Summary
结核分枝杆菌药敏试验是具有挑战性的，但对病人的护理至关重要。这微孔板格式提供12种antimycobacterial药物进行测试，并提供最低抑菌浓度（MIC）值，这将有助于在适当的治疗。
Abstract
在努力控制耐药结核分枝杆菌（MTB）的增加是重要的抗生素耐药性的快速检测。药敏试验的MTB（AST），传统上一直由琼脂比例法或macrobroth测试仪器，如BACTEC（Becton Dickinson公司，火花，MD），VersaTREK（郊游诊断，美国俄亥俄州克里夫兰市）或BACT /警报（生物梅里埃，黑兹尔伍德，MO）。琼脂比例法，同时考虑“黄金”助攻的标准，是劳动密集型和要求执行含药琼脂菌落计数相比，无毒琼脂阻力计算。如果有≥1％的含药培养基上的增长相比，无毒介质，机体被认为是这种药物的抗药性。 macrobroth方法需要的仪器和测试突破点（“批判”）的第一线药物的药物浓度（异烟肼，乙胺丁醇，利福平和吡嗪酰胺）。这里介绍的方法是在96孔微孔板格式市售[MYCOTB（郊游诊断）]，并包含12抗菌剂，用于治疗结核病的浓度的增加，包括第一（异烟肼，利福平，乙胺丁醇）和二线药物（丁胺卡那霉素， ethionamide，环丝氨酸，卡那霉素，莫西沙星，氧氟沙星，段 - 氨基水杨酸，利福布丁和链霉素）。吡嗪酰胺，第一线药物，不包括在微孔板由于其酸性测试条件的需要。酶标系统的优点包括缓解设置和更快的转身时间（14天）相比，与传统的琼脂比例（21天）。此外，该板块可以从准备使用或者肉汤或固体培养基接种成立。由于微孔板格式是新的，因为结核杆菌呈现独特的安全挑战，在实验室中，这个协议将介绍如何安全地设置，培育和阅读微孔板。
Protocol
每个实验室都需要执行，其机构的生物安全主任的合作的风险评估，以确定相应的生物安全水平的接种准备和移液的接种入盘。在我们的实验室，我们利用生物安全3级实验室（BSL3）的做法，直到微孔板接种，并用塑料的粘接密封密封。这些板块，然后放在一个塑料袋，这是热也密封。在一个生物安全2级实验室（BSL2）进行孵化和解释微孔板读数。
1。材料的标签
- 标签的血琼脂平板上，三个Middlebrook 7H10板，Middlebrook 7H9肉汤，一个盐水之间的玻璃珠管和AST与相应的标识符（例如，病人姓名，病历号）的BSL2一个酶标板。
- 标签在血琼脂和7H10镀金的“纯度检查”。定期接种菌落计数的建议，以确保生物体的适当集中是在测试中使用。执行时的菌落计数将需要有两个“1 / 1菌落计数”和“1 / 50菌落计数”标记7H10板。
2。技师的准备工作进入了BSL3
- 适当的个人防护设备是必要的工作在BSL3的，包括前坚实的礼服，头盖，手套，鞋套和口罩。每个机构都应该建立在自己的呼吸保护计划与工业卫生机构的主任。在我们的实验室，我们有几个呼吸器，包括动力的空气净化呼吸器（PAPRs）和装有HEPA过滤，N95半面呼吸器。
3。制备的生物安全柜
- 在BSL3，准备通过生物安全柜（BSC）的表面进行消毒，并把一纸毛巾浸泡消毒剂约6英寸风口面板。
- 放置在左侧的垃圾容器，并在右侧的小nephlometer vortexer。
- 接种循环，pipetors和技巧都放在旁边的纸巾。
- 将与有机体（肉汤或固体培养基上）和麦克法兰0.5标准纸巾的架子。
4。校准的浊度
- 生理盐水之间的玻璃珠管放置在浊度和仪器设置为零，使用生理盐水之间的空白。
- 广场麦克法兰0.5标准，在浊度和校准根据制造商的指示。
5。接种物的制备
- 工作中的BSC，从固体培养基上刮去使用适当标记的生理盐水之间的玻璃珠管无菌循环，直到获得一个≥0.5麦克法兰标准菌落。
- 目视检查样品，并麦克法兰标准进行比较。
- 涡样品为30-60秒。
- 允许在接种15分钟定居（设置一个计时器，）。
6。微孔板接种
- 调整用生理盐水之间使用校准步骤4.1和4.2麦克法兰0.5浊度肉汤接种。这必须完成在30分钟内（每生产厂家的规格）。
- 使用200μLpipetter和一个LONG气溶胶耐吸管尖删除生理盐水珠之间的管前1 / 3 路 100μL接种。接种Middlebrook 7H9肉汤。慢慢涡接种20秒7H9肉汤。
- 从制造商的包中取出的AST微孔板。不要使用如果干燥剂是蓝色或铝箔包损坏。
- 准备使用1:50稀释管编制的1:50稀释后吹打成无菌管50μL无菌水。
- 小心倒入一个低谷7H9肉汤接种。避免产生气溶胶。
- 与标签朝上放置AST微孔板。
- 使用12通道pipetter，每孔加100μL接种。
- 准备菌落计数稀释：
- 1 / 1稀释准备裸奔1μL环上标有“1 / 2”7H10板以及阳性对照（H12）。
- 1 / 50稀释的准备以及阳性对照（H12）接种1μL循环和漩入管50μL准备以上的水管。此稀释液连续板标有“1 / 50”。
- 接种纯度板从低谷到一个适当标记的血琼脂和7H10板和隔离连胜吹打50微升。
- 地点AST微孔板上的粘接密封。按牢牢掌握每口井，以保证足够的密封使用的密封的白回来。避免折痕。
- 微孔板与tuberculocidal消毒剂和一个塑料袋，并关闭到位微孔板与热封或磁带浸湿的纸巾擦拭消毒。
- 作为一个辅助容器的塑料袋供应，以确保所有的肉汤中应该有泄漏或溢出的主要板块的。
7。材料和生物安全柜消毒
- 为了避免产生气溶胶之前，将它轻轻放入丢弃的容器接种槽上方的另一个低谷。
- 与tuberculocidal消毒剂擦拭消毒所有包括nephlometer，vortexer，板，管等材料，并等待适当的时机，根据制造商的指示，以确保消毒，然后删除从BSC。例如，Prospray，使用的tuberculocidal消毒剂，我们需要15分钟，杀灭分枝杆菌。
- 将丢弃在生物危害袋和密封容器前高压灭菌。
8。孵化
- 板与媒体应培养下，应小心，以避免任何液体溢出或溅水。
- 在一个35-37 ° C培养箱中孵育5-10％5-10％CO 2在BSL2实验室CO 2的AST微孔板板，7H10和血琼脂平板。
- 在我们的实验室，这是可以接受的，因为该板块良好的密封在一个密封的塑料袋。
- 不超过2的酶标助攻板应堆放在孵化器中，根据制造商的指示。
9。代表性的成果
结果的解释：密封助攻微孔板可以读取使用手动镜作为一种辅助手段，或用自动酶标仪Vizion（郊游诊断）等。该板可尽快接种后7天的检查。检查位置H11和H12的生长控制井，以确定如果他们是积极的（例如，有一个细胞在井底的存款）。如果不积极的增长控制井，reincubate板，并定期重新审视（例如，第10天，14天），直到增长的控制井是积极的。
- 镜像读取：
- 密封放置到平台AST微孔板;
- 阅读增长的控制井7天的潜伏期后，如果这是消极的，reincubate助攻微孔板;
- 如果增长的控制是可以接受的的，然后读取含药井。对于每种药物，记录第一稀释与生长控制药物井没有增长。
- 增长出现浑浊或细胞在井底的存款。
- 仪器阅读：按照制造商的说明，下面的说明是如何将Vizion平台阅读的例子：
- 登录。
- 使用“MYCOTB”AST板软件。
- 将面向用户的条形码密封板。增长出现浑浊或细胞在井底的存款。
- 生长控制;如果这是消极的，reincubate助攻微孔板，如果是正读板，通过触摸屏幕上的每一种药物，这并不表明增长的第一口井。
阅读纯度板。血琼脂平板上应显示在48小时后没有增长，7H10纯度板应该有一个生物类型的融合发展。如果被污染，AST的酶标测试需要从一个纯粹的文化重复。
计算菌落计数，从积极的控制以及使用下表：
菌落计数键
| 算的上标有“1 / 1＃殖民地”板块 | ＃殖民地算的上标有“1 / 50”板 | 接种菌落数（CFU / ml为） |
| <50 | 0 | <5 × 10 4 |
| 50-100 | 0-2 | 5 × 10 4 1 × 10 5 |
| > 100 | ≤10 | 1 × 10 5至5 × 10 5 |
| > 100 | > 10 | > 5 × 10 5 |
有可能是尾随段-氨基水杨酸在结核分枝杆菌tuberculo的某些菌株SIS。这可以解释，在所有的水井，有颗粒和使用的第一口井，旁边的终点稀释同样大小的颗粒。抵抗这种药物是罕见的。
图1。代表性的结果，使用MYCOTB板 。
| 药品缩写 | 药物 | MICμ/毫升 |
| OFL | 氧氟沙星 | 16 |
| MXF | 莫西沙星 | 8 |
| RIF | 利福平 | > 16 |
| 急性心肌梗死 | 丁胺卡那霉素 | 0.5 |
| STR | 链霉素 | 16 |
| RFB | 利福布丁 | 8 |
| 保安局首席助理局长 | P -氨基水杨酸 | ≤0.5 |
| 理工学院 | ethionamide | 5 |
| 公益少年团 | 环丝氨酸 | 4 |
| 异烟肼 | 异烟肼 | 2 |
| 简 | 卡那霉素 | 1.2 |
| 教统局 | 乙胺丁醇 | 4.0 |
Discussion
有正增长，控制一个AST微孔板的一个例子是如图1所示，每种药物端点MIC（μg/ ml的）盘旋。在我们的实验室进行的一项研究表明，AST的微孔板方法相当于金标准琼脂比例法药敏检测结核分枝杆菌 。酶标AST微孔板获得更快的结果的报告，分别助攻微孔板相比，传统的琼脂比例法与AST微孔板和琼脂比例法，在14和21天的最终解释权时，测试第一的优势二线药物，同时它可以帮助防止耐药菌株的过度拖延。 AST微孔板也容易得多比APM成立，并宣读和手动镜和半自动化系统，如VIZION，可以用来读取的板块。为结核病耐药性测试的MIC值的可用性可能提供有价值的新信息，医生相对于传统的临界浓度值，尤其是对那些与“边缘”的易感性株。
Disclosures
有没有透露。
Acknowledgments
我们要感谢他们的帮助梅奥诊所的分枝杆菌实验室的化验师在研究过程中。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AST microtiter plates and adhesive seal | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | MYCOTB | |
| McFarland 0.5 standard | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | E1041 | |
| Middlebrook 7H10 plates | Fisher Scientific | ||
| Blood Agar Plates | Fisher Scientific | ||
| Sterile loops 1 μL | Fisher Scientific | ||
| Sterile loops 10 μL | Fisher Scientific | ||
| Sensititre Saline-Tween glass bead broth | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | 27143 | |
| 7H9 OADC Broth | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | T3440 | |
| Long Pipet Tips | Fisher Scientific | ||
| Sterile Troughs | TREK Diagnostics, Thermo Scientific | ||
| M. tuberculosis | ATCC | 27294 | |
| Pipeters: 1000, 200, 20μL | Fisher Scientific | ||
| Tips 1000, 20, 20 μL | Fisher Scientific | ||
| Multichannel Pipetter | Fisher Scientific | ||
| Incubator 5-10% CO2 | Fisher Scientific | ||
| Plastic bags, small, CO2 permeable | Poly Plastic Products | ||
| TB disinfectant (Such as ProSpray C-60) | Certol International, Commerce City, CO | PSC60/32 | |
| Mirror Box Reader | Fisher Scientific |
References
- Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., Parrish, N. Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs. Presented at 50th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010 Sept. 12, Boston, MA, , Abstract 2450 (2010).
- HHS Publication No. (CDC) 21-112: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). U.S. Department of Health and Human Services Centers for Disease and Preventions. , 5th Edition, National Institutes of Health. (2009).
- Morcillo, N., Imperiale, B., Digiulio, B. Evaluation of MGIT 960 and the colorimetric-based method for tuberculosis drug susceptibility testing. Int J Tuberc Lung Dis. 14, 1169-1175 (2010).
- Bemer, P., Bodmer, T., Munzinger, J., Perrin, M., Vincent, V., Drugeon, H. Multicenter Evaluation of the MB/BACT System for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 42, 1030-1034 (2004).
- SENSITITRE MYCOTB Susceptibility Plate: For Mycobacterium Susceptibility Testing. Product Insert. , TREK Diagnostic Systems. Cleveland, OH. (2010).
- CLSI. Susceptiblity Testing of Mycobacteria, Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard. Document M24-A. , CLSI. Wayne, Pennsylvania. (2003).
- Sullivan, N., Sotos, J., Anhalt, K., Allen, S. Preliminary results from a new TREK Sensititre Mycobacterium tuberculosis MIC plate (MYCOTB). C-151 presented at 110th American Society for Microbiology, Annual Meeting, San Diego, CA, , Abstract C-151 (2010).
- VersaTREK MYCO SUSCEPTIBLITY KIT. Product insert. , TREK Diagnostic Systems. Cleveland, OH. 7115-7160 (2008).
- Parrish, N. M., Carroll, K. C. The Role of the Clinical Mycobacteriology Laboratory in the Diagnosis and Management of Tuberculosis in Low Prevalance Settings. J Clin Microbiol. , Forthcoming (2010).
- Kam, K. M., Sloutsky, A., Yip, C. W., Bulled, N., Zingol, M., Espinal, M., Kim, S. J. Determination of critical concentrations of second-line anti-tuberculosis drugs with clinical and microbiological relevance. Int J Tubercl Lung Dis. 14, 282-288 (2010).
- Woods, G. L., Warren, N. G., Inderlied, C. B. Susceptibility Test Methods: Mycobacteria, Nocardia, and Other Actinomycetes. Manual of Clinical Microbiology. Murray, P. R., Barron, E. J., Jorgensen, J. H., Landry, M. L., Pfaller, M. A. , 9th Ed, ASM Press. Washington DC. 1223-1247 (2007).
- Bergmann, J. S., Woods, G. L. Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs. J Clin Microbiol. 36, 2940-2943 (1998).
