רגישות בדיקת Antimicrobial של קומפלקס שחפת Mycobacterium עבור תרופות הקו הראשון והשני על ידי דילול מרק בפורמט פלייט microtiter

Summary

בדיקות רגישות Antimicrobial של Mycobacterium tuberculosis מאתגרת אך קריטי עבור הטיפול בחולה. מתכונת זו צלחת microtiter מציע בדיקה של 12 תרופות antimycobacterial ומספק ריכוז מעכבות המינימלי (MIC) ערכים, אשר יסייע הטיפול המתאים.

Abstract

איתור מהיר של עמידות מיקרוביאלית חשוב במאמץ לשלוט על הגידול עמידים Mycobacterium tuberculosis (MTB). בדיקות רגישות Antimicrobial (AST) של MTB באופן מסורתי בוצעו בשיטה אגר פרופורציה או על ידי בדיקות macrobroth על מכשיר כמו BACTEC (בקטון דיקינסון, ניצוצות, MD), VersaTREK (TREK אבחון, קליבלנד, OH) או BacT / התראה (bioMérieux, הייזלווד, MO). שיטת שיעור אגר, בעוד נחשב סטנדרטי "זהב" של AST, הוא עבודה אינטנסיבית ודורשת חישוב התנגדות על ידי ביצוע ספירת המושבה על אגר סמים המכילים לעומת אגר נקי מסמים. אם יש ≥ צמיחה של 1% על מדיום המכיל את התרופה לעומת בינוני התרופה ללא תשלום, האורגניזם נחשב עמידות לתרופה זו. שיטות macrobroth דורשות מכשור לשבור נקודת מבחן ("קריטי") ריכוזי התרופה עבור תרופות הקו הראשון (isoniazid, ethambutol, rifampin ו pyrazinamide). השיטה המתוארת כאן זמין מסחרית בתבנית 96 microtiter גם צלחת [MYCOTB (TREK באבחון)] והוא מכיל ריכוז גדל והולך של 12 antimicrobials משמש לטיפול בשחפת כולל שני הראשונים (isoniazid, rifampin, ethambutol) תרופות הקו השני (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic חומצה, rifabutin, וסטרפטומיצין). Pyrazinamide, תרופה השורה הראשונה, לא נכלל הצלחת microtiter בשל הצורך שלה התנאים מבחן חומצי. היתרונות של מערכת microtiter לכלול הן קלות להגדיר להפוך מהר יותר סביב זמן (14 ימים), לעומת שיעור אגר המסורתיים (21 ימים). בנוסף, הצלחת ניתן להגדיר מ inoculum מוכן שימוש או מרק או בינוני מוצק. מאז הפורמט צלחת microtiter הוא חדש מאז MTB מציב אתגרים ייחודיים בטיחות במעבדה, פרוטוקול זה יתאר כיצד בבטחה ההתקנה, דגירה ולקרוא את הצלחת microtiter.

Protocol

כל מעבדה זקוקה כדי לבצע הערכת סיכונים תוך שיתוף פעולה עם קצין בטיחות ביולוגית המוסדיים שלהם כדי לקבוע את הרמה המתאימה biosafety להכנת inoculum ועל pipetting של inoculum לתוך הצלחת. במעבדה שלנו, אנו מנצלים רמת biosafety 3 מעבדה (BSL3) נוהלי עד צלחות microtiter הם מחוסן, וחתום בחותמת דבק פלסטי. הצלחות אלה ממוקמות ואז בתוך שקית ניילון, אשר חתום גם חום. דגירה ופרשנות קריאה הצלחת microtiter מתנהל 2 רמת biosafety מעבדה (BSL2).

1. תיוג של חומרים

1. לייבל דם צלחת אגר, שלושה מידלברוק 7H10 צלחות, מידלברוק 7H9 מרק, מלח tween שפופרת זכוכית חרוז וצלחת AST microtiter עם מזהים המתאים (למשל, שם החולה, מספר רשומה רפואית) ב BSL2.
2. תווית אגר דם 7H10 מצופה כמו "לבדוק את טוהר". ספירות תקופתיות של המושבה inoculum מומלץ לוודא כי ריכוז מתאים של אורגניזמים משמש הבדיקה. ספירת המושבה לבצע כאשר צריך לעבור שתי צלחות 7H10 שכותרתו עם "לספור 1 / 1 המושבה" ו "לספור 1 / 50 המושבה".

2. טכנולוג ההכנות להיכנס BSL3

1. ציוד מגן אישי מתאים יש צורך לעבוד BSL3 וכולל מוצק מול חלוק, כיסוי ראש, כפפות, כיסויי נעליים, ומכשיר הנשמה. כל מוסד צריך להקים תוכנית להגנה על דרכי הנשימה שלהם בשיתוף פעולה עם קצין היגיינה תעשייתי במוסד שלהם. במעבדה שלנו, יש לנו כמה הנשמה זמין, כולל מופעל טיהור הנשמה אוויר (PAPRs) והתאים-HEPA מסונן, חצי פנים מסכת N95.

3. הכנת הארון בטיחות ביולוגית

1. ב BSL3, להכין את ארון הבטיחות הביולוגית (BSC) על ידי חיטוי את פני השטח הנחת מגבת נייר ספוגה כ 6 אינץ' חיטוי מהלוח פתח האוורור.
2. הנח מיכל פסולת בצד שמאל, ו nephlometer vortexer קטן בצד ימין.
3. לולאות inoculating, pipetors וטיפים ממוקמים ליד מגבת נייר.
4. המקום מתלה עם האורגניזם (במרק או בינוני מוצק) ורמת 0.5 מק 'פרלנד על מגבת נייר.

4. כיול nephelometer

1. מניחים שפופרת זכוכית מלוחים tween חרוז nephelometer ולהגדיר את המכשיר לאפס באמצעות ריק מלוחים tween.
2. מניחים את תקן 0.5 מק 'פרלנד ב nephelometer ו לכייל בהתאם להוראות היצרן.

5. הכנת Inoculum

1. עבודה, מושבות BSC לגרד ממדיום מוצק באמצעות לולאה סטרילי לתוך שכותרתו כראוי מלוחים צינור tween חרוז זכוכית עד ≥ 0.5 מק 'פרלנד רגיל מתקבל.
2. ראייה לבדוק את המדגם, ולהשוות את תקן מק 'פרלנד.
3. וורטקס מדגם עבור 30-60 שניות.
4. אפשר inoculum להתיישב במשך 15 דקות (הגדרת טיימר).

6. הרכבה של הצלחת microtiter

1. התאם את inoculum עם מרק tween מלוחים באמצעות nephelometer מכויל על מק 'פרלנד 0.5 צעדים 4.1 ו 4.2. זה חייב להסתיים תוך 30 דקות (לפי מפרט היצרן).
2. השתמש pipetter 200 μL ו אירוסול ארוך עמיד pipet קצה להסיר 100 μL של inoculum מ ^rd 1 / 3 העליון של צינור מלוחים tween חרוז. לחסן את התבשיל 7H9 מידלברוק. לאט לאט מערבולת מרק 7H9 מחוסן למשך 20 שניות.
3. הסר את צלחת microtiter AST מהחבילה של היצרן. אין להשתמש אם יבוש הוא כחול או אם חבילת נייר פגום.
4. הכן צינורית 1:50 דילול לשימוש מאוחר יותר בהכנת דילול 01:50 על ידי pipetting 50 μL של מים סטריליים לתוך צינור סטרילי.
5. בזהירות לצקת את המרק inoculum 7H9 לתוך שוקת. למניעת יצירת אירוסולים.
6. מניחים את צלחת microtiter AST עם התווית פונה אליך.
7. השתמש pipetter 12 ערוצים להוסיף 100 μL של inoculum אל היטב כל אחד.
8. הכן דילולים עבור מונה המושבה:
   1. דילול 1 / 1 מוכן משליטת חיובי היטב (H12) על ידי פסים 1 לולאה μl על הצלחת 7H10 שכותרתו "01/01".
   2. דילול 1 / 50 הוא הוכן על ידי inoculating לולאה 1 μl משליטת חיובי היטב (H12) ו מתערבל אותו לתוך הצינור עם 50 μl של צינור מים מוכן לעיל. 1 Streak μL של דילול זו הצלחת שכותרתו "1 / 50".
9. לחסן את הצלחות טוהר מן השוקת על ידי pipetting 50 μL על אגר דם שכותרתו הולם צלחת 7H10 ותגרום לבידוד.
10. מקוםחותם דבק על הצלחת microtiter AST. לחץ בחוזקה על כל היטב כדי להבטיח איטום הולם באמצעות גב לבן של החותם. הימנע קמטים.
11. לחטא את הצלחת microtiter ידי מנגב אותו עם מגבת נייר ספוגה בחומר חיטוי tuberculocidal ו microtiter צלחת מקום בתוך שקית פלסטיק עם קרוב חותם חום או קלטת.
    1. שקית הניילון משמשת מיכל המשני על מנת להבטיח כי כל מרק הוא הכיל לא אמורה להיות דליפה או לשפוך הצלחת העיקרית.

7. חיטוי של חומרים ארון בטיחות ביולוגית

1. כדי למנוע ייצור אירוסולים, למקום אחר שוקת על גבי השוקת מחוסן לפני הצבת אותו בעדינות לתוך המיכל וזורקים.
2. לחטא את כל החומרים כולל nephlometer, vortexer, צלחות, צינורות, וכו 'על ידי וניגבתי חיטוי tuberculocidal ולחכות את הזמן המתאים כדי להבטיח חיטוי על פי הוראות היצרן לפני הסרת מן BSC. לדוגמה, Prospray, חיטוי tuberculocidal אנו משתמשים, דורש 15 דקות כדי להרוג mycobacteria.
3. מניחים את מיכל להשליך בשקית Biohazard חותם ולפני מעוקר.

8. דגירה

1. צלחות צריך להיות מודגרות עם התקשורת למטה יש להיזהר כדי למנוע שפיכת כל נוזל או התזה.
2. דגירה את הצלחת microtiter AST צלחת, 7H10 ו צלחות אגר דם 35-37 מעלות צלזיוס עם חממה CO ₂ עם 5-10% 5-10% CO ₂ במעבדה BSL2.
   1. במעבדה שלנו, זה מקובל, כי הצלחת היטב אטום בתוך שקית ניילון סגורה.
3. לא יותר מ 2 צלחות microtiter AST צריך להערם בחממה על פי הוראות היצרן.

9. נציג תוצאות

פרשנות של תוצאות:

אטום AST צלחות microtiter ניתן לקרוא באופן ידני באמצעות מראה כעזר או עם קורא צלחת אוטומטי כגון Vizion (TREK באבחון). הצלחות ניתן לבחון בהקדם 7 ימים לאחר חיסון. בדוק את בקרת צמיחה בארות בעמדות H11 ו H12 כדי לקבוע אם הם חיובי (כלומר, יש הפקדה של תאים בתחתית הבאר). אם הפקד בארות צמיחה לא חיובית, reincubate את הצלחת לבחון מחדש מעת לעת (למשל, יום 10, יום 14) עד בקרת בארות הצמיחה הן חיוביות.

1. מירור נכתב:
   1. המקום אטום צלחת AST microtiter לבמה;
   2. לקריאה מלאה בארות צמיחה לאחר 7 ימים של דגירה, אם זה שלילי, reincubate צלחת AST microtiter;
   3. אם פקדי צמיחה מקובלים, ולאחר מכן קרא את התרופה המכילים בארות. עבור לכל תרופה, הרשומה דילול הראשונה אין צמיחה על ידי השוואת בארות התרופה עם שליטה הצמיחה.
   4. צמיחה מופיעה עכירות או הפקדה של תאים בתחתית באר.
2. כלי קריאה: בצע את ההוראות יצרני; את ההוראות להלן דוגמה לאופן הקריאה ייעשה עם פלטפורמת Vizion:
   1. כניסה פנימה
   2. השתמש "MYCOTB" תוכנה AST צלחת.
   3. מניחים צלחת עם ברקוד אטומה מול המשתמש. צמיחה מופיעה עכירות או הפקדה של תאים בתחתית באר.
   4. קראו שולטת צמיחה, אם זה שלילי, reincubate צלחת AST microtiter, אם חיובי לקרוא את הצלחת על ידי נגיעה במסך עם טוב הראשון של כל תרופה שאינה להראות צמיחה.

קראו צלחות טוהר. צלחת אגר דם לא צריך להראות צמיחה לאחר 48 שעות את הצלחת טוהר 7H10 צריך צמיחה ומחוברות סוג של אורגניזם אחד. אם מזוהמים, המבחן microtiter AST צריך להיות חזר מתרבות טהור.

חישוב ספירת המושבה משליטת חיובי גם באמצעות הטבלה שלהלן:

הרוזן המושבה מפתח

מושבות # מנה על צלחת שכותרתו "01/01"	מושבות # מנה על צלחת שכותרתו "1 / 50"	Inoculum הרוזן המושבה (CFU / mL)
<50	0	<5 X 10 4
50-100	0-2	5 X אוקטובר 04-01 X 10 5
> 100	≤ 10	1 X אוקטובר 05-05 X 10 5
> 100	> 10	> 5 X 10 5

אולי יש נגרר עם חומצה פארה-aminosalicylic כמה זנים של Mycobacterium tuberculoאחותי. זה יכול להתפרש על ידי הסתכלות כל הבארות, כי יש כדוריות ושימוש הבאר הראשונה כי יש גלולה בגודל זהה דילול הבאה כנקודת סיום. ההתנגדות היא נדירה עם התרופה הזו.

באיור 1. נציג התוצאות באמצעות צלחת MYCOTB.

תרופות קיצור	תרופה	MIC μ / mL
OFL	ofloxacin	16
Mxf	moxifloxacin	8
RIF	rifampin	> 16
עמי	amikacin	0.5
STR	סטרפטומיצין	16
RFB	rifabutin	8
PAS	p-aminosalicylic חומצה	≤ 0.5
ETH	ethionamide	5
Cyc	cycloserine	4
INH	isoniazid	2
קן	kanamycin	1.2
EMB	ethambutol	4.0

Discussion

דוגמה צלחת microtiter AST אשר שולטת צמיחה חיובית מוצג באיור 1 ו MIC נקודת קצה (מיקרוגרם / מ"ל) עבור כל תרופה היא הקיפה. מחקר שנערך במעבדה שלנו ציינו כי שיטת צלחת AST microtiter שווה את השיטה אגר תקן הזהב שיעור לבדיקות הרגישות של שחפת Mycobacterium. דיווח מהיר יותר של תוצאות הושג עם צלחת microtiter microtiter AST לעומת השיטה המסורתית פרופורציה אגר עם הפרשנות הסופית צלחת microtiter AST ו - פרופורציה שיטה אגר ב 14 ו 21 ימים, respectively.The צלחת AST microtiter יש את היתרון של הבדיקה הראשונה קו תרופות second בו זמנית אשר יכול לעזור למנוע עיכובים מופרזת עם זנים עמידים. צלחת microtiter AST הוא גם הרבה יותר קל להגדיר מאשר לקרוא APM ושניהם מראה ידנית ומערכת חצי אוטומטי כגון VIZION ניתן להשתמש כדי לקרוא את הצלחות. הזמינות של ערך MIC עבור בדיקות סמים TB התנגדות עשוי לספק מידע חדש בעל ערך לרופאים יחסית לערך ריכוז המסורתית קריטי, במיוחד עבור אלה מבודד עם רגישות "גבולי".

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AST microtiter plates and adhesive seal	TREK Diagnostics, Thermo Scientific	MYCOTB
McFarland 0.5 standard	TREK Diagnostics, Thermo Scientific	E1041
Middlebrook 7H10 plates	Fisher Scientific
Blood Agar Plates	Fisher Scientific
Sterile loops 1 μL	Fisher Scientific
Sterile loops 10 μL	Fisher Scientific
Sensititre Saline-Tween glass bead broth	TREK Diagnostics, Thermo Scientific	27143
7H9 OADC Broth	TREK Diagnostics, Thermo Scientific	T3440
Long Pipet Tips	Fisher Scientific
Sterile Troughs	TREK Diagnostics, Thermo Scientific
M. tuberculosis	ATCC	27294
Pipeters: 1000, 200, 20μL	Fisher Scientific
Tips 1000, 20, 20 μL	Fisher Scientific
Multichannel Pipetter	Fisher Scientific
Incubator 5-10% CO2	Fisher Scientific
Plastic bags, small, CO2 permeable	Poly Plastic Products
TB disinfectant (Such as ProSpray C-60)	Certol International, Commerce City, CO	PSC60/32
Mirror Box Reader	Fisher Scientific