Summary
Чувствительности к антимикробным препаратам микобактерий туберкулеза является сложным, но решающее значение для лечения пациентов. Этот формат планшет предлагает тестирование 12 антимикобактериальными наркотиков и обеспечивает минимальные концентрации тормозных (MIC) ценности, которые помогут в соответствующее лечение.
Abstract
Быстрого выявления устойчивости к противомикробным препаратам играет важную роль в усилиях по борьбе с увеличением числа резистентных микобактерий туберкулеза (МТБ). Чувствительности к антимикробным препаратам (АСТ) МТБ традиционно выполняемых агар методом доли или macrobroth тестирование на такой инструмент, как BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Диагностика, Кливленд, Огайо) или BACT / ALERT (bioMérieux, Хазелвуд, МО). Метод агар долю, в то время считается «золотым» стандартом АСТ, является трудоемким и требует расчета сопротивления, выполняя колонии рассчитывает на наркосодержащих агара по сравнению с свободной от наркотиков агара. Если есть ≥ 1% роста на наркосодержащих среду по сравнению со свободной от наркотиков среды, организма, считается, что устойчивые к препарату. Macrobroth методы требуют аппаратура и испытательное точки останова ("критический") концентрации препарата на препараты первого ряда (изониазид, этамбутол, рифампицин и пиразинамид). Метод, описанный здесь, является коммерчески доступным в 96 формате планшет [MYCOTB (TREK Diagnostics)] и содержит возрастающих концентрациях 12 противомикробные препараты используются для лечения туберкулеза, в том числе и первый (изониазид, рифампицин, этамбутол) и препаратов второго ряда (амикацин, циклосерин, этионамид, канамицин, моксифлоксацин, офлоксацин, пара-аминосалициловой кислоты, рифабутин, и стрептомицин). Пиразинамид, первый препарат линию, не входит в планшет из-за его необходимость кислых условиях испытаний. Преимущества микротитровальных системы включают в себя как простота настройки и быстрее поворачиваться времени (14 дней) по сравнению с традиционными доля агар (21 дней). Кроме того, пластина может быть установлена в пределах от посевной подготовлено с использованием либо бульона или твердой среде. Так как формат планшет является новым и так МТБ представляет уникальные вызовы безопасности в лаборатории, этот протокол будет описывать, как безопасно установки, инкубировать и читать планшет.
Protocol
Каждая лаборатория должна выполнить оценку рисков в сотрудничестве с их институционального Биологические сотрудник по технике безопасности, чтобы определить необходимый уровень биобезопасности для подготовки посевного и Пипетирование посевной в пластину. В нашей лаборатории мы используем уровня биобезопасности 3 лаборатории (BSL3) практики до микротитровальных пластин прививку, и печатью с пластиковыми печать клея. Эти пластины затем помещаются в пластиковый мешок, который тепло-и запечатлел. Инкубация и интерпретации чтение планшет проводится в 2 уровня биобезопасности лаборатории (BSL2).
1. Маркировка материалов
- Этикетка пластины кровяной агар, три Миддлбрука 7H10 пластин, Миддлбрука 7H9 бульон, солевой между стеклянными шариками трубки и планшет АСТ с соответствующими идентификаторами (например, имя пациента, медицинской номер записи) в BSL2.
- Этикетка кровяной агар и 7H10 покрытием, как "чистота проверять". Периодические рассчитывает колонии посевной рекомендуется обеспечить, чтобы соответствующие концентрации организмов, используемых в тесте. Колония насчитывает когда выполняется необходимо иметь два 7H10 пластины помечены "1 / 1 количество колоний" и "1 / 50 количество колоний".
2. Технолог подготовка идти в BSL3
- Соответствующие средства индивидуальной защиты необходимо работать в BSL3 и включает в себя твердые фронта платье, головных уборов, перчаток, бахилы, и респиратор. Каждое учреждение должно иметь собственный план защиты органов дыхания в сотрудничестве с промышленной гигиены их учреждения. В нашей лаборатории, у нас есть несколько респираторы доступны, в том числе питание воздух респираторы (PAPRs) и оснащены HEPA-фильтром, N95 на пол лица респираторы.
3. Подготовка биологических кабинета безопасности
- В BSL3, готовить биологический кабинет безопасности (BSC) путем дезинфекции поверхностей и размещения бумажным полотенцем пропитанный дезинфицирующим примерно 6 дюймов от панели вентиляционное отверстие.
- Место контейнер для отходов на левой стороне, и малых и nephlometer vortexer справа.
- Прививании петли, pipetors и советы Рядом с бумажным полотенцем.
- Место стойка с организма (в бульоне или на твердой среде) и 0,5 McFarland стандартным бумажным полотенцем.
4. Калибровка нефелометра
- Место солевой стеклянные бусины между трубкой в нефелометра и набор инструментов нулем, используя солевой пустой подростка.
- Место McFarland 0,5 стандарт в нефелометра и калибровать согласно инструкции производителя.
5. Подготовка посевной
- Работа в BSC, скрести колоний от твердой среде, используя стерильный цикла в соответствующей маркировкой солевой между стеклянной трубкой шарик до ≥ 0,5 McFarland Стандартный получается.
- Осмотрите образца, а по сравнению с McFarland стандарта.
- Vortex образец в течение 30-60 секунд.
- Разрешить посевной урегулировать в течение 15 минут (устанавливается таймер).
6. Прививка планшет
- Отрегулируйте посевной физиологическим раствором бульона между использованием нефелометра откалиброван для McFarland 0,5 с шагом 4,1 и 4,2. Это должно быть завершено в течение 30 минут (согласно спецификациям производителя).
- Используйте 200 мкл pipetter и LONG аэрозоля устойчивы кончика пипетки, чтобы удалить 100 мкл посевного из TOP-й 1 / 3 от солевых трубки шарик подростка. Привить Отвар Миддлбрука 7H9. Медленно вихрь прививку 7H9 бульона в течение 20 секунд.
- Удалите пластину АСТ микротитровальных из пакета производителя. Не используйте, если осушитель синего или если фольга упаковка повреждена.
- Подготовка 1:50 разведение трубки для дальнейшего использования в подготовке 1:50 разбавления с помощью пипетки 50 мкл стерильной воды в стерильную пробирку.
- Аккуратно влить бульон 7H9 посевной в корыто. Избегайте образования аэрозоли.
- Место пластины АСТ микротитровальных с этикеткой к себе.
- Использование 12-канальный pipetter добавить 100 мкл посевного в каждую лунку.
- Подготовка разведений для колонии имеет значение:
- 1 / 1 разбавлением готовят из положительного контроля и (Н12) с полос 1 мкл петлю на 7H10 пластина с надписью "1 / 1".
- 1 / 50 разведения готовят путем посева 1 мкл петлю из положительного контроля и (Н12) и закрученной его в трубу с 50 мкл воды труба подготовлена выше. Подряд 1 мкл этого разведения, пластины с надписью "1 / 50".
- Привить чистоты плит из корыта с помощью пипетки на 50 мкл соответствующей маркировкой кровяной агар и 7H10 пластины и полосы для изоляции.
- МестоКлей печать на планшет АСТ. Сильно надавите на каждую лунку на обеспечение надлежащего уплотнения с помощью белой задней печатью. Избегайте складок.
- Лечить планшет, протерев его с бумажным полотенцем пропитанный дезинфицирующим уничтожающий микробактерии туберкулеза и пластины место микротитровальных в полиэтиленовый пакет и закрыть с печатью тепла или ленты.
- Пластиковый пакет служит в качестве вторичного контейнер, чтобы все бульоном содержится должны ли быть утечка или разлив первичного пластины.
7. Дезинфекция материалов и биологических кабинета безопасности
- Чтобы избежать производстве аэрозолей, месте другого корыта на вершине прививку корыто перед установкой его мягко в отбросить контейнер.
- Лечить все материалы, включая nephlometer, vortexer, пластин, труб и т.д., протирая вниз, уничтожающий микробактерии туберкулеза дезинфицирующее и ждать подходящий момент, чтобы обеспечить дезинфекцию в соответствии с инструкциями производителя, прежде чем снимать с BSC. Например, Prospray, уничтожающий микробактерии туберкулеза дезинфицирующим мы используем, требуется 15 минут, чтобы убить микобактерии.
- Место отбросить контейнер для биологически опасных сумку и печатью до автоклавирования.
8. Инкубация
- Плиты должны быть инкубировали со средствами массовой информации вниз и следует проявлять осторожность, чтобы избежать разлива или брызги любой жидкости.
- Инкубируйте планшет АСТ планшет, 7H10 и плиты кровяной агар в 35-37 ° С инкубатор с 5-10% СО 2 с 5-10% СО 2 в лаборатории BSL2.
- В нашей лаборатории, это приемлемо, поскольку пластина плотно закрытых, так и внутри герметичный полиэтиленовый пакет.
- Не более 2 микротитровальных АСТ плиты должны быть уложены в инкубатор в соответствии с инструкциями производителя.
9. Представитель результаты
Интерпретация результатов:Герметичный АСТ микротитровальных пластин можно прочитать вручную с помощью зеркала, так как помощь или с автоматизированной читателя пластины, таких как Vizion (TREK Diagnostics). Пластины могут быть рассмотрены, как только через 7 дней после прививки. Изучить контроля роста скважин в позиции Н11 и Н12, чтобы определить, если они положительны (то есть, имеют хранение клеток на дне колодца). Если скважин контроля роста не являются положительными, reincubate пластины и пересмотреть периодически (например, день 10, день 14) до скважин контроля роста положительны.
- Зеркало читать:
- Место запечатанном АСТ планшет на платформе;
- Прочитано скважин контроля роста после 7 дней инкубации, если это отрицательно, reincubate АСТ планшет;
- Если рост управления являются приемлемыми, то читайте наркосодержащих скважин. Для каждого препарата, запись первого разведения, которая не имеет рост по сравнению наркотиков скважин с ростом контроля.
- Рост выглядит как мутность или сдаче на хранение клеток на дне колодца.
- Инструмент Прочитано: следуйте инструкциям производителя, инструкции ниже пример того, как чтение будет сделано с Vizion платформы:
- Войти в систему
- Используйте "MYCOTB" АСТ пластины программного обеспечения.
- Место запечатанном пластины с штрих-кодом, стоящих перед пользователем. Рост выглядит как мутность или сдаче на хранение клеток на дне колодца.
- Прочитано роста контроля; если это отрицательно, reincubate АСТ планшет, если читать положительные пластины, прикоснувшись к экрану с первой скважины каждого препарата, который не показывает роста.
Прочитано чистоты плит. Пластины кровяной агар должен показать отсутствие роста после 48 часов и 7H10 пластины чистоты должны иметь сплошной рост одного организма типа. Если загрязнена, тест АСТ микротитровальных надо будет повторить с чистой культуре.
Рассчитать колония насчитывает от положительного контроля и используя приведенную ниже таблицу:
Основные колонии графа
| # Колоний рассчитывали на пластину с надписью "1 / 1" | # Колоний рассчитывали на пластину с надписью "1 / 50" | Инокулята Колония Count (КОЕ / мл) |
| <50 | 0 | <5 • 10 4 |
| 50-100 | 0-2 | 5 * 10 4 до 1 X 10 5 |
| > 100 | ≤ 10 | 1 X 10 5 до 5 * 10 5 |
| > 100 | > 10 | > 5 х 10 5 |
Там может быть задний с пара-аминосалициловой кислоты в некоторые штаммы Mycobacterium туберкулезSiS. Это может быть интерпретировано, глядя на всех скважинах, которые окатышей и использовании первой скважины, что имеет тот же размер гранул в качестве следующего разведения как конечную точку. Сопротивление редко с этим препаратом.
Рисунок 1. Представитель результаты, используя MYCOTB пластины.
| Наркотиками аббревиатура | Наркотик | MIC μ / мл |
| ВЛ | офлоксацин | 16 |
| MXF | моксифлоксацин | 8 |
| РИФ | рифампицин | > 16 |
| AMI | амикацин | 0,5 |
| STR | стрептомицин | 16 |
| РФБ | рифабутин | 8 |
| PAS | парааминосалициловая кислота | ≤ 0,5 |
| ETH | этионамид | 5 |
| CYC | циклосерин | 4 |
| INH | изониазид | 2 |
| KAN | канамицин | 1,2 |
| EMB | этамбутол | 4,0 |
Discussion
Примером пластины АСТ микротитровальных, что имеет положительное контролирует рост показан на рисунке 1 и конечной точки MIC (мкг / мл) для каждого лекарства окружен. Исследование, проведенное в нашей лаборатории показали, что пластины АСТ микротитровальных метод эквивалентен золотым стандартом метод доля агар для определения чувствительности микобактерий туберкулеза. Быстрее представление результатов был получен с планшет АСТ микротитровальных по сравнению с традиционным методом доля агар с окончательной интерпретации АСТ планшет и метод агар долю на уровне 14 и 21 дней, respectively.The АСТ планшет имеет преимущество тестирования первого и препаратов второго ряда одновременно, что может помочь предотвратить чрезмерные задержки с резистентными штаммами. Пластины АСТ микротитровальных и намного проще в настройке и читать, чем APM и оба ручной зеркало и полуавтоматические системы, такие как Vizion может быть использован для чтения пластин. Наличие микрофона значение ТБ тестирования лекарственной устойчивости может дать новую ценную информацию для врачей по отношению к традиционным критического значения концентрации, особенно для тех, кто изолирует с "пограничными" восприимчивости.
Disclosures
Существует ничего разглашать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить лабораторию технологов клиники Майо микобактериологию лаборатории за помощь во время исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AST microtiter plates and adhesive seal | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | MYCOTB | |
| McFarland 0.5 standard | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | E1041 | |
| Middlebrook 7H10 plates | Fisher Scientific | ||
| Blood Agar Plates | Fisher Scientific | ||
| Sterile loops 1 μL | Fisher Scientific | ||
| Sterile loops 10 μL | Fisher Scientific | ||
| Sensititre Saline-Tween glass bead broth | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | 27143 | |
| 7H9 OADC Broth | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | T3440 | |
| Long Pipet Tips | Fisher Scientific | ||
| Sterile Troughs | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | ||
| M. tuberculosis | ATCC | 27294 | |
| Pipeters: 1000, 200, 20μL | Fisher Scientific | ||
| Tips 1000, 20, 20 μL | Fisher Scientific | ||
| Multichannel Pipetter | Fisher Scientific | ||
| Incubator 5-10% CO2 | Fisher Scientific | ||
| Plastic bags, small, CO2 permeable | Poly Plastic Products | ||
| TB disinfectant (Such as ProSpray C-60) | Certol International, Commerce City, CO | PSC60/32 | |
| Mirror Box Reader | Fisher Scientific |
References
- Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., Parrish, N. Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs. Presented at 50th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010 Sept. 12, Boston, MA, , Abstract 2450 (2010).
- HHS Publication No. (CDC) 21-112: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). U.S. Department of Health and Human Services Centers for Disease and Preventions. , 5th Edition, National Institutes of Health. (2009).
- Morcillo, N., Imperiale, B., Digiulio, B. Evaluation of MGIT 960 and the colorimetric-based method for tuberculosis drug susceptibility testing. Int J Tuberc Lung Dis. 14, 1169-1175 (2010).
- Bemer, P., Bodmer, T., Munzinger, J., Perrin, M., Vincent, V., Drugeon, H. Multicenter Evaluation of the MB/BACT System for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 42, 1030-1034 (2004).
- SENSITITRE MYCOTB Susceptibility Plate: For Mycobacterium Susceptibility Testing. Product Insert. , TREK Diagnostic Systems. Cleveland, OH. (2010).
- CLSI. Susceptiblity Testing of Mycobacteria, Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard. Document M24-A. , CLSI. Wayne, Pennsylvania. (2003).
- Sullivan, N., Sotos, J., Anhalt, K., Allen, S. Preliminary results from a new TREK Sensititre Mycobacterium tuberculosis MIC plate (MYCOTB). C-151 presented at 110th American Society for Microbiology, Annual Meeting, San Diego, CA, , Abstract C-151 (2010).
- VersaTREK MYCO SUSCEPTIBLITY KIT. Product insert. , TREK Diagnostic Systems. Cleveland, OH. 7115-7160 (2008).
- Parrish, N. M., Carroll, K. C. The Role of the Clinical Mycobacteriology Laboratory in the Diagnosis and Management of Tuberculosis in Low Prevalance Settings. J Clin Microbiol. , Forthcoming (2010).
- Kam, K. M., Sloutsky, A., Yip, C. W., Bulled, N., Zingol, M., Espinal, M., Kim, S. J. Determination of critical concentrations of second-line anti-tuberculosis drugs with clinical and microbiological relevance. Int J Tubercl Lung Dis. 14, 282-288 (2010).
- Woods, G. L., Warren, N. G., Inderlied, C. B. Susceptibility Test Methods: Mycobacteria, Nocardia, and Other Actinomycetes. Manual of Clinical Microbiology. Murray, P. R., Barron, E. J., Jorgensen, J. H., Landry, M. L., Pfaller, M. A. , 9th Ed, ASM Press. Washington DC. 1223-1247 (2007).
- Bergmann, J. S., Woods, G. L. Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs. J Clin Microbiol. 36, 2940-2943 (1998).
