1. Equipments | |||
| bFGF (basic fibroblast growth factor) | PeproTech Inc | 100-18B | |
| Sucralfate (Sucrose octasulfate—aluminum complex) | Sigma-Aldrich | S0652 | 10% in PBS |
| poly-HEMA (Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)) | Sigma-Aldrich | P3932 | 12% in Ethanol |
| Table 2. Reagents and materials | |||
References
- Cao, Y., Linden, P., Shima, D., Browne, F., Folkman, J. In vivo angiogenic activity and hypoxia induction of heterodimers of placenta growth factor/vascular endothelial growth factor. The Journal of clinical investigation. 98, 2507-2511 (1996).
- Rogers, M. S., Birsner, A. E., D'Amato, R. J. The mouse cornea micropocket angiogenesis assay. Nature. 2, 2545-2550 (2007).
- Poche, R. A., Saik, J. E., West, J. L., Dickinson, M. E. The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs. Cold Spring Harbor protocols. , 5416-54 (2010).
- Zhang, F. VEGF-B is dispensable for blood vessel growth but critical for their survival, and VEGF-B targeting inhibits pathological angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 106-6152 (2009).
- Tong, S., Yuan, F. Dose response of angiogenesis to basic fibroblast growth factor in rat corneal pocket assay: I. Experimental characterizations. Microvascular research. 75, 10-15 (2008).
- Muthukkaruppan, V., Auerbach, R.
- Ziche, M.
- Ziche, M., Morbidelli, L.
